宋利華，任向宇，楊航，殷兆麗，孫曉琳，李戀，福泉，包麗麗

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010059；

2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010050

血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成動脈、靜脈和毛細(xì)血管的單細(xì)胞層，在血管腔內(nèi)的循環(huán)血液和血管壁之間形成一道屏障，可維持血管結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定［1］。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時，其功能與平衡穩(wěn)定性被破壞，誘發(fā)膿毒癥、糖尿病、動脈粥樣硬化和血管炎等多種疾?。?-5］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又稱為內(nèi)毒素，位于革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分，是重要的毒力因子［6］，可通過誘導(dǎo)組織細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［7］。

肉桂（cinnamon）又稱嘎必拉音·哈利蘇，為樟科樟屬植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮，是重要的香料和藥材，屬于傳統(tǒng)蒙藥里的鎮(zhèn)赫依藥物，具有多種生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、抗心血管疾病等作用［8-10］，臨床上常用于糖尿病、腎病、腫瘤以及心血管系統(tǒng)疾病等的治療［9］。

本研究以LPS作為誘導(dǎo)劑，構(gòu)建人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷模型，觀察肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷的保護(hù)性作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 肉桂 肉桂購自安國市榮華本草中藥材有限公司。

1.2 細(xì)胞株HUVECs由內(nèi)蒙古大學(xué)阿拉坦高勒教授惠贈。

1.3 主要試劑LPS和DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司；PBS和青-鏈霉素購自美國HyClone公司；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自美國Apexbio公司；TNF-α ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；RTPCR試劑盒購自上海翊圣科技有限公司；RNAiso Plus購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔抗PARP多克隆抗體和兔抗p-mTOR多克隆抗體購自美國ImmunoWay Biotechnology公司；兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Bioworld Technology公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自沈陽萬類生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海雅酶生物科技有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs用含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 肉桂水提物的提取及肉桂溶液的制備 稱取100 mg肉桂粉碎至粉末狀，加入蒸餾水浸泡24 h，超聲儀破碎5 min，用紗布過濾除去殘渣后，500×g離心10 min，取上清，分裝于圓底燒瓶中，于乙醇冷凍機(jī)上冷凍2 h；待肉桂溶液完全凍于燒瓶壁上后，將燒瓶取下，安裝于冷凍干燥機(jī)上，冷凍干燥24 h。將凍干的肉桂取出，稱重，計算提取率。無菌條件下取適量的DMSO溶液，加入裝有肉桂水提物的離心管內(nèi)，反復(fù)吹打，使肉桂完全溶解（肉桂工作液中DMSO濃度小于0.1%），用0.22μm濾膜過濾，分裝，置-20℃保存。每次加藥前用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度。

1.6 LPS誘導(dǎo)濃度的篩選 取對數(shù)生長期的HUVECs，按5×103個／孔接種于96孔板，將細(xì)胞分為空白對照組（不接種細(xì)胞）、陰性對照組（接種細(xì)胞不加LPS）、不同濃度（0.01、0.1、1、10、20μg／mL）LPS處理組，每組設(shè)4個復(fù)孔。給藥24 h后，棄上清，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值，并按下式計算細(xì)胞存活率。

1.7 肉桂給藥濃度的篩選 取對數(shù)生長期的HUVECs，按5×103個／孔接種于96孔板，將細(xì)胞分為空白對照組（不接種細(xì)胞）、陰性對照組（接種細(xì)胞不加肉桂）、不同濃度（0.5、2、5 mg／mL）肉桂處理組，每組設(shè)4個復(fù)孔。給藥24 h后，棄上清，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值，并計算細(xì)胞存活率（公式同1.6項）。

1.8 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs存活率影響的檢測 待HUVECs融合度達(dá)75%～85%時，按5×103個／孔接種于96孔板，將細(xì)胞分為對照組、LPS組和LPS+肉桂組，對照組加入無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；LPS組用含篩選濃度LPS的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；LPS+肉桂組預(yù)先加入篩選濃度的LPS孵育24 h，再加入篩選濃度的肉桂培養(yǎng)24 h；棄上清，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值，并計算細(xì)胞存活率（公式同1.6項）。

1.9 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs培養(yǎng)上清中TNF-α含量影響的檢測 采用ELISA法。取對數(shù)生長期的HUVECs，按3×105個／孔接種于6孔板，細(xì)胞分組及處理同1.8項，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按TNF-αELISA試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔吸光度值，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量。

1.10 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs中PARP（116 kD）、UCP2基因mRNA水平影響的檢測 采用實時熒光定量PCR法。細(xì)胞分組及處理同1.8項，用RNAiso Plus提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說明操作，檢測各組細(xì)胞PARP（116 kD）、UCP2基因mRNA水平。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性3 s，退火／延伸72℃32 s，40個循環(huán)。用融點曲線進(jìn)行循環(huán)后分析，在60～95℃之間測定，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。以βactin為內(nèi)參，使用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.11 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs中PARP（89 kD）、p-mTOR蛋白表達(dá)水平影響的檢測 采用Western blot法。細(xì)胞分組及處理同1.8項，使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量分析試劑盒對提取的蛋白進(jìn)行定量，取30μg蛋白樣品經(jīng)8%和12%的SDS-PAGE膠分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜放于含5%脫脂奶粉的封閉液中，置于室溫?fù)u床上封閉1 h；分別加入PARP（1∶2 000稀釋）、p-mTOR（1∶2 000稀釋）、GAPDH（1∶10 000稀釋）抗體，于4℃冰箱孵育過夜；1×TBST洗膜3次，10 min／次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（均為1∶10 000稀釋），于搖床上室溫孵育1 h；1×TBST清洗3次，10 min／次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色，在暗室里用X光膠片進(jìn)行壓片，曝光并用顯影液顯影，掃描底片后用Gel-pro Analyzer 4.0分析軟件分析灰度值。重復(fù)3次試驗。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)濃度的篩選 隨著LPS濃度的增加，HUVECs的存活率逐漸下降，濃度為1、10、20μg／mL的LPS作用24 h后，與對照組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.150，P分別為0.029、0.000 1和0.000 1），表明LPS對HUVECs存活率的抑制作用呈濃度依賴性，見圖1。選擇1μg／mL作為LPS誘導(dǎo)濃度。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度LPS對HUVECs存活率的影響Fig.1 Determination of effects of different concentrations of LPS on survival rate of HUVECs by CCK-8 method

2.2肉桂給藥濃度的篩選 不同濃度肉桂對HUVECs的存活率無顯著影響，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.836，P=0.113 8），見圖2，因此選擇2 mg／mL作用24 h作為肉桂給藥條件。

圖2 CCK-8法檢測不同濃度肉桂對HUVECs存活率的影響Fig.2 Determination of effects of different concentrations of cinnamon on survival rate of HUVECs by CCK-8 method

2.3 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響與對照組相比，LPS組HUVECs的存活率顯著降低（F=17.13，P=0.021）；與LPS組相比，LPS+肉桂組細(xì)胞存活率顯著升高（F=17.13，P=0.029），見圖3。表明肉桂對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖3 CCK-8法檢測各組HUVECs的存活率Fig.3 Determination of survival rate of HUVECs in various groups by CCK-8 method

2.4 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs培養(yǎng)上清中TNF-α含量的影響 與對照組相比，LPS組HUVECs培養(yǎng)上清液中TNF-α含量顯著升高（F=2 436，P=0.000 1）；與LPS組相比，LPS+肉桂組TNF-α含量顯著降低（F=2 436，P=0.000 1），見圖4。表明肉桂可顯著降低LPS誘導(dǎo)的HUVECs分泌細(xì)胞因子TNF-α。

圖4 ELISA法檢測各組HUVECs培養(yǎng)上清中的TNF-α含量Fig.4 ELISA of TNF-αcontent in culture supernatant of HUVECs in various groups

2.5 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs中PARP（116 kD）、UCP2基因mRNA水平的影響 與對照組相比，LPS組HUVECs中PARP（116 kD）和UCP2基因mRNA水平顯著降低（F分別為12.09和17.86，P分別為0.002 6和0.024 9）；與LPS組相比，LPS+肉桂組PARP（116 kD）和UCP2基因mRNA水平顯著升高（F分別為12.09和17.86，P分別為0.006 6和0.000 4），見圖5。表明肉桂對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)性作用。

2.6 肉桂對LPS誘導(dǎo)的HUVECs中PARP（89 kD）、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，LPS組HUVECs中PARP（89 kD）和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平顯著升高（F分別為196.8和21.12，P分別為0.008和0.013）；與LPS組相比，LPS+肉桂組PARP（89 kD）和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平顯著降低（F分別為196.8和21.12，P分別為0.000 5和0.037），見圖6和圖7。表明肉桂對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)性作用，且具有m-TOR依賴性。

圖5 實時熒光定量PCR法檢測各組HUVECs中PARP（116 kD）（A）和UCP2（B）基因mRNA水平Fig.5 Transcription levels of PARP（116 kD）（A）and UCP2（B）mRNAs in HUVECs of various groups by real-time fluorescence quantitative PCR

圖6 Western blot檢測各組HUVECs中PARP（89 kD）和p-mTOR蛋白的表達(dá)Fig.6 Western blotting of expressions of PARP（89 kD）and p-mTOR proteins in HUVECs of various groups

圖7 各組HUVECs中PARP（89 kD）（A）和p-mTOR（B）蛋白的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of PARP（89 kD）（A）and p-mTOR（B）proteins in HUVECs of various groups

3 討論

炎癥是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因，LPS在體內(nèi)外均是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)因素，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)并影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能［11］。血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和功能障礙在動脈粥樣硬化、血管炎和膿毒癥等炎癥相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用［2］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷的主要形式之一，其特征是半胱氨酸天冬酶（cysteine aspartic acid-specific proteases，Caspase）的激活，這是一種高度特異的蛋白酶，可裂解廣泛的細(xì)胞內(nèi)底物。PARP（poly ADP-ribose polymerase）蛋白相對分子質(zhì)量為116 kD，是真核細(xì)胞內(nèi)的一種DNA修復(fù)酶，細(xì)胞發(fā)生凋亡時可被caspase 3剪切為89 kD的小片段，PARP被剪切是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)［12］。細(xì)胞凋亡可分為3種途徑，包括死亡受體途徑、線粒體途徑和顆粒酶B途徑。

蒙藥肉桂及其活性成分具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂水提取物體外可降低LPS處理的巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA水平［13］。本研究采用LPS誘導(dǎo)HUVECs損傷，探討蒙藥肉桂對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)性作用機(jī)制，結(jié)果表明，肉桂可通過抑制116 kD PARP的水解、TNF-α等炎癥因子的釋放及調(diào)控UCP2的表達(dá)水平而降低細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，線粒體內(nèi)外膜之間通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（mitochondrial permeability transport pore，MPT）開放，可使線粒體膜的通透性增加、線粒體腫脹，線粒體穩(wěn)定性的破壞使細(xì)胞色素C等因子釋放入胞漿，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。UCP2作為一種線粒體內(nèi)膜上的蛋白，具有抑制MPT開放，阻止線粒體途徑的細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中，抑制UCP2會以ROS依賴的機(jī)制激活A(yù)kt／mTOR通路，導(dǎo)致caspase介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生［15］。肉桂作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能是通過線粒體途徑，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)UCP2 mRNA水平的表達(dá)，減少mTOR的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明，蒙藥肉桂對LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)性作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制線粒體途徑而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，肉桂在心血管疾病的預(yù)防及治療領(lǐng)域具有一定的臨床意義及應(yīng)用價值。