張 君，霍志鵬，張依倩，王 玉，4，何 毅*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617； 2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開(kāi)發(fā)中心，天津 300410； 3.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410； 4.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

中風(fēng)回語(yǔ)顆粒用于治療缺血性腦中風(fēng)引起的痰瘀阻絡(luò)癥，源自國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)，由石菖蒲、酒大黃、膽南星、冰片、黃連、遠(yuǎn)志、川芎、郁金、土鱉蟲(chóng)九味中藥組成［1］，具清熱化痰、活血通絡(luò)、開(kāi)竅之功效，其散劑作為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑已在臨床應(yīng)用十余年［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，中風(fēng)回語(yǔ)顆粒具有抗氧化、抗炎、減輕腦水腫、抗凝血等作用［2-4］。目前已獲得臨床批件，處于臨床Ⅱ期研究階段，其相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由方中黃連、遠(yuǎn)志、酒大黃、冰片的鑒別及鹽酸小檗堿的含量測(cè)定組成，但針對(duì)中風(fēng)回語(yǔ)顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)尚無(wú)全面系統(tǒng)研究。

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛用于中藥材及中成藥的定性分析。中風(fēng)回語(yǔ)顆粒由九味中藥組成，基質(zhì)復(fù)雜，含量不均一，黃連藥材的生物堿類(lèi)成分在該制劑中含量較高，在LC-MS 鑒定中，生物堿類(lèi)成分峰響應(yīng)值偏高，導(dǎo)致其他成分響應(yīng)差，檢出成分?jǐn)?shù)量偏少。因此，去除或減少樣品中含量多的成分，可減少共出峰物對(duì)離子的抑制作用，增加峰容量，以提高色譜分辨率。固相萃取是對(duì)樣品成分富集的有效方式，具有較高的選擇性，本研究在中風(fēng)回語(yǔ)顆粒提取物的基礎(chǔ)上，采用PCX-SPE 分離富集，截留生物堿類(lèi)成分，結(jié)合LCMS-IT-TOF 技術(shù)對(duì)提取物及分離富集物峰指認(rèn)及信息歸屬，對(duì)比分析固相萃取前后成分變化，以期為含黃連復(fù)方中藥的LC-MS 成分鑒定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LCMS-IT-TOF 型液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（日本島津公司，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、二元梯度泵、柱溫箱和PDA 檢測(cè)器）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-500DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI有限公司）；PCX-SPE 柱（500 mg/6 ml，Agela 科技）。

1.2 試藥 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒（批號(hào)20190301，天士力研究院自制）；石菖蒲（批號(hào)20190101）、郁金（批號(hào)20190102）、遠(yuǎn)志（批號(hào) 20190501）、黃連（批號(hào)20190103）均購(gòu)自安徽省永香中藥飲片有限公司；酒大黃（批號(hào)20190201）購(gòu)自河北藺氏盛泰；川芎（批號(hào)1810001）天士力現(xiàn)代中藥資源公司提供；土鱉蟲(chóng)（批號(hào)20190402）購(gòu)自安徽賀林；膽南星（批號(hào)20190101）購(gòu)自四川輔正藥業(yè)股份有限公司，藥材均經(jīng)過(guò)天士力研究院霍志鵬中級(jí)工程師鑒定和天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司檢測(cè)，均符合2015 年版《中國(guó)藥典》一部項(xiàng)下要求。碘化木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)10112703）購(gòu)自天津一方科技有限公司；黃連堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-12111602）購(gòu)自成都曼思特生物技術(shù)有限公司；鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)110733-201007）、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)110732-200506）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201814）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào) 110757-201607）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào) 110795-200806）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)110756-201913）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)110796-201922）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)110758-201415）、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品（批號(hào)111849-201705）、3，6′-二芥子?；崽菍?duì)照品（批號(hào) 111848-201303）、遠(yuǎn)志酮 Ⅲ對(duì)照品（批號(hào)111850-201705）、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 對(duì)照品（批號(hào)111826-201806）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；β-細(xì)辛醚對(duì)照品（天士力研究院自制），α-細(xì)辛醚對(duì)照品（批號(hào)L1913066）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈（質(zhì)譜純，德國(guó)默克公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；冰乙酸（色譜純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取中風(fēng)回語(yǔ)顆粒，研細(xì)，稱(chēng)取約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱(chēng)定重量，超聲提取 30 min（功率 250 W，頻率 40 kHz），冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液Ⅰ。依次用5 ml 甲醇和5 ml 水活化PCX-SPE 柱，準(zhǔn)確移取10 ml 供試品溶液Ⅰ上柱，收集流出液，依次用水、50%甲醇水、甲醇各5 ml 淋洗PCX-SPE 柱，收集各淋洗液，流出液與各淋洗液合并，濃縮至干，用1 ml 甲醇復(fù)溶，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液Ⅱ。

2.2 單味藥材溶液的制備 取石菖蒲、郁金、川芎、黃連、酒大黃、遠(yuǎn)志、土鱉蟲(chóng)、膽南星各藥材粉碎，稱(chēng)取適量，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，為各單味藥材溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取碘化木蘭花堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液Ⅰ。取大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、3，6′-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志酮 Ⅲ、歐當(dāng)歸內(nèi)酯 A、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.4 色譜條件 Dimonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相 A 為 20.02 mmol/L 乙酸銨-0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，按照表1 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，柱溫 30 ℃，流速 1 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl。

2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子分別檢測(cè)，掃描范圍為m/z 100～1000，采用三氟醋酸鈉作為校正液，檢測(cè)電壓1.7 kV，霧化氣體積流量1.5 L/min，曲型脫溶劑裝置（CDL）溫度200 ℃，離子累積時(shí)間50 ms，毛細(xì)管電壓-3.5 kV（負(fù)離子），4.5 kV（正離子），誘導(dǎo)碰撞解離能（CID）50%，柱后分流，分流比 1∶3。

表1 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與分析

3.1 鑒定結(jié)果 根據(jù)化合物準(zhǔn)確分子質(zhì)量及碎片離子信息，對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ進(jìn)行分析，分別鑒定出33 和71 個(gè)化學(xué)成分，其中11 個(gè)化學(xué)成分包括蔗糖、沒(méi)食子酸、阿魏?；鼘幩岙悩?gòu)體、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、羧基大黃酚-O-葡萄糖苷、遠(yuǎn)志酮 Ⅲ、蟲(chóng)漆酸D、大黃素-8-O-葡萄糖苷/大黃素-1-O-葡萄糖苷、小檗堿、大黃素、Magnosalicin 是兩種提取方式共同鑒定的，如圖1 所示。中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ的正負(fù)離子模式下總離子流圖分別見(jiàn)圖2 與圖3。各化合物通過(guò)藥材圖譜與文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照進(jìn)行了歸屬確認(rèn)。鑒定結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

圖1 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ化學(xué)成分分析的韋恩圖

3.2 生物堿類(lèi)成分 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中生物堿類(lèi)成分較多，共鑒定出23 個(gè)生物堿成分，主要來(lái)自于黃連，其裂解方式主要是母核一般不會(huì)裂解，僅有小分子取代基的裂解與丟失。

圖2 中化合物11 保留時(shí)間為15.78 min，正離子模式下檢測(cè)到分子離子峰為342.168 9［M］+，丟失C2H7N形成 m/z 297［M-C2H7N］+，然后脫去甲基形成 m/z 282［M-C2H7N-CH3］+，脫羥基形成 m/z 265［M-C2H7NCH3-OH］+，進(jìn)一步脫去羰基形成 m/z 237［M-C2H7NCH3-OH-CO］+，根據(jù)文獻(xiàn)［26］報(bào)道鑒定此化合物為木蘭花堿。

圖3 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅱ正離子模式（C）和負(fù)離子模式（D）的總離子流

圖2 中化合物29 保留時(shí)間為29.12 min，正離子模式下檢測(cè)到分子離子峰為m/z 336.120 9［M］+，脫甲基形成 m/z 321［M-CH3］+、320［M-CH3-H］+碎片離子，側(cè)鏈環(huán)合成五元含氧雜環(huán)，進(jìn)一步脫去CO，形成m/z 293［M-CH3-CO］+、292［M-CH3-H-CO］+碎片，裂解規(guī)律如圖4 所示，根據(jù)對(duì)照品比對(duì)和文獻(xiàn)［26］報(bào)道鑒定此化合物為小檗堿。

3.3 蒽醌類(lèi)成分 從中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中鑒定了14 個(gè)蒽醌類(lèi)成分，以游離或者苷類(lèi)形式存在，蒽醌類(lèi)化合物來(lái)自于酒大黃。結(jié)合型蒽醌在電噴霧電離下容易失去糖基離子，游離型蒽醌在高能碰撞下易脫去CO、CO2、CH3等碎片離子。

表2 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅰ化學(xué)成分分析

續(xù)表2 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅰ化學(xué)成分分析

圖3 中化合物39 的保留時(shí)間為28.51 min，正離子模式下檢測(cè)到分子離子峰為m/z 439.098 0［M+Na］+，脫去一分子葡萄糖形成255［M+H-Glc］+的碎片離子，負(fù)離子模式下檢測(cè)到分子離子峰為415.103 7［M-H］-，脫去一分子葡萄糖，形成253［M-H-Glc］-的碎片離子，參照文獻(xiàn)［7］裂解規(guī)律鑒定此化合物為大黃酚-O-葡萄糖苷。

圖3 中化合物58 為的保留時(shí)間為48.41 min，負(fù)離子模式下檢測(cè)到分子離子峰為m/z 269.046 8［M-H］-，脫去一分子CO，形成241［M-H-CO］-的碎片離子，脫去一分子 CO2形成 225［M-H-CO2］-，相繼脫去一分子甲基形成210［M-H-CO2-CH3］-的碎片離子，裂解規(guī)律如圖5 所示，根據(jù)對(duì)照品比對(duì)和文獻(xiàn)［7］報(bào)道鑒定此化合物為大黃素。

圖4 小檗堿裂解途徑

圖5 大黃素裂解途徑

表3 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅱ化學(xué)成分分析

續(xù)表3 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅱ化學(xué)成分分析

續(xù)表3 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒供試品溶液Ⅱ化學(xué)成分分析

3.4 糖酯類(lèi)成分 中風(fēng)回語(yǔ)顆粒所含的藥材遠(yuǎn)志中含有遠(yuǎn)志糖酯類(lèi)化學(xué)成分，從中鑒定了6 個(gè)糖酯類(lèi)化合物，該類(lèi)成分主要發(fā)生糖苷鍵裂解或芥子?；鶃G失。

圖2 中化合物6 的保留時(shí)間為11.68 min，分子離子峰為m/z 571.163 9［M+Na］+，脫去一分子葡萄糖與水形成 m/z 369［M+H-C6H10O5-H2O］+的碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道推測(cè)出該化合物為西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6。

圖3 中化合物27 的保留時(shí)間為20.81 min，在負(fù)離子模式下檢測(cè)到分子離子峰m/z 681.201 8［M-H］-，相繼脫去一個(gè)芥子?；?、甲基與羥基形成m/z 443［MH-sinapoyl-CH3-OH］-，根據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道鑒定此化合物為遠(yuǎn)志蔗糖酯A。

3.5 酮類(lèi)成分 從中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中鑒定出8 個(gè)酮類(lèi)成分，其中酮類(lèi)成分主要來(lái)自于遠(yuǎn)志，該類(lèi)成分在正離子模式下二級(jí)碎片離子中常出現(xiàn)419、317、287 等碎片離子。

圖3 中化合物15 的保留時(shí)間為16.53 min，正離子模式下檢測(cè)到m/z 569.151 9［M+H］+，二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z 419［M+H-C5H10O5］+、401［M+H-C5H10O5-H2O］+、383［M+H-C5H10O5-H2O-H2O］+、317［M+H-C5H7O4-C7H4O2］+，287［M+H-C5H7O4-C7H4O2-CH2O］+等碎片離子。負(fù)離子模式下檢測(cè)到m/z 567.135 5［M-H］-，二級(jí)碎片含有m/z 345［M-H-Api-C3H4O2］-、315［M-H-Api-C4H6O3］-，裂解規(guī)律如圖6 所示，根據(jù)對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)報(bào)道［8］鑒定此化合物為遠(yuǎn)志酮Ⅲ。

圖6 遠(yuǎn)志口山酮 Ⅲ裂解途徑

3.6 內(nèi)酯類(lèi)成分 從中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中鑒定出12 個(gè)內(nèi)酯類(lèi)成分，主要來(lái)自于川芎。此類(lèi)成分在正離子模式下響應(yīng)較好。

圖3 中化合物65 的保留時(shí)間為53.63 min，正離子模式下檢測(cè)到分子離子峰m/z 209.115 6［M+H］+，推測(cè)其分子式為C12H16O3，脫去一分子甲基形成m/z 194［M+H-CH3］+，脫去一分子 CO 形成 m/z 181［M+H-CO］+，脫去一分子 C4H8與 H2O 形成 m/z 135［M+H-H2O-C4H8］+的碎片，因此推測(cè)此化合物為洋川芎內(nèi)酯K。

圖3 中化合物64、69 在正離子模式下檢測(cè)到分子離子峰 m/z 398.23［M+NH4］+、381.21［M+H］+，二級(jí)質(zhì)譜中均出現(xiàn) m/z 191［C15H12O2］+的碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)［13］報(bào)道和對(duì)照品比對(duì)推測(cè)出化合物64 和69 分別為雙藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 的裂解途徑如圖7 所示。

圖7 歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 裂解途徑

3.7 苯丙素類(lèi)成分 從中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中共鑒定出20個(gè)苯丙素類(lèi)成分，包括簡(jiǎn)單苯丙素類(lèi)與木脂素類(lèi)成分。

木脂素類(lèi)成分：圖3 中化合物12 的保留時(shí)間為14.30 min，在正離子模式下檢測(cè)到m/z 540.245 3［M+NH4］+、545.191 6［M+Na］+，在電噴霧電離下形成 m/z 219［M+H-Glc-C7H10O3］+的碎片離子，負(fù)離子模式下檢測(cè)到m/z 521.191 6［M-H］-，脫去一分子的葡萄糖形成 m/z 359［M-H-Glc］-，之后脫去 CH3形成 m/z 344［M-H-Glc-CH3］-的碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道鑒定此化合物為Isolarisiresinol-O-glucoside/Lariciresinol-O-glucoside。

圖3 中化合物66 的保留時(shí)間為54.59 min，在正離子模式下檢測(cè)到 m/z 434.254 8［M+NH4］+、417.238 6［M+H］+，在電噴霧電離下形成 m/z 249［M+H-C9H12O3］+、209［C12H17O3］+、181［C10H13O3］+的碎片離子。裂解規(guī)律如圖8所示，根據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道鑒定此化合物為Diasarone I，此化合物來(lái)自于石菖蒲。

圖8 Diasarone I 裂解途徑

簡(jiǎn)單苯丙素類(lèi)成分：圖2 中的化合物5、7、8 在負(fù)離子模式下均檢測(cè)到分子離子峰m/z 367.10［M-H］-，推測(cè)其結(jié)構(gòu)式為C17H20O9，二級(jí)碎片離子中檢測(cè)到m/z 193［ferulic acid-H］-、161［ferulic acid-H-OH-CH3］-、133［ferulic acid-H-CH3-COOH-H］-等碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6，13］鑒定化合物為阿魏?？鼘幩峒捌洚悩?gòu)體。

此外本研究還鑒定出4 個(gè)鞣質(zhì)類(lèi)、1 個(gè)三萜皂苷類(lèi)、1 個(gè)糖類(lèi)、1 個(gè)膽酸類(lèi)、3 個(gè)其他類(lèi)成分。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，首先采用水-乙腈、0.05%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)黃連生物堿色譜峰分離度較差，改用離子對(duì)試劑20.02 mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸水溶液作為A 相流動(dòng)相，乙腈為B相流動(dòng)相，各色譜峰分離度理想［11］。前期研究發(fā)現(xiàn)中風(fēng)回語(yǔ)顆粒中所含的部分生物堿類(lèi)成分濃度過(guò)大，殘留于質(zhì)譜系統(tǒng)，導(dǎo)致部分成分難以檢測(cè)。因此中風(fēng)回語(yǔ)顆粒樣品前處理時(shí)采用PCX-SPE 柱對(duì)提取液分離富集。

本研究首次采用甲醇提取與PCX-SPE 結(jié)合LCMS-IT-TOF 的方法系統(tǒng)地分析了中風(fēng)回語(yǔ)顆粒所含的化學(xué)成分，共鑒定出93 個(gè)化學(xué)成分，主要有生物堿類(lèi)、苯丙素類(lèi)、蒽醌類(lèi)、酮類(lèi)、糖酯類(lèi)等成分，生物堿類(lèi)成分大多數(shù)來(lái)自于黃連；蒽醌類(lèi)成分來(lái)自于酒大黃；酮類(lèi)、糖酯類(lèi)成分來(lái)自于遠(yuǎn)志。據(jù)文獻(xiàn)［5，14，16］報(bào)道，這些成分具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等藥理作用，對(duì)缺血性腦中風(fēng)具有明顯的改善作用。這為中風(fēng)回語(yǔ)顆?；瘜W(xué)成分的定性分析提供了一種快速、高效的分析方法，豐富了該復(fù)方的化學(xué)成分信息，并為中風(fēng)回語(yǔ)顆粒活性成分篩選、作用機(jī)制探討、質(zhì)量控制研究及安全性評(píng)價(jià)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)支持。同時(shí)，此思路對(duì)中藥材及中成藥復(fù)雜體系的化學(xué)成分解析提供了一種方法參考，多種分離技術(shù)和LC-MS 技術(shù)的結(jié)合將有助于進(jìn)一步擴(kuò)展LC-MS 方法的鑒別容量與應(yīng)用范圍。