胡勇，紀(jì)德銘，詹騫，陳克金，彭焱，周雁翔，岳勝蘭，李娟，周志軍

國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司，湖北武漢430207

纖維蛋白溶酶原（plasminogen，Pg）為一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生后分泌進(jìn)入血漿的蛋白質(zhì)。人體內(nèi)Pg水平較低或結(jié)構(gòu)異常通常會(huì)造成纖維蛋白溶酶原含量不足或功能異常，引起Pg缺乏癥［1-4］。Ⅰ型Pg缺乏癥嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并可能危及生命，患者需長(zhǎng)期周期性注射Pg清除木質(zhì)化病變緩解病癥［5］。2000年，Grifols公司以Cohn FⅡ+Ⅲ沉淀為原料純化Pg結(jié)合低溫乙醇和沉淀獲得98%純度產(chǎn)品［6］。2006年，Kedrion公司采用親和層析從血漿中純化Pg［7］。國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司（簡(jiǎn)稱武漢血制）應(yīng)用行層析法制備Pg的工藝研究，其中蛋白含量檢測(cè)是生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，通過(guò)Pg抗原含量與總蛋白含量之比可計(jì)算相對(duì)純度，通過(guò)Pg效價(jià)與總蛋白含量之比可計(jì)算比活性。

《中國(guó)藥典》三部（2015版）收錄了6種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法：凱氏定氮法、Lorry法、雙縮脲法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)法（Brandford法）及紫外-可見(jiàn)光光度法［8］。其中凱氏定氮法使用較多，但其操作時(shí)間較長(zhǎng)，且多用于成品檢定，不能滿足生產(chǎn)過(guò)程中樣品的快速檢測(cè)需要；BCA法為雙縮脲法的改良方法，較Lowry法快4倍，重復(fù)性優(yōu)于考馬斯亮藍(lán)法，干擾物質(zhì)主要有硫酸銨、Tris緩沖液及某些氨基酸等。PierceTMBCA蛋白檢測(cè)試劑盒是一種基于二喹啉甲酸（BCA）利用比色法測(cè)定總蛋白濃度的蛋白定量試劑盒，其操作步驟簡(jiǎn)單方便，靈敏度高，不受樣品中絕大部分去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，線性關(guān)系良好［9］。

Pg在工藝摸索階段需快速準(zhǔn)確檢測(cè)蛋白含量，為工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持，考慮Pg純化工藝中使用去污劑、有機(jī)溶劑及某些氨基酸，又因BCA法在檢測(cè)凝血因子Ⅷ蛋白含量已有經(jīng)驗(yàn)［10］，因此采用BCA法檢測(cè)Pg純化工藝中樣品的蛋白含量。本工藝過(guò)程的緩沖液中涉及多種特殊成分，需對(duì)其干擾性進(jìn)行分析；在無(wú)Pg濃縮物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，本實(shí)驗(yàn)用牛血清白蛋白（BSA）作為內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)改良后的BCA方法進(jìn)行驗(yàn)證，并與凱氏定氮法及雙縮脲法進(jìn)行比較，以期該方法能適用于Pg純化過(guò)程樣品（中間品、原液、半成品及成品）的蛋白含量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品201903003批Pg工藝樣品含純化工藝中間樣品［包括Q離子交換層析的上樣液及洗脫液；親和層析的上樣液及洗脫液19003-6；離子交換SP層析的上樣液及洗脫液19003-14；原液19003-18（不含氨基酸）及半成品19003-19-6（含蔗糖+甘氨酸）］、含特殊組分的純化緩沖液［包括親和層析洗脫緩沖液P250［含6-氨基己酸（EACA）、親和層析洗滌緩沖液P258（含辛酸鈉）、超濾緩沖液1-P555（含蔗糖及甘氨酸）及1%有機(jī)溶劑／去污劑（S／D，含1%Tween80+0.3%磷酸三丁酯）］及2019-02001批Pg超濾緩沖液2-P638（含鹽酸精氨酸）、Pg半成品19001-18（含鹽酸精氨酸）、201811003批Pg過(guò)程樣品18003-14（SP層析洗脫液）、201903002批Pg原液19002-18（不含氨基酸）均由武漢血制提供；BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（21.8 mg／支），使用前由武漢血制質(zhì)量控制室稀釋至10 000μg／mL。

1.2 主要試劑及儀器PierceTMBCA蛋白檢測(cè)試劑盒［含試劑A（批號(hào)：MF157262）、試劑B（批號(hào)：MF16-601）及BSA標(biāo)準(zhǔn)品（濃度：2 000μg／mL，批號(hào)：MD157596）］及酶標(biāo)儀Spectromax Plus384均購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 BCA方法的改良

結(jié)合PierceTMBCA蛋白檢測(cè)試劑盒的試管法與微孔板法，即樣品50μL加950μL工作液（試劑A∶試劑B=50∶1）在1.5 mL EP管中反應(yīng)，37℃水浴箱內(nèi)孵育30 min（試管法）；取出EP管，將混合物加入微孔板中，200μL／孔，每孔進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，在波長(zhǎng)562 nm處讀取吸光度值（微孔板法）。

1.3.1 樣品準(zhǔn)備 將冷凍保存的血漿蛋白或組分樣品解凍，用生理鹽水稀釋至0.1～2 mg／mL，確保樣品的終蛋白濃度在線性范圍內(nèi)。如樣品中的基礎(chǔ)液對(duì)BCA有干擾，需將樣品稀釋至不產(chǎn)生干擾的最高濃度以下。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 用生理鹽水精確稀釋試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行2倍系列稀釋，分別配制為2 000、1 000、500、250、125、62.5及31.25μg／mL 7個(gè)稀釋度（編號(hào)分別為St00～St06），以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.3.3 質(zhì)控品的配制 用0.9%氯化鈉溶液精確稀釋試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品為1 500、750、150、62.5μg／mL，分別作為高、中、低及檢測(cè)下限濃度質(zhì)控品。

1.3.4 BCA工作液的配制 將試劑A與試劑B按50∶1混勻?yàn)榍宄和该鞯G色液體，即為工作液，按下式計(jì)算其總體積。

1.3.5 檢測(cè)步驟 在每個(gè)EP管中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、空白對(duì)照及待測(cè)樣品，50μL／管，每個(gè)EP管再分別加入950μL BCA工作液，充分混勻，密封，置37℃水浴箱內(nèi)孵育30 min。在酶標(biāo)儀上的BCA模板中輸入樣品分布圖。取出稀釋管，按分布圖將混合物加入酶標(biāo)板中，200μL／管，于波長(zhǎng)562 nm處讀取吸光度值。

1.3.6 結(jié)果計(jì)算BCA蛋白檢測(cè)試劑盒默認(rèn)用一次方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)待測(cè)樣品蛋白含量的均值和CV。必要時(shí)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提供的蛋白變換系數(shù)進(jìn)行校正。

1.3.7 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 試劑盒BCA標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度的回算值及質(zhì)控品的實(shí)測(cè)值應(yīng)在理論值的±10%之間。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2應(yīng)≥0.990，若R2＜0.990，檢查標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度的A562，若3個(gè)測(cè)試結(jié)果中含有異常值，此3個(gè)測(cè)試值需進(jìn)行Q檢驗(yàn)，若在90%的可信區(qū)間范圍內(nèi)，Q檢驗(yàn)值＞0.94，則該值可視為異常值剔除，余下的2個(gè)測(cè)試值取均值用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算。當(dāng)被測(cè)樣品蛋白含量＜100μg／mL時(shí)，需采用微量法模式，修正標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析樣品蛋白濃度。

1.4 方法的確定

1.4.1 擬合曲線及線性范圍的確定 將試劑盒附帶BCA標(biāo)準(zhǔn)品按1.3.2項(xiàng)配制7個(gè)稀釋度，反應(yīng)完成后將蛋白含量的結(jié)果分別進(jìn)行一次方程及二次方程線性擬合，再將每個(gè)稀釋度A562的均值代入各自的擬合方程獲得對(duì)應(yīng)稀釋品的回算值，計(jì)算各稀釋度的蛋白回收率、各稀釋度A562的CV、曲線的相關(guān)系數(shù)R2，確定線性范圍及擬合方式。接受標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線各稀釋度A562的CV≤10.0%；標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.99，高、中、低濃度質(zhì)控品的蛋白回收率為理論值的90%～110%，檢測(cè)下限質(zhì)控品的蛋白回收率為理論值的85%～115%。按下式計(jì)算蛋白回收率。

1.4.2 內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品的確定 將BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用0.85%生理鹽水稀釋為2 000μg／mL，與試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)按1.3.2項(xiàng)分別制備6個(gè)稀釋度（編號(hào)分別為GB01～GB06和Kit01～Kit06）。反應(yīng)完成后，以BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的A562與理論值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，將試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品所有稀釋度的A562代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同稀釋度的實(shí)測(cè)值乘以稀釋倍數(shù)的均值即為試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定值；以試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品的A562與理論值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，將BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的所有稀釋度的A562代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同稀釋度的實(shí)測(cè)值乘以稀釋倍數(shù)的均值即為BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定值；計(jì)算各不同稀釋度的標(biāo)定值的CV及回收率，確定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品。接受標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)定值為理論值的95%～105%。

1.4.3 平行性

1.4.3.1 樣品稀釋201903003批Pg純化工藝中親和層析洗脫液19003-6、離子交換SP層析洗脫液19003-14及半成品19003-19-6均為含Pg的組分。根據(jù)前期多次試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，Pg親和層析洗脫液蛋白含量約2 000μg／mL，離子交換SP層析洗脫液及半成品蛋白含量約7 000μg／mL，將親和層析洗脫液進(jìn)行2、4及8倍稀釋，離子交換SP層析洗脫液及半成品進(jìn)行4、8及16倍稀釋，使其蛋白含量（約250～2 000μg／mL）均在線性范圍內(nèi)。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 將內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品按1、2、4、8、16及32倍稀釋6個(gè)濃度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品按5、10、20、40、80及160倍稀釋6個(gè)濃度，使其蛋白含量在線性范圍內(nèi)。

1.4.3.3 檢測(cè)及結(jié)果分析 按改良BCA法進(jìn)行檢測(cè)，以內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線分別檢測(cè)BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、親和層析洗脫液19003-6、離子交換SP層析洗脫液19003-14及半成品19003-19-6，將5組樣品的A562與稀釋倍數(shù)用Softmax 5.2軟件進(jìn)行雙對(duì)數(shù)擬合，獲得曲線1（內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品）、2（離子交換SP層析洗脫液19003-14）、3（半成品19003-19-6）、4（親和層析洗脫液19003-6）及6（BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品）。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上不同稀釋度的斜率（B值）變化，計(jì)算不同曲線B值之間的CV。取5條曲線的CV小于5%時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍，以此作為檢測(cè)樣品稀釋的最適范圍。接受標(biāo)準(zhǔn)：各樣品擬合曲線的R2絕對(duì)值＞0.98；各曲線B值的CV≤5%。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 準(zhǔn)確性及精密性 將BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用0.85%生理鹽水稀釋為2 000μg／mL，與高、中、低及檢測(cè)下限質(zhì)控品由不同人員于不同時(shí)間按改良BCA方法分別各檢測(cè)3批，連續(xù)檢測(cè)3次。計(jì)算樣品蛋白含量的CV及回收率。準(zhǔn)確性接受標(biāo)準(zhǔn)：蛋白回收率在85%～115%之間；精密性接受標(biāo)準(zhǔn)：批內(nèi)及批間蛋白含量的CV均≤10%。

1.5.2 選擇性201903003批含有特殊組分的Pg純化緩沖液及201902001批Pg超濾緩沖液2-P638中按10∶1分別加入內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品（終濃度為200μg／mL），采用改良BCA法進(jìn)行檢測(cè)，判斷特殊組分對(duì)檢測(cè)是否有影響。若有影響，則繼續(xù)按10∶1加入內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品，確定其不干擾試驗(yàn)的濃度。接受標(biāo)準(zhǔn)：各混合液的蛋白回收率在內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品理論值的90%～110%之間。

1.6 改良BCA法與凱氏定氮法及雙縮脲法檢測(cè)的比較 將不同配方的Pg過(guò)程樣品18003-14（離子交換SP洗脫液）、原液19003-18（不含氨基酸）、半成品19003-19-6（含蔗糖+甘氨酸）、半成品19001-18（含鹽酸精氨酸）、原液19002-18（不含氨基酸）分別送武漢血制QC及成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱蓉生公司）QC進(jìn)行雙縮脲法（分別采用BSA和人血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品）及凱氏定氮法進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)。比較3種方法檢測(cè)結(jié)果的符合性。

1.7 方法的應(yīng)用 采用改良的BCA法對(duì)201903003小試工藝樣品（從原料血漿至經(jīng)純化獲得半成品）進(jìn)行全流程質(zhì)量監(jiān)控，檢測(cè)Pg所在組分的效價(jià)、抗原含量及蛋白含量，計(jì)算比活性（效價(jià)／蛋白含量）及相對(duì)純度（抗原含量占蛋白含量的百分比），判斷該工藝制備的原液及半成品是否符合武漢血制Pg的質(zhì)量規(guī)程要求（比活性大于4.0 U／mg）。

2 結(jié)果

2.1 方法的確定

2.1.1 擬合曲線及線性范圍BSA標(biāo)準(zhǔn)品曲線按一次函數(shù)進(jìn)行線性擬合，其線性范圍在125～2 000μg／mL，線性方程為Y=0.041+0.007 86X，R2為0.997；按二次函數(shù)進(jìn)行線性擬合，其線性范圍在62.5～2 000μg／mL，線性方程為Y=0.014 3+0.000933X-7.36×10-8X2，R2為0.999。見(jiàn)表1。選擇二次函數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適擬合。

2.1.2 內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品的確定 結(jié)果顯示，BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量為2 090μg／mL，回收率為其標(biāo)示值的104.48%；試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量為9 666μg／mL，回收率為其標(biāo)示值的96.66%；二者均符合接受標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表2?？紤]成本，選擇試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)品為后續(xù)試驗(yàn)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品。

2.1.3 平行性 選取內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度在250～2 000μg／mL之間的4個(gè)濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)曲線擬合時(shí)，與其他4條曲線（3個(gè)稀釋度）間B值CV相對(duì)最小為3.524%，5條擬合曲線的R2均＞0.98，見(jiàn)圖1。表明蛋白濃度在此區(qū)間內(nèi)時(shí)，BSA標(biāo)準(zhǔn)品的曲線與Pg濃縮物所在的工藝樣品的曲線的平行性最好，結(jié)果準(zhǔn)確性最高。

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 準(zhǔn)確性及精密性3批各濃度質(zhì)控品及BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白回收率在88.61%～103.78%之間，準(zhǔn)確性良好；批內(nèi)及批間的蛋白含量的CV在0.3%～9.35%，精密性良好。見(jiàn)表3和表4。

表1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品7個(gè)稀釋度一次及二次方程擬合處理標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)結(jié)果Tab.1 Results of linear equation and quadratic equation fitting to process standard curve data on standard BSA

圖1 Softmax軟件對(duì)5組樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的平行性分析Fig.1 Parallel analysis of detection data of five groups of samples by Softmax software

2.2.2 選擇性 結(jié)果顯示，1～500 mmol／L EACA、2～20 g／L蔗糖、0.5～5 g／L甘氨酸、0.3%～3%鹽酸精氨酸及150 mmol／L辛酸鈉的檢測(cè)結(jié)果均為負(fù)值，添加內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品后回收率在95%～105%之間，表明這些濃度的特殊組分對(duì)檢測(cè)無(wú)影響；1%S／D稀釋40倍的檢測(cè)值與檢測(cè)下限62.5μg／mL的檢測(cè)值相近，該濃度添加標(biāo)準(zhǔn)品的混合物的檢測(cè)回收率符合接受標(biāo)準(zhǔn)（90%～110%），但此樣品濃度稀釋40倍后小于檢測(cè)下限，因此實(shí)際操作中仍以20倍稀釋，計(jì)算結(jié)果除以20作為實(shí)測(cè)值。見(jiàn)表5。

2.3 改良BCA法與凱氏定氮及雙縮脲法檢測(cè)結(jié)果的比較 采用改良BCA法檢測(cè)結(jié)果與武漢血制、蓉生公司所用的雙縮脲法（不同標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果稍有差異）及凱氏定氮法結(jié)果符合性良好，配方中的氨基酸對(duì)BCA檢測(cè)無(wú)影響，見(jiàn)表6。表明該方法既可用于純化過(guò)程樣品的檢測(cè)，也可用于原液、半成品的檢測(cè)。

2.4 方法的應(yīng)用 對(duì)201903003批工藝過(guò)程樣品的比活性和相對(duì)純度的計(jì)算結(jié)果顯示，本Pg純化工藝可獲得比活性＞8 U／mg的Pg半成品，符合工藝擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求；Pg原液的相對(duì)純度達(dá)81.94%。見(jiàn)表7。

表2 BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品與試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的互標(biāo)結(jié)果Tab.2 Results of mutual standardization between national standard and kit standard

表3 批內(nèi)精密度及準(zhǔn)確度驗(yàn)證的結(jié)果（n=3）Tab.3 Validation for precision and accuracy in intra-assay（n=3）

表4 批間精密度驗(yàn)證結(jié)果（n=3）Tab.4 Validation for precision in inter-assay（n=3）

表5 特殊組分對(duì)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品的干擾試驗(yàn)Tab.5 Results of addition test of different concentrations of special components and corresponding standards

表6 改良BCA法與凱氏定氮法及雙縮脲法檢測(cè)Pg工藝全過(guò)程的蛋白含量（mg／mL）Tab.6 Comparison of determination results of protein content in samples taken from whole process by modified BCA method，Kjeldahl method and biuret method（mg／mL）

表7 201903003批工藝全過(guò)程樣品的比活性及相對(duì)純度Tab.7 Specific activity and relative purity of whole process sample of Lot 201903003

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將BCA蛋白檢測(cè)試劑盒的雙縮脲反應(yīng)與顯色反應(yīng)結(jié)合在一起：前者為在堿性介質(zhì)中，蛋白將Cu2+還原為Cu+；后者為使用含有BCA的獨(dú)特試劑，利用比色法檢測(cè)Cu2+，2分子的BCA與1分子的Cu2+形成紫色絡(luò)合物，該水溶性復(fù)合物在波長(zhǎng)562 nm處有很強(qiáng)的吸光度值，該吸光度值與蛋白濃度在20～2 000μg／mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，具有高靈敏度及高選擇性的特點(diǎn)［4］。

該試劑盒推薦試管法和微孔板法兩種檢測(cè)方案，二者均采用線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，試管法檢測(cè)樣品的敏感度高于微孔板法，但測(cè)定時(shí)需逐個(gè)操作，耗時(shí)繁瑣；微孔板法與酶標(biāo)儀配合使用，讀數(shù)快速方便，且應(yīng)用配套軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在樣品數(shù)量多時(shí)更有優(yōu)勢(shì)，但在克服干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響方面靈活度低，且檢測(cè)濃度較低的樣品不如試管法靈敏。為滿足研發(fā)階段的樣品數(shù)量多，且敏感度要高的要求，本實(shí)驗(yàn)采用試管法中樣品與工作液的混合比例為1∶20，于37℃孵育30 min，再用酶標(biāo)板法的讀數(shù)方式與軟件處理模式（曲線擬合算法）相結(jié)合來(lái)進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。在實(shí)際操作中，對(duì)數(shù)據(jù)的擬合方式進(jìn)行了優(yōu)化，選擇二次函數(shù)的最適曲線擬合使其線性范圍更寬，準(zhǔn)確度更高。

多數(shù)蛋白定量方法采用BSA或免疫球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定待測(cè)樣品的蛋白含量，若對(duì)蛋白定量的準(zhǔn)確性要求特別高時(shí)，需使用純化的目標(biāo)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［9］。由于目前市場(chǎng)上無(wú)Pg濃縮制劑的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，僅能用試劑盒內(nèi)BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)純化的Pg濃縮物樣品，就需對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行比較，通過(guò)平行性分析來(lái)判斷檢測(cè)的一致性。本方法的線性范圍在62.5～2 000μg／mL之間可對(duì)所有工藝樣品進(jìn)行檢測(cè)，但是平行性結(jié)果顯示，在250～2 000μg／mL之間時(shí)，BSA的曲線與Pg濃縮物所在工藝樣品的曲線的平行性最好，因此Pg濃縮物樣品最好稀釋在此范圍內(nèi)，得到的結(jié)果準(zhǔn)確性較高。同時(shí)，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)Pg純化工藝樣品的BCA法不需換算蛋白質(zhì)系數(shù)。

已知某些物質(zhì)會(huì)干擾BCA定量分析，包括還原性物質(zhì)、螯合劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿；另外一些物質(zhì)對(duì)BCA定量分析干擾程度較低，當(dāng)其在原始樣品中的含量低于某特定濃度時(shí)，僅對(duì)結(jié)果造成微小影響（可耐受），如由于一定濃度某物質(zhì)的存在而引入的蛋白質(zhì)含量（添加標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)）估算誤差≤10%，則認(rèn)為當(dāng)該物質(zhì)低于此濃度時(shí)與BCA定量分析法兼容［9］。本研究結(jié)果顯示，150 mmol／L辛酸鈉、500 mmol／L EACA、20 g／L蔗糖、5 g／L甘氨酸、3%鹽酸精氨酸對(duì)檢測(cè)無(wú)影響，但S／D（0.3%磷酸三丁酯+1%吐溫80）對(duì)檢測(cè)有干擾（增強(qiáng)）。其原因是多種干擾物質(zhì)可能產(chǎn)生加和作用，當(dāng)緩沖液中含有多種干擾物質(zhì)時(shí)，即使其中單一干擾物質(zhì)低于其可兼容濃度（5%吐溫80），總體仍可能對(duì)蛋白的定量分析產(chǎn)生干擾，推測(cè)是有機(jī)溶劑磷酸三丁酯對(duì)試驗(yàn)的疊加干擾。

BCA法一般多用于研發(fā)階段的過(guò)程樣品檢定，生物制品的成品、原液／半成品多為凱氏定氮法及雙縮脲法。本實(shí)驗(yàn)在新產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中考慮最終檢定方法與過(guò)程檢定一致性的需要，將BCA法檢測(cè)結(jié)果與凱氏定氮法及雙縮脲法的結(jié)果進(jìn)行比較，改良BCA法具有快速、準(zhǔn)確、高通量的優(yōu)點(diǎn)，既可用于Pg純化工藝的過(guò)程樣品檢測(cè)（過(guò)程監(jiān)控），也可用于原液、半成品和成品的內(nèi)控檢測(cè)。