李代英，魯明，朱海蓮，何麗存，顧冉，張娟，陳俊英，潘玥，孫強明

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明650118；2.云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室，云南 普洱665000

登革病毒（Dengue virus，DENV）是一種單鏈正義RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，其開放閱讀框架編碼衣殼蛋白、膜相關(guān)蛋白和包膜蛋白3種結(jié)構(gòu) 蛋 白 以 及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等7種非結(jié)構(gòu)蛋白，由伊蚊傳播，主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)。估計每年約3.9億人感染登革熱，其中9 600萬人感染后癥狀明顯，是在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的蟲媒病毒［1］。登革熱的流行傳播每年造成巨大的經(jīng)濟損失并對人體健康產(chǎn)生了巨大的威脅。在我國，首次于1978報道了較大規(guī)模的登革熱疫情，而Ⅰ型DENV（Dengue Virus-1，DENV-1）是國內(nèi)的主要流行病毒株之一，在廣東、湖南、云南等地多次報道了由DENV-1引起的疫情。DENV有4種不同的血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。登革熱感染者在第1次感染后再次感染登革熱時，如果血清型與第1次感染類型不同，將產(chǎn)生抗體依賴性增強（antibody dependent enhancement，ADE）導(dǎo)致感染加重，引起廣泛的臨床表現(xiàn)。在一個地區(qū)內(nèi)存在多種血清型的DENV流行傳播時，疫情的范圍和患者的癥狀將更加嚴(yán)重。臨床癥狀的范圍由輕到重，從發(fā)熱到登革熱出血熱（Dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革熱休克綜合征（Dengue shock syndrome，DSS）變化。嚴(yán)重的癥狀會導(dǎo)致生命受到威脅。至今為止，尚無應(yīng)對登革熱的合適的人用疫苗和特效療法，且防疫工作水平有待提高，無法阻止登革熱疫情的出現(xiàn)和快速傳播。登革熱疫情的擴散和傳播對公共衛(wèi)生和經(jīng)濟發(fā)展造成了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致全球疾病的負(fù)擔(dān)日益加重，登革熱由此被認(rèn)為是發(fā)病率最高、危害最大的傳播媒介疾?。?］。登革熱疫情多在熱帶和亞熱帶地區(qū)暴發(fā)，其炎熱多雨的環(huán)境為蚊蟲滋生提供了有利條件，是這一現(xiàn)象出現(xiàn)的誘因之一［3］。在我國南方地區(qū)，如廣東、云南、海南具有登革熱傳播環(huán)境的省份相繼出現(xiàn)了登革熱疫情。根據(jù)HUANG等的研究［4］，廣東省在2014年暴發(fā)的登革熱疫情大多數(shù)是由DENV-1導(dǎo)致的。本文匯總了GenBank上以“China”和“Virus 1”為關(guān)鍵詞的搜索結(jié)果，通過收集來自中國的DENV-1基因組全序列來分析DENV-1的流行趨勢、傳播方向和遺傳進(jìn)化特征，旨在為后續(xù)研究DENV的傳播及防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DENV流行株全長核酸序列的獲取 在美國國家生物信息中心NCBI進(jìn)行DENV序列的收集，病毒株收取地點為中國，共收集DENV-1全長序列株405株，涵蓋了1985—2020年間大部分中國境內(nèi)提交的病毒株序列。

1.2 DENV流行株全長序列初步進(jìn)化分析及代表株的挑選 對所收集的DENV序列株進(jìn)行描述和初步分析，通過比對和系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來揭示其在中國地區(qū)的遺傳進(jìn)化和流行病學(xué)信息。由于需要進(jìn)行大規(guī)模的序列比對和進(jìn)化樹的繪制，因此使用RaxML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索國內(nèi)流行的DENV-1全基因序列并匯總下載，用在線MAFFT工具（https：／／mafft.cbrc.jp／alignment／server／）提交得到返回的比對結(jié)果。然后使用Mesquite軟件打開比對后的文件以phylip格式輸出，并將該格式輸出的文件在ATGC網(wǎng)站（http：／／www.atgc-montpellier.fr／phyml／）在線進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，模型選擇為GTR+I+R［5］。從進(jìn)化樹的分析結(jié)果中篩選出在支系、時間、地區(qū)有代表性的登革熱流行株，并與東南亞地區(qū)提交的DENV-1全長序列株共48株使用MEGA X軟件進(jìn)行進(jìn)化樹繪制（選用的代表性DENV-1流行株見表1），采用Maximum likelihood模型，Bootstrap Replications設(shè)置為1 000［6-8］，以此結(jié)果進(jìn)行第2輪分析。

表1 MEGA進(jìn)化樹選用的代表性DENV-1流行株Tab.1 Representative epidemic DENV-1 strains used for MEGA phylogenetic tree

1.3 重組進(jìn)化分析 由于重組是DENV的一種相對頻繁的進(jìn)化機制，本文使用RDP5（recombination detection program 5）挑選了上一步繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹中具有地理位置和年份代表性的毒株進(jìn)行重組和演化分析［9］。將所選病毒株在MEGA X軟件中使用Clustal W方法比對并對齊所選序列株，將其結(jié)果輸出為MEGA format格式，隨后在RDP5中運行進(jìn)行重組分析。

1.4 DENV-1流行株氨基酸突變位點分析 將1.2項中挑選的具有代表性的48株DENV-1流行株的序列比對結(jié)果進(jìn)行匯總分析，通過MEGA X軟件將開放閱讀框架翻譯為氨基酸序列，分析氨基酸突變情況。

2 結(jié)果

2.1 中國DENV-1的時間及地區(qū)分布 根據(jù)公共衛(wèi)生科學(xué)數(shù)據(jù)中心（http：／／www.phsciencedata.cn／Share／）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2004—2017年間共66 623人感染登革熱。在此期間廣東省是登革熱流行最嚴(yán)重的省份，作為沿海省份并擁有溫暖潮濕的氣候，為登革熱的傳入和蚊蟲的滋生創(chuàng)造了有利條件；沿海的浙江和邊境省份云南同樣經(jīng)常出現(xiàn)DENV-1流行株的傳播。見圖1。

圖1 中國登革熱感染人數(shù)及DENVⅠ型血清型地區(qū)歷年分布Fig.1 Annual distribution of case number of DENV infection and provinces with DENV-1 epidemic in China

2.2 中國境內(nèi)DENV流行株的序列進(jìn)化分析405株進(jìn)化樹收錄的DENV株中近300余株均由廣東省上傳，可見在DENV株的輸入和傳播過程中，廣東省起到了關(guān)鍵作用。2016年廣東株MN018318和MG840567與2株臺灣流行株KY496855、KY496854在發(fā)育樹中距離相近。在圖2進(jìn)化樹中，MF681692至KU509257之間的流行株表明各個省份流行的DENV株與彼此之間以及東南亞國家存在密切聯(lián)系。初步分析繪制的進(jìn)化樹中，MG840579、MG84-0574等2017年越南株與上述2016年廣東流行株接近，提示可能存在廣東省向東南亞地區(qū)輸出DENV的可能，而非東南亞地區(qū)對我國的單向輸入。2019年（MN923080）、2017年（MN018297）、2016年（MN-018318／MG840567）以及2010年（KT827367）廣東流行株在遺傳距離上相近，提示某一病毒株輸入后可能長期流行，并且會隨著時間延長積累更多樣的DENV株，在核苷酸序列和基因型上更加豐富，為防控及疫苗研發(fā)工作帶來困難。同樣的在圖2進(jìn)化樹中，MF405201、KY672943、MW386867分 別 為 云 南2013—2015年間流行的病毒株，云南省DENV-1流行株與東南亞國家流行株顯著相關(guān)，在遺傳距離上相近，且大多數(shù)與廣東省主要流行株處于不同的分支，可認(rèn)為云南省DENV流行株多自中南半島的內(nèi)陸國家輸入，而廣東省的DENV流行株輸入來源更為廣泛。在2014年暴發(fā)的登革熱疫情中，廣東省提交的病毒株數(shù)量較多且聯(lián)系評分降低，可認(rèn)為該年份因大量不同支系的登革熱傳入并共同在同一地區(qū)流行引發(fā)了登革熱大規(guī)模的流行。

圖2 中國境內(nèi)流行的DENV-1全基因組序列與東南亞流行株構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of complete genome sequences of DENV-1 in China and epidemic strain in Southeast Asia

2.3 中國DENV-1流行株的重組進(jìn)化分析 在支系、省份、時間上有代表性的DENV株為MN018318、MG840567、KT827367等廣東DENV流行株14株（1991—2018年），以及臺灣流行株如KX951689（2016）和云南流行株MF681692（2019）、福建流行株DQ193572（2005）、浙江流行株如AY835999（2004）等DENV株共計24株，進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示，2017年廣東株MN018297部分序列可能與2014年廣東流行株KP723476同源，表明中國境內(nèi)的DENV株可能存在極少量的重組進(jìn)化的現(xiàn)象，但并未出現(xiàn)大范圍的DENV株之間的序列重組。見圖3。

圖3 DENV-1株基因重組進(jìn)化分析Fig.3 Analysis of gene recombination evolution of DENV-1 strain

2.4 DENV-1流行株氨基酸突變位點分析 將挑選的具有代表性的48株DENV-1氨基酸序列進(jìn)行比對分析，從表2可知，除氨基酸中E蛋白區(qū)域的317、368、441、649點位出現(xiàn)氨基酸的替代外，非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的1053、1274、1337、1768等位點也均出現(xiàn)了不同比例的氨基酸的替代。其中317、441、649、873、903、914、1274、1275、1289、1587、2113等位點主流氨基酸比例與替代氨基酸比例約為7∶3，而在占比30%的氨基酸替代情況中，KP723473（廣東2014）等6株、KP686070（河南2014）、KR024705（湖北2014）、KR024708（浙江2014）、KT827378（廣東2015）等2株、KX225487（廣東2013）等2株、MN886849（浙江2019）等2株的存在導(dǎo)致了這一比例的出現(xiàn)，由于這一部分序列極為接近，結(jié)合圖1，可推測認(rèn)為2014年廣東暴發(fā)的登革熱疫情將傳播范圍擴大至河南、湖北、浙江等地，且該毒株可能并非2014年由境外輸入，而是于2013年已經(jīng)在廣東省內(nèi)流行，并在之后的數(shù)年內(nèi)仍然長期在廣東流行。這一輪輸入的毒株并非與云南省及周邊地區(qū)的流行株序列相接近，可支持云南省和廣東省的DENV流行株是由不同來源輸入的結(jié)果。869、1053、1337、1768等替代位點的存在提示可能有第3種類群的DENV流行株存在但占比不高，可能是由于新的輸入方式、DENV序列株的豐富或重組而出現(xiàn)這一現(xiàn)象。

表2 DENV-1流行株氨基酸突變位點分析（%）Tab.2 Analysis of amino acid mutation sites of epidemic DENV-1 strains（%）

3 討論

從1978年國內(nèi)首次報道了廣東省登革熱流行，至今已經(jīng)40余年，登革熱的流行已經(jīng)從沿海及邊境地區(qū)的廣東省、海南省、云南省、福建省等不斷向北擴展，目前浙江、湖南、河南等地均已出現(xiàn)過規(guī)模不等的登革熱流行［10-11］。且云南、湖南等內(nèi)陸省份已經(jīng)出現(xiàn)某一基因型每年固定的流行傳播［12-14］。其中DENV-1毒株多次在國內(nèi)引發(fā)了大規(guī)模的疫情，而4種血清型的DENV在中國境內(nèi)均被檢測到，特別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，在國內(nèi)交替引起登革熱疫情。多種型別的DENV毒株共同流行的情況也有出現(xiàn)，且多種型別DENV毒株的同時流行會導(dǎo)致疫情的規(guī)模更大、臨床癥狀更重，影響更加嚴(yán)重［15］。

目前在登革熱尚無合適的人用疫苗的情況下［16］，通過病媒控制等預(yù)防手段來控制登革熱疫情仍然是最有效的方法。東南亞地區(qū)以及我國南方的氣候環(huán)境和人群喜愛花草的生活習(xí)慣均為登革熱的傳播提供了有利條件，這也為各種DENV基因型在一定地區(qū)的長期流行和累積提供了適宜環(huán)境。考慮到廣東、廣西、江西、湖南等省份氣候相似而疫情暴發(fā)相比廣東較為少見，推測境外傳入因素在登革熱的疫情暴發(fā)中起到了重要作用。在系統(tǒng)發(fā)育樹的分析中，可以觀察到同一支系下數(shù)株關(guān)系接近的DENV毒株是同一地區(qū)不同年間的持續(xù)流行的現(xiàn)象，即便每年有傳入的DENV毒株，但因缺少快速傳播的競爭環(huán)境和地理因素，之前國內(nèi)所流行的不同支系的DENV毒株仍將流行很長一段時間并且難以消除，在該地區(qū)出現(xiàn)多種不同基因型的DENV同時流行時將會對疫情防控提出更嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，并且可能因不同血清型病毒的繼發(fā)性感染和ADE作用導(dǎo)致重癥病例數(shù)增加［17］，并且ADE會對DENV毒株傳播競爭存在一定的選擇性［18］，這對在早期曾經(jīng)感染過登革熱的人群威脅更大［19］。在國內(nèi)DENV毒株的流行中，可以觀察到許多基因型首先在廣東、云南或者同時在廣東、云南和內(nèi)陸某一省份出現(xiàn)，且形成了穩(wěn)定的進(jìn)化譜系?？紤]省份之間的交流和地理位置的特殊性，對廣東省及云南省進(jìn)行嚴(yán)格的疫情防控有助于從源頭降低DENV毒株從境外的輸入數(shù)量和在境內(nèi)的擴散傳播。

世界衛(wèi)生組織2012—2020年的預(yù)防和控制登革熱的全球戰(zhàn)略目標(biāo)是至少降低50%登革熱死亡率、25%的發(fā)病率［20］。為達(dá)成這一目標(biāo)和保護(hù)人群健康，需要認(rèn)識登革熱的傳播程度和影響范圍，并采取相對應(yīng)的措施。作為疫情防控最有效的手段，目前登革熱疫苗相關(guān)的研究正取得較大進(jìn)展，雖然CYDTDV（Dengvaxia）四價嵌合減毒在2017年12月被菲律賓全面撤回，但日本武田（Takeda）DENVax、NIAID／Butantan的LAV Delta 30、Hawaii Biotech／Merck的DEN-80E、美國海軍研究中心的D1ME-VR-P等均已處于臨床研究階段［21］，相信不遠(yuǎn)的將來將會取得重要突破。