胡冬秀　劉浩　梁炫強　吳自明　方加海

摘 ?要：AT-hook蛋白不僅在植物生長發(fā)育、器官構建、脅迫和激素信號應答中起重要作用，而且還作為染色質重塑的轉錄因子和輔助因子，調節(jié)基因的轉錄活性。為全面了解花生AT-hook基因家族的結構特征，利用生物信息學技術比對花生基因組數據庫，分析AT-hook基因家族成員的理化性質、基因結構、保守結構域和系統發(fā)育關系以及在12個組織中的表達特異性。結果表明：在花生基因組數據庫中鑒定得到64個AT-hook基因，染色體定位顯示這些基因在染色體上呈不均勻分布。系統發(fā)育樹分析表明花生AT-hook基因可分為8個亞群，多數基因都含有5?-UTR和3?-UTR。MEME數據庫顯示，花生AT-hook基因編碼的蛋白質包含6個保守的結構域，大多數AT-hook蛋白含有RGRP和PPC的基序。表達熱圖顯示，AT-hook基因在不同花生組織中呈現特定的表達模式，如arahy.BT3IUC、arahy.QUTE6V、arahy.8MM6DT、arahy.RIX96U和arahy.T2XHT6在根中高度表達，但arahy.EW3BSR和arahy.CSXK13分別在雌蕊和葉片中高豐度均勻轉錄。本研究結果為進一步闡明花生基因組中AT-hook基因的潛在分子功能提供理論參考。

關鍵詞：花生;AT-hook;生物信息學;基因家族

中圖分類號：S565.2 ? ? ?文獻標識碼：A

Bioinformatics Analysis of AT-hook Genes Family in Peanut （Arachis hypogaea L.）

HU Dongxiu1，2， LIU Hao2*， LIANG Xuanqiang2， WU Ziming1**， FANG Jiahai1**

1. Jiangxi Key Laboratory of Crop Physiology， Ecology and Genetic Breeding， Ministry of Education， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045， China; 2. Crops Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / South China Peanut Sub-Center of National Center of Oilseed Crops Improvement / Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： AT-hook genes not only play important roles in plant growth and development， organ construction， stress and hormone signal response， but also are transcription factor and auxiliary factor of chromatin remodeling to regulate gene transcriptional activity. In order to fully understand the structural characteristics of AT-hook family genes in peanut， we analyzed the physical and chemical properties， gene structure， phylogenetic relationship， protein conserved domain， and expression specificity of AT-hook genes in twelve tissues utilizing bioinformatics technologies to blast peanut genome database. Totally， 64 AT-hook genes were identified in the peanut genome， and chromosome location displayed that these genes were unequally distributed on the chromosome. Phylogenetic tree viewer indicated that AT-hook genes cpuld be divided into eight subgroups， and most of them contained 5?-UTR and 3?-UTR. MEME database exhibited that AT -hook genes encoded proteins containing six conserved domains， majority of the AT-hook proteins harboured the motifs of RGRP and PPC. Expression heatmap showed that AT-hook genes presented specific expression pattern in different peanut tissues， such as arahy. BT3IUC， arahy. QUTE6V， arahy. 8MM6DT， arahy. RIX96U and arahy. T2XHT6 highly expressed in the root， but arahy. EW3BSR and arahy. CSXK13 homogeneously transcribed with high abundances in the pistil and leaf， respectively. Collectively， the results would provide a theoretical reference for further illustrating the potential molecular functions of AT-hook genes in peanut genome.

Keywords： peanut; AT-hook; bioinformatics analysis; gene family

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.005

AT-hook是一種小型的DNA結合蛋白基序，最早是在高遷移率組蛋白染色體基因HMG-I（Y）中發(fā)現的，其主要以精氨酸（Arg）-甘氨酸（Gly）-精氨酸（Arg）-脯氨酸（Pro）即RGRP作為核心的保守基序[1]。根據序列保守性和DNA親和力的大小，可將AT-hook分為3類，Ⅰ型是RGRP基序下游第2位為甘氨酸殘基;Ⅱ型是C端第2位為賴氨酸，代替了Ⅰ型中的甘氨酸;Ⅲ型兼具了Ⅰ型和Ⅱ型的一些共同點，在RGRP基序C端存在賴氨酸和一個極性氨基酸且第4位是賴氨酸殘基。不同類型的AT-hook基序結合DNA的能力有所不同，與DNA結合的親和性通常為Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型[2]。擬南芥中AT-hook蛋白含有AT-hook基序和PPC（plants and prokaryotes conserved）基序，該類蛋白常定位于細胞核，因此又被稱為AHL蛋白（AT-hook motif nuclear localized protein）[3-4]。PPC結構域是核定位不可缺少的信號，長度約為120個氨基酸，廣泛存在于細菌和古細菌中，但是在單獨含有PPC結構域的蛋白質中并未發(fā)現AT-hook基序，因此PPC結構域在進化上是高度保守[5]。目前，AHL蛋白在已測序的植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、玉米（Zea mays）等物種內均有發(fā)現[3， 5-7]。模式植物擬南芥[3]、水稻[5]和番茄[6]中分別含有29個、45個和32個AHL蛋白。

AHL蛋白不僅在植物生長發(fā)育、防御反應、逆境脅迫和激素信號傳導中發(fā)揮重要作用，還可以作為轉錄因子的輔助因子，調節(jié)特定基因的轉錄活性。例如，擬南芥AHL22通過調節(jié)FT和PIF4的表達來調控制植株開花與下胚軸伸長，AHL22的過表達導致開花延遲，敲除突變體則下胚軸伸長[8-9]。AtAHL25調控赤霉素基因GA3ox1的表達影響GA3氧化酶的活性，進而通過赤霉素信號途徑影響植物的生長發(fā)育[10]。AHL4通過抑制參與三酰甘油（triacylglycerol，TAG）水解和脂肪酸氧化特定基因的表達，調節(jié)種子萌發(fā)和幼苗形成過程中的脂質降解[11]。AtAHL15的異位表達抑制腋芽生分生組織（AM，axillary meristem）發(fā)育，并促進開花植物頂端分生組織不斷生長[12]，相關研究表明AT-hook作為轉錄因子，可以通過拮抗光敏色素相互作用因子（PIFs）所介導的生長和激素相關基因的轉錄激活，從而抑制葉柄生長途徑[13]。此外，AT-hook轉錄因子也參與植物免疫應答反應以及器官建成，AtAHL20過表達的植物中產生一種具有毒性的新型細菌，可參與調節(jié)植物免疫反應[14]。辣椒的CaATL1（Bukang AT-hook-like gene 1）過表達轉基因植株對細菌和卵菌等病原菌具有抗性[15]。水稻中DP1能夠促進內穎的形成和花器官數目的增加[16]，棉花GhAT1蛋白負調控毛狀體中的非纖維組織中的纖維特異基因FSltp4啟動子，參與棉花纖維的發(fā)育[17]。由此可見，AT-hook基因在植物的整個生長發(fā)育過程中都起了重要的調控作用。

花生（Arachis hypogaea L.）是異源四倍體豆科植物，也是世界范圍內廣泛種植的經濟作物與油料作物。相對于模式植物，花生功能基因組的研究技術與方法依舊存在諸多缺陷，但是隨著花生栽培種全基因組測序工作的完成[18]，利用生物信息學方法從基因組水平上鑒定基因家族、挖掘功能基因為研究基因功能等提供了更加方便和快捷的手段。目前對花生AT-hook基因家族的研究還未見報道，本研究通過生物信息學的相關技術對花生基因組數據庫中AT-hook基因家族成員進行理化性質、基因結構、保守結構域和系統發(fā)育關系以及組織特異性分析，為花生AT-hook基因家族的功能分析提供基礎信息，以期為花生AT-hook蛋白功能的深入研究提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?花生AT-hook基因家族成員的鑒定

首先利用花生基因組數據庫（Peanutbase.org）的Genefamily搜索功能，輸入關鍵詞AT-hook，檢索AT-hook家族成員;并從擬南芥數據庫下載AT-hook基因家族29個成員的蛋白序列，以擬南芥29個AT-hook基因序列為檢索對象在花生基因組數據庫進行Blast Protein比對，獲得部分花生AT-hook的擬南芥同源基因，與此前通過關鍵詞檢索獲得的基因進行合并整理，去除冗余后共獲得了69個候選的AT-hook基因。利用Pfam和SMART（http：//smart.embl.de）數據庫對69個候選基因的蛋白序列結構域進行保守結構域鑒定，剔除不含有RGRP基序的蛋白序列，最終鑒定到了64個花生AHL蛋白。利用ExPasy網站與ProtParam tool工具分析得到AT-hook蛋白的氨基酸序列長度、分子量、等電點、蛋白質總平均親水性等理化性質。以花生基因組數據庫中公布的AHL基因染色體位置信息為基礎，利用MG2C（http：//mg2c.iask.in）在線軟件繪制基因的染色體定位圖。

1.2 ?花生AT-hook基因系統進化樹和基因結構分析

將64個花生AT-hook基因的蛋白序列輸入進化分析軟件MEGA 6.0，并結合Evolview在線軟件采用Neighbor Joining方法構建基因系統進化樹。隨后在花生基因組數據庫中下載AT-hook基因家族成員的基因組DNA序列和mRNA序列，并以mRNA序列為檢索對象在NCBI的ORFfinder在線網站檢索其CDS序列，基于基因組DNA序列和CDS序列，利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi. pku.edu.cn）分析其基因結構;利用MEME和NCBI的Conserved domains軟件在線分析基因保守結構域，并利用TBtools軟件進行基因結構可視化分析。

1.3 ?AT-hook基因在花生中的表達分析

從花生基因組數據庫中下載花生AT-hook基因家族成員在根、莖、葉、花、莢果、種子、根瘤、果殼、營養(yǎng)莖尖、生殖芽尖、雌蕊和雄蕊等12個組織轉錄組數據的FPKM值，基于其FPKM數據，運用TBtools軟件中的heatmap功能對AT-hook基因在不同器官組織中的表達量進行聚類、繪制熱圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?花生AT-hook基因家族成員的鑒定

利用Pfam和SMART對69個候選基因的蛋白序列結構域進行鑒定，剔除不含RGRP基序的蛋白序列，最終從花生基因組數據庫中共鑒定了64個花生AHL蛋白序列（表1）。利用ProtParam tool工具對這64個基因編碼的蛋白序列進行理化性分析發(fā)現，不同的AHL蛋白序列有較大的差異。氨基酸長度為117～1377 aa，多數氨基酸序列長度集中在180～420 aa;蛋白分子量集中在12.27～44.41 kDa;等電點為4.47～11.00，其中13個蛋白等電點小于7，偏酸性，其余蛋白等電點均大于7，偏堿性;花生AHL蛋白不穩(wěn)定指數大多數大于40;蛋白質總平均親水性為–1.29～0.004;在花生基因組數據庫中預測其功能時發(fā)現，多數花生AHL蛋白除含有保守的RGRP基序外，還含有PPC結構域。

在花生基因組數據庫中獲取了花生AT-hook基因的位置信息，利用MG2C在線軟件繪制基因的染色體定位圖。從圖1中可以看出，花生AT-hook基因在花生的不同染色體上呈不均勻分布，在17號染色體上分布最多，含有7個基因，其次是3號、5號、13號和15號染色體，均含有5個AT-hook基因，而20號染色體上分布為0。

2.2 ?花生AT-hook基因進化分析

為了更好地了解花生AT-hook基因家族系統進化關系，利用MEGA 6.0軟件采用Neighbor Joining方法對花生和擬南芥的AHL蛋白序列構建系統進化樹（圖2）。結果表明：花生AT-hook基因可分為8個亞群，AT-hook基因家族成員并未因物種差異而單獨聚為一類，說明花生與擬南芥的AT-hook基因家族成員具有一定的同源性，在各分支內的AHL蛋白各自聚類，說明AT-hook基因家族在進化上出現了很大的分化。

2.3 ?花生AT-hook基因結構分析

花生AT-hook基因家族成員基因結構分析顯示（圖3），不同AT-hook基因的結構存在很大的差異。例如，arahy.H7KX2Z、arahy.25KDWJ和arahy.6X9KLT等9個基因只含有1個外顯子，無內含子和非翻譯區(qū)，屬于單外顯子基因。arahy.NG49FS、arahy.QUTE6V和arahy.BT3IUC等3個基因含有1個外顯子和非翻譯區(qū)，無內含子。arahy.CC1FIV有2個外顯子，1個內含子，無非翻譯區(qū)。arahy.649GVM、arahy.DRN59F和arahy.NUW6LV等9個基因3?端無非翻譯區(qū)。其余基因兩端均含有非翻譯區(qū)，但基因結構也存在明顯的差異，有的基因（如arahy.2Z77FC、arahy.7X1Y1S和arahy.H8H77X等）含有2個外顯子，1個內含子，而有的基因（如arahy.WFL2XE、arahy.G8H5C8和arahy.T4KAXF）則多達15個外顯子，14個內含子。

2.4 ?花生AT-hook基因保守結構域分析

利用MEME在線軟件結合TBtools軟件[19]對花生AT-hook基因保守結構域進行可視化分析，共鑒定了6個保守結構域，所有基因均含有AT-hook保守基序，這與之前的分析結果保持一致。從圖4可見，不同基因含有AT-hook基序的數量不同，大部分基因含有1～4個，arahy.58UXC0有5個，arahy.7T6UUP、arahy.DY9A0E和arahy.5E7A70有6個，arahy.0WKN8B有7個。花生64個AT-hook基因中有37個含有PPC結構域，其中arahy.WDJ6GM含有2個PPC，其余均含有1個。含有Motif5的基因均含有3個以上AT-hook結構域且不含其他結構域。arahy.CC1FIV、arahy.KDAIJ3、arahy.DRN59F、arahy.EW3BSR、arahy.TSWN09和arahy.NUW6LV等6個基因僅含有AT-hook結構域。推測具有不同保守結構域的成員在進化和功能上可能存在差異。

2.5 ?花生AT-hook基因組織表達

為了進一步解析花生AT-hook基因家族成員的功能，從花生基因組數據庫中共獲得62個AT-hook基因在根、莖、葉、花、莢果、種子、

根瘤、果殼、營養(yǎng)莖尖、生殖芽尖、雌蕊和雄蕊等12個組織轉錄組數據的FPKM值，進行組織表達模式分析。結果表明（圖5），花生AT-hook基因的表達呈現組織特異性。大多數基因在根、營養(yǎng)莖尖和生殖芽尖都具有較高的表達量，其次是莢果和種子，在莖、花和雌蕊中的表達量較低。例如，arahy.QUTE6V、arahy.12UU0E、arahy. B0RN30和arahy.BT3IUC等基因在根中的有較高的表達量，其中arahy.B0RN30、arahy.BT3IUC、arahy.Z4FMKE和arahy.8MM6DT四個基因在根瘤中也呈現出高表達，在其他組織中的表達量相對較低。而arahy.NUW6LV、arahy.XN3VW8、arahy. DRN59F、arahy.UEVJ5G和arahy.CY9PQR等基因在種子中具有高表達，其中arahy.XN3VW8和arahy.DRN59F分別在莖和果殼中也呈現了高表達量。arahy.609EQ8、arahy.U4QFTB和arahy. H7KX2Z在莢果中表達量最高。arahy.EW3BSR和arahy.TSWN09在雌蕊中表達量較高，而arahy.CSXK13和arahy.RHY2RN則在葉片中呈現較高表達量。表明AT-hook基因在花生的不同組織器官中存在特異性表達。

3 ?討論

對花生AT-hook基因家族成員理化性分析發(fā)現，不同的AHL蛋白序列有較大的差異，氨基酸長度為117～1377 aa，多數AHL蛋白等電點大于7，表明這類基因的編碼蛋白富含堿性氨基酸，少數等電點小于7，偏酸性，在堿性亞細胞環(huán)境中發(fā)揮的作用較小?；ㄉ鶤HL蛋白不穩(wěn)定指數大多數大于40，根據不穩(wěn)定參數值在40以下是穩(wěn)定蛋白的標準，表明花生的AHL蛋白穩(wěn)定性相對較差，屬于不穩(wěn)定蛋白;蛋白質總平均親水性為–1.29～0.004，說明花生AHL蛋白是一類相對親水的蛋白質。從基因的染色體定位圖發(fā)現除20號染色體外，其余染色體上均有AT-hook基因的分布且呈隨機不均勻分布，這與許多基因在染色體上呈不均勻分布相似。由于內含子的不斷插入使其基因結構存在一定的差異，有的基因僅含有1個外顯子，有的則多達15個，花生部分AT-hook基因在5?末端和3?末端不含非翻譯區(qū)?；ㄉ鶤T-hook基因編碼的蛋白質包含6個保守的結構域，大多數AT-hook蛋白含有RGRP和PPC的基序，不同基因含有的保守結構域數量不同，推測花生AT-hook基因家族成員具有不同保守結構域的成員在進化和功能上可能存在差異。

花生AT-hook基因主要在特定的組織和器官中表達，可能在這些組織或器官的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。arahy.BT3IUC、arahy.QUTE6V和arahy.8MM6DT等基因在根中的表達量顯著高于其他組織，說明這些基因主要參與了花生根的生長發(fā)育。arahy.CSXK13和arahy.RHY2RN在葉片中呈現高表達量，在擬南芥中AtAHL27基因過量表達可降低葉片衰老基因的表達水平，提高光合效率和葉綠素含量以延緩植物葉片的衰老[20-22]，推測arahy.CSXK13和arahy.RHY2RN可能參與了花生葉片衰老調控。arahy.EW3BSR和arahy. TSWN09在雌蕊中表達量較高，這2個基因與AtAHL18同源性較高，在擬南芥中沉默AtAHL18可促進提早開花，說明這2個基因可能與花生的開花調控有關。結合基因結構域分析發(fā)現，大部分含有AT-hook基序和PPC結構域的基因有明顯的組織特異性，而不含AT-hook基序和PPC結構域的基因在組織表達中差異不明顯，表明AT-hook基序和PPC結構域在花生特定的組織中可能存在某種特定的功能，這需要進一步深入研究。

AHL蛋白是一類DNA結合蛋白，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用。目前，AT-hook基因家族在擬南芥、水稻、大豆、番茄和玉米等多種植物中已有研究[5-8， 23-24]，花生作為我國重要的油料經濟作物之一，至今關于其AT-hook基因家族的研究仍缺乏報道。該研究從基因組水平上對花生AT-hook基因家族進行了較系統的生物信息學分析，包括蛋白的理化性分析、編碼基因在染色體上的分布、系統進化和組織表達模式等，為進一步研究花生AT-hook家族基因的功能及機制提供了重要的依據。

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責任編輯：黃東杰

收稿日期 ?2020-05-19;修回日期 ?2020-06-16

基金項目 ?廣東省自然科學基金面上項目（No. 2020A1515010021）。

作者簡介 ?胡冬秀（1997—），女，碩士研究生，研究方向：花生功能基因;*同等貢獻作者：劉 ?浩（1988—），男，博士，助理研究員，研究方向：花生功能基因。**通信作者（Corresponding author）：吳自明（WU Ziming），E-mail：wuzmjxau@163.com;方加海（FANG Jiahai），E-mail：fjh-86@163.com。