趙婷，施紅媛，李菁，陳詩怡，傅宇婷，趙鈺萍，楊曉蕾，楊凈思

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南昆明650118

口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，OPV）作為曾經(jīng)廣泛應用的脊髓灰質(zhì)炎（簡稱脊灰）疫苗，大大降低了脊灰的發(fā)病率，為預防控制乃至消滅脊灰作出了突出的貢獻［1］。在野生脊髓灰質(zhì)炎病毒幾近被消滅的情況下，考慮到OPV會引起疫苗相關(guān)的脊灰病例（vaccine-associated paralytic polio，VAPP）和疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒循環(huán)（circulating vaccine derived polioviruses，cVDPV）［2-3］，在脊灰消滅行動的最后階段，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議逐步使用脊灰滅活疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV）替換OPV［4］。包括中國在內(nèi)的大部分國家，OPV中的Ⅱ型成分被去除，改用IPV和Ⅰ+Ⅲ型二價OPV（bivalent oral poliovirus vaccine，bOPV）聯(lián)合序貫免疫程序。

目前階段，環(huán)境中的脊灰減毒株和野生毒株還一直存在，由于IPV幾乎不能誘導產(chǎn)生脊灰特異的黏膜免疫以減少接觸脊灰病毒后帶來的排毒效應，因此在糞口途徑傳播普遍的國家，減少排毒成為徹底消滅脊灰的關(guān)鍵［5］。本實驗利用脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型，觀察接種1、2、3劑bOPV后小鼠的排毒情況及脊灰特異的黏膜免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）抗體水平，分析排毒與接種劑次、黏膜IgA水平的關(guān)系，進一步觀察排毒小鼠與潔凈小鼠共居后對潔凈小鼠排毒的影響，以期摸索接種bOPV后的排毒規(guī)律，為脊灰的防控和排毒監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗、載體及菌株Ⅰ+Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（人二倍體細胞）由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供，規(guī)格：0.1 mL／劑，含脊髓灰質(zhì)炎活病毒總量不低于6.12 lgCCID50，其中Ⅰ型應不低于6.0lgCCID50，Ⅲ型應不低于5.50 lgCCID50；pSP64 polyA載體購自美國Promega公司；大腸埃希菌Top10購自日本TaKaRa公司。

1.2 實驗動物SPF級脊灰受體轉(zhuǎn)基因C57BL／6N小鼠，共12只，雌性，體重18 g，購自北京維通利華公司，動物合格證號：1103411911000199。

1.3 主要試劑及儀器RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6）購自美國Promega公司；一步法絕對定量試劑盒（One Step PrimeScript?RT-qPCR Mix）購自日本TaKaRa公司；小鼠脊髓灰質(zhì)炎抗體IgA酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒購自默沙克生物公司。

1.4 疫苗接種及采樣 取12只脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠，以灌胃方式接種bOPV，0.1 mL，共接種3劑，間隔28 d。每劑bOPV接種后第1、3、5、7天采集當天小鼠糞便樣本，均質(zhì)后稱取500 mg，加入2 mL PBS溶液并充分混勻，800×g離心20 min后收集上清溶液，用于后續(xù)排毒和脊灰特異IgA的檢測。

1.5 排毒檢測 采用實時定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，q-PCR）法測定病毒載量。取140μL糞便上清溶液，使用RNA提取試劑盒提取樣品RNA。標準品制備：將Sabin1和Sabin3基因序列［由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］酶切連接進入pSP64 polyA載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10工程菌，挑取單克隆，提取載有基因片段的完整質(zhì)粒作為模板。將分別載有Sabin1和Sabin3基因片段的完整質(zhì)粒線性化，使用RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得Sabin1和Sabin3的RNA序列作為絕對定量PCR的標準品，使用一步法絕對定量試劑盒測定病毒載量。Sabin1株實時定量引物為：Primer1：5′-CCACTGGCTTCAGTGTTT-3′，Primer2：5′-AGGTCAGATGCTTGAAAGC-3′，Probe：Cy5-TTGCCGCCCCCACCGTTTCACGGA-BHQ-3；Sabin3株實時定量引物為：Primer1：5′-TTAGTATCAGGTAAGCTATC；Primer2，5′-AGGGCGCCCTAACTTT-3′，Probe：ROX-TCACTCCCGAAGCAACAG-BHQ2。擴增條件為：第1步：42℃5 min，95℃10 s；第2步：95℃5 s，56℃30 s，35個循環(huán)；在第2步56℃擴增時檢測信號。

1.6 IgA檢測 收集每劑bOPV接種后第7天的糞便上清溶液，使用小鼠脊髓灰質(zhì)炎抗體IgA酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測定糞便上清溶液中IgA水平。

1.7 小鼠共居試驗 接種了第1劑bOPV的轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)排毒檢測后，將排毒較高的6只小鼠分為高排毒組，排毒較低的6只小鼠分為低排毒組。第1劑bOPV接種后高排毒組小鼠與10只潔凈小鼠放入一個鼠籠，低排毒組小鼠與10只潔凈小鼠放入另一個鼠籠，共同飼養(yǎng)2 d后，按照小鼠編號將接種過bOPV的小鼠與潔凈小鼠分開（每只小鼠通過剪腳趾的順序，有自己獨有編號，按照編號區(qū)分每只小鼠）。采集潔凈小鼠共居后第3、5、7天的當天糞便，按照1.5項步驟檢測小鼠的排毒量。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 5和SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間平均值的比較采用t檢驗，兩組數(shù)據(jù)方差不齊時，采用秩和檢驗比較兩組間的平均值。率的比較采用Fisher確切概率法。假設(shè)檢驗水準為雙側(cè)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠接種bOPV后的排毒情況 第1劑bOPV接種后第1～7天，均發(fā)現(xiàn)了Ⅰ和Ⅲ型脊灰病毒的排毒個體；第2和第3劑bOPV接種后第1～5天，有Ⅰ和Ⅲ型脊灰病毒排毒呈現(xiàn)陽性的個體，而第2和第3劑bOPV接種后第7天，除第3劑bOPV接種后檢測到Ⅲ型脊灰病毒少量排毒，其余未檢測到排毒呈陽性的個體。排毒期隨著接種bOPV劑接種次的增加而逐步縮短；其次，隨著劑次的增加，每劑bOPV引起的排毒量逐漸減少。見表1。第2和第3劑bOPV接種后Ⅰ型脊灰病毒排毒量顯著低于第1劑（t分別為3.203和3.672，P分別為0.004和0.001），Ⅲ型脊灰病毒排毒量也顯著低于第1劑（t分別為2.633和2.598，P分別為0.015和0.016），隨著劑次的推移，其排毒的波峰越來越小。第3劑接種后發(fā)現(xiàn)Ⅲ型脊灰病毒的排毒持續(xù)時間更長，第3劑接種后第7天仍檢測到Ⅲ型脊灰病毒有少量排毒，且第3劑接種后第1和第7天，Ⅲ型脊灰病毒的排毒陽性率和排毒量均高于Ⅰ型。見圖1。

2.2 接種第1劑bOPV后排毒量高和排毒量低的個體在后續(xù)劑次的排毒情況 將接種第1劑bOPV后排毒量較高的6只小鼠歸為一組（高排毒組），另6只排毒量相對較低的小鼠歸為一組（低排毒組），對比分析接種首劑bOPV后排毒高和排毒量低的個體在第2和第3劑接種后的排毒情況，結(jié)果顯示，第1劑接種后（排毒峰值在第3天）高排毒組的Ⅰ和Ⅲ型脊灰排毒量均顯著高于低排毒組（t分別為5.056和3.608，P分別<0.001和=0.005）；第2劑接種后，首劑高排毒組的Ⅰ型排毒峰值顯著低于首劑低排毒組（t=2.313，P=0.043），首劑高排毒組的Ⅲ型排毒峰值略低于首劑低排毒組，但差異無統(tǒng)計學意義（U=11，P=0.285 7）。見圖2。

表1接種3劑bOPV后脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠糞便樣本中的脊灰排毒情況Tab.1 Viral shedding in fecal samples of poliovirus receptor transgenic mice after inoculation with three doses of bOPV

圖1 脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠每劑bOPV接種后Ⅰ型（A）和Ⅲ型（B）的排毒峰值（柱狀圖）Fig.1 Histogram of peak values of viral shedding of poliovirus receptor transgenic mice after inoculation with bOPV of typesⅠ（A）andⅢ（B）

2.3 排毒與脊灰特異的腸道黏膜IgA的關(guān)系 第1、2、3劑接種后，隨著接種劑次的增加，脊灰特異的IgA陽性率逐漸升高，IgA呈現(xiàn)陽性的個體數(shù)在增加，同時IgA平均水平也有一定程度的上升，見表2。根據(jù)第1劑bOPV接種后脊灰特異的IgA是否呈陽性，將小鼠分為第1劑接種后IgA陽性組和陰性組，觀察兩組之間接種第1劑和第2劑bOPV后排毒的差異，結(jié)果顯示，第1劑接種后IgA陽性組在第1劑接種后第3天（即排毒的峰值），脊灰排毒量高于陰性組，其中Ⅰ型脊灰排毒量顯著高于第1劑接種后IgA陰性組（t=3.989，P=0.003）。相反，第2劑bOPV接種后，第1劑接種后IgA陽性組的Ⅰ和Ⅲ型脊灰排毒量均顯著低于陰性組（U分別為5和3，P分別為0.048和0.015）。同樣，第2劑bOPV接種后IgA陽性組在接種第3劑bOPV后，其Ⅰ和Ⅲ型脊灰排毒量均低于陰性組，但差異無統(tǒng)計學意義（U分別為8和12，P分別為0.214和0.570）。見圖3。

2.4 未接觸過bOPV的潔凈小鼠與排毒小鼠接觸后的排毒情況 與接種bOPV后發(fā)生排毒小鼠共居后，部分潔凈小鼠有排毒。與高排毒組共居的潔凈小鼠有更多個體發(fā)生排毒，其中在共居的第3天，與高排毒組共居的潔凈小鼠Ⅰ型脊灰排毒率顯著高于與低排毒組共居的潔凈小鼠（P=0.020）。從排毒量來看，與高排毒組共居的潔凈小鼠整體排毒量更高，其中在共居的第3天，與高排毒組共居的潔凈小鼠Ⅰ型和Ⅲ型脊灰排毒量均顯著高于與低排毒組共居的潔凈小鼠（U均為18，P分別為0.014和0.020）。且在與高排毒組共居的第3和第5天，潔凈小鼠Ⅲ型脊灰排毒量顯著高于Ⅰ型（t分別為3.482和2.324，P分別為0.003和0.032）。見表3和圖4。

表2 每劑bOPV接種后脊灰特異的IgA情況Tab.2 Poliovirus-specific IgA in mice after inoculation with each dose of bOPV

圖2 第1劑bOPV接種后排毒量高和排毒量低兩組小鼠Ⅰ型（A）和Ⅲ型（B）的排毒情況Fig.2 Shedding of poliovirus of typesⅠ（A）andⅢ（B）in mice with high and low viral shedding levels after inoculation with the first dose of bOPV

圖3 bOPV接種后排毒與脊灰特異的腸道黏膜IgA的關(guān)系Fig.3 Relationship between viral shedding and IgA in intestinal mucosa of mice after inoculation with bOPV

圖4 潔凈小鼠與高排毒和低排毒組小鼠共居后的排毒量對比Fig.4 Viral shedding levels of clean mice after cohabitation with high and low viral shedding mice

表3 潔凈小鼠與接種bOPV后排毒小鼠共居后的排毒情況Tab.3 Viral shedding of clean mice after cohabitation with viral shedding mice after inoculation with bOPV

3 討論

OPV能提供高水平的腸道黏膜免疫來預防病毒沿糞口途徑的傳播擴散，這也是其能快速降低發(fā)病率的關(guān)鍵，特別是在發(fā)展中國家［6］。但由于新的免疫策略比起原脊灰免疫程序中應用了IPV，減少了OPV的使用次數(shù)，而IPV激發(fā)脊灰特異的腸道黏膜免疫能力有限，因此人群中脊灰特異的黏膜免疫力有所降低［7-9］。本實驗利用脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型研究bOPV接種后的排毒規(guī)律及對周圍群體的影響。

首先，通過研究發(fā)現(xiàn)，隨著bOPV接種劑次的增加，疫苗所引發(fā)的排毒量逐漸減少。其次，第1劑bOPV接種后排毒量較高的個體在后續(xù)的bOPV接種后，排毒量比首劑排毒量低的個體顯著降低，且在第1劑bOPV接種后IgA呈陽性的個體在第1劑接種后第3天（即排毒的峰值），脊灰的排毒量高于IgA呈陰性組。因此，接種首劑減毒活疫苗后排毒亮高的個體由于減毒株的增殖復制，可能引起較高水平的黏膜免疫反應，產(chǎn)生較多脊灰特異的IgA，在后續(xù)bOPV接種后能快速中和病毒，減少排毒量。最后，通過觀察清潔小鼠與接種過bOPV排毒小鼠共居后的排毒狀態(tài)，了解bOPV接種后脊灰排毒強弱對周圍群體的影響。與高排毒的小鼠共居后，潔凈小鼠發(fā)生排毒的機率顯著高于與低排毒的小鼠共居的潔凈小鼠。因此，要達成徹底消滅脊灰的目標，降低脊灰病毒的排毒量是目前的重要任務(wù)。另外，通過排毒小鼠與潔凈小鼠的共居試驗，發(fā)現(xiàn)在接觸后，Ⅲ型脊灰疫苗株比Ⅰ型更易引起潔凈小鼠的排毒反應，排毒量和持續(xù)時間更長。這可能與不同脊灰型別的毒株排毒數(shù)量、持續(xù)性和在環(huán)境中存在的穩(wěn)定性不同有關(guān)［10］。

本實驗結(jié)果顯示，接種過bOPV的個體可產(chǎn)生黏，膜免疫快速抑制脊灰病毒的復制，在接種過2劑bOPV后，個體再次接觸脊灰病毒幾乎不發(fā)生排毒。而對于缺乏脊灰特異黏膜免疫的個體一旦接觸疫苗株后，特別是與排毒量高的個體接觸后，很可能會引起病毒復制和排毒反應。因此，在使用OPV的國家轉(zhuǎn)為使用IPV的過程中，一旦引入疫苗變異株后，可能會引起cVDPV的暴發(fā)。

目前在OPV向IPV的過渡階段，IPV-bOPV序貫免疫是包括我國在內(nèi)大多數(shù)國家采用的免疫程序。目前新的免疫策略比起原脊灰免疫程序中應用了IPV，減少了OPV的使用次數(shù)，且未接種Ⅱ型的脊灰減毒活疫苗，因此，脊灰的腸道黏膜免疫力有所降低，人群一旦接觸環(huán)境中的毒株，易發(fā)生排毒反應和毒株變異［11］。事實上，在轉(zhuǎn)換為bOPV后，在我國和多個國家已暴發(fā)了多起cVDPV2，WHO已將cVDPV2暴發(fā)列為公共國際關(guān)注的衛(wèi)生緊急事件［12］。當前由于全球形勢，使用OPV的國家可能需要重新使用OPV2［13］。因此，發(fā)展新型脊灰疫苗對于徹底消滅脊灰病毒具有重要意義。通過基因編輯技術(shù)，開發(fā)新型OPV疫苗，提高Sabin減毒株的遺傳穩(wěn)定性，降低恢復神經(jīng)毒性的可能性和排毒率，可很好地激發(fā)黏膜免疫反應，減少病毒再次入侵后的復制和排毒，有效控制糞口途徑的傳播。目前新型單價OPV2（novel OPV2，nOPV2）已計劃用于應對cVDPV2的暴發(fā)［14］。