商丹丹，李 旭，郝 迪，王 蕾，劉 淑

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617； 2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，天津 300457； 3.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

心腎綜合征是心臟或腎臟由于急性或慢性功能障礙而導(dǎo)致另一器官急性或慢性功能損傷的臨床綜合征，多以難糾正的心力衰竭或腎功能衰竭為特點(diǎn)［1-2］。中醫(yī)認(rèn)為慢性心臟衰竭發(fā)展到終末期與心、腎兩臟關(guān)系最為緊密［3-4］。臨床研究顯示，從補(bǔ)氣溫陽(yáng)角度實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的治療，從而能夠延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程［5］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)驗(yàn)性CRS 動(dòng)物模型作為研究對(duì)象，采用“益氣溫陽(yáng)、活血利水”法代表方參附強(qiáng)心丸作為受試藥物，求證了該藥調(diào)控心腎細(xì)胞自噬作用來(lái)延緩心腎共損疾病的發(fā)展進(jìn)程。

1 材料

1.1 儀器 電子天平（BSA124S-CW Sartorius 公司，德國(guó)），移液槍（Eppendorf 公司，法國(guó)），微量加樣吸頭（北京中衫金橋生物有限公司），－80 ℃低溫冰箱（青島海爾），4 ℃低溫冰箱（青島海爾），高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠），轉(zhuǎn)移脫色搖床NMYC-60（泰州諾米醫(yī)療科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑 參附強(qiáng)心丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，藥品規(guī)格：鋁塑薄膜袋，密封包裝，陰涼干燥貯藏，每袋裝2.7 g，批號(hào)7668002；大黃素和大黃分含量不得少于0.21 mg/g；有效期18 個(gè)月）；雷帕霉素（1 g，源葉生物，批號(hào) H12J10J79598）；大鼠血管 緊 張 素 轉(zhuǎn) 換 酶 ELISA 試 劑 盒（SAB，EK1009，9J281l）；精氨酸加壓素 ELISA 試劑盒（SAB，EK2822，9J281l）；甲 狀 腺 素 ELISA 試 劑 盒（SAB，EK1787，9J281l）；細(xì)胞裂解液試劑盒（碧云天，產(chǎn)品編號(hào)：P00138）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，碧云天，產(chǎn)品編號(hào)：P0010）；5X 蛋白上樣緩沖液（碧云天，產(chǎn)品編號(hào)：P0015）；Western 一抗稀釋液（碧云天，產(chǎn)品編號(hào) ：P0023A）；Beclin -1 抗 體 （ABcloned， 批 號(hào)3507223001）；MAPLC3B 抗體（SAB，批號(hào) 6N26）；山羊抗兔抗體（博士德，批號(hào)201806）；山羊抗鼠抗體（博士德，批號(hào)201806）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（萬(wàn)類生物，批號(hào) 17122220）。

1.3 動(dòng)物 SD 種大鼠，60 只，雄性，體重 220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。購(gòu)入后動(dòng)物活動(dòng)正常，毛發(fā)柔順，飲食、飲水均正常。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥 采用腹主動(dòng)脈縮窄合并腎臟急性缺血再灌注損傷制備心腎綜合征大鼠模型［6］。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射45 mg/kg 麻醉后，行腹部正中切開(kāi)，沿腹白線進(jìn)入腹腔，暴露分離左、右側(cè)腎蒂，阻斷結(jié)扎30 min 后，解除阻斷，恢復(fù)血流，造成急性缺血再灌注損傷。隨后暴露分離后腹膜，在左腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈。沿游離腹主動(dòng)脈長(zhǎng)軸置一折彎的7 號(hào)針頭，以3-0 的絲線繞腹主動(dòng)脈后與7 號(hào)針頭一起結(jié)扎，隨后立即抽出針頭，使腹主動(dòng)脈殘留直徑為0.7 mm 的殘腔，造成腹主動(dòng)脈狹窄。假手術(shù)組只分離肌肉、血管，但不縮窄。術(shù)后腹腔內(nèi)滴入青霉素預(yù)防感染，分層關(guān)閉腹腔。將造模后12 周將存活動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組（n=10）、模型對(duì)照組（n=10）、參附強(qiáng)心丸高劑量組（n=10；灌胃劑量為3.24 g/kg，相當(dāng)于臨床用量12 倍）、參附強(qiáng)心丸低劑量組（n=10；灌胃劑量為1.62 g/kg，相當(dāng)于臨床用量6 倍）和雷帕霉素組（n=10；灌胃劑量為2 mg/kg）。灌胃體積10 ml/kg，假手術(shù)組和模型組灌胃同體積飲用水。所有組別均從手術(shù)后8 周開(kāi)始給藥，1 次/d，持續(xù)4 周。參附強(qiáng)心丸和雷帕霉素均采用純凈水進(jìn)行配制，每天配制1 次。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清中血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素測(cè)定的影響 于末次給藥24 h 后大鼠經(jīng)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于3 500 r/min 離心10 min 后，取血清測(cè)定血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素的含量。

2.2.2 心室及腎臟重量指數(shù)的影響 取血完成后，分別將大鼠心臟及左腎臟取出，分離心室，稱量心室濕質(zhì)量、全心濕質(zhì)量、左腎臟濕質(zhì)量，計(jì)算心室指數(shù)、全心指數(shù)、左側(cè)腎臟指數(shù)。計(jì)算公式如下：心室指數(shù)=心室肌濕重/體質(zhì)量×100%，全心指數(shù)=全心肌濕重/體質(zhì)量×100%，左腎指數(shù)=左腎臟濕重/體質(zhì)量×100%。

2.2.3 心臟、腎臟LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá) 取血完成后，分別將大鼠心臟及左腎臟取出，分離心室和左腎，切半，一半凍存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)備用，采用蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）進(jìn)行測(cè)定。具體步驟：提取心室和左腎的總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，充分勻漿，取上清液加入緩沖液，加熱。取等量蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，7% 脫脂奶粉封閉后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1 h，洗滌，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑，顯影，定影，分析條帶光密度值。以目的條帶與內(nèi)參β-action 條帶的光密度值的比值作為衡量參數(shù)，分析LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá)量［7］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示。假手術(shù)組和模型對(duì)照組比較采用t 檢驗(yàn)，模型對(duì)照組與給藥各組之間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素測(cè)定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中血管緊張素（ACE）水平顯著增加，甲狀腺激素（fT3）及精氨酸加壓素（AVP）水平顯著降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，參附強(qiáng)心丸高劑量組大鼠血清中激素水平均明顯改善（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清血管緊張素、甲狀腺素和精氨酸加壓素含量測(cè)定結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠血清血管緊張素、甲狀腺素和精氨酸加壓素含量測(cè)定結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) ACE（ng/ml） fT3（pg/ml） AVP（pg/ml）假手術(shù) 10 0.086±0.020 2.214±1.114 2 532.468±1 442.549模型對(duì)照 7 0.432±0.184** 0.743±0.322** 517.236±203.246**參附強(qiáng)心丸高劑量 8 0.214±0.043# 1.871±0.386## 2 183.680±1 481.680##參附強(qiáng)心丸低劑量 8 0.280±0.080 1.415±0.439 1 665.222±1 157.243雷帕霉素（RP） 8 0.285±0.126 1.153±0.484 1 442.334±1 263.106

3.2 各組動(dòng)物心臟及腎臟重量指數(shù) 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠全心指數(shù)和左腎指數(shù)均顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明該模型方法對(duì)心腎組織病理的發(fā)生進(jìn)程均有影響。與模型對(duì)照組比較，參附強(qiáng)心丸高劑量組大鼠全心指數(shù)和左腎指數(shù)均降低顯著（P＜0.01，P＜0.05），說(shuō)明給藥后可明顯改善心肌肥厚，腎臟腫大的狀態(tài)。見(jiàn)表2。

3.3 心臟、腎臟LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組（Sham）比較，模型對(duì)照組（model）心腎組織中LC3的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），給予參附強(qiáng)心丸高劑量組后，心腎組織中LC3 的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.05）。而對(duì)于Beclin-1 的表達(dá)，心腎組織中的表達(dá)明顯不同，模型對(duì)照組心臟中的Beclin-1 表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)（P＜0.05），而腎臟中的 Beclin-1 的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），說(shuō)明在心腎同病的病理狀態(tài)下，Beclin-1 的調(diào)控在兩種組織中有所不同。給予參附強(qiáng)心丸高劑量（SFQX-H）組后，Beclin-1 的表達(dá)與假手術(shù)組相近，與模型對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。

表2 各組大鼠心臟腎臟組織重量指數(shù)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠心臟腎臟組織重量指數(shù)結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) 心臟指數(shù)（g/100 g） 腎臟指數(shù)（g/100 g）假手術(shù) 10 0.247±0.537 0.268±0.066模型對(duì)照 7 0.430±0.089** 0.341±0.034*參附強(qiáng)心丸高劑量 8 0.299±0.022## 0.268±0.022#參附強(qiáng)心丸低劑量 8 0.346±0.020# 0.310±0.042雷帕霉素（RP） 8 0.352±0.051# 0.323±0.070

圖1 各組大鼠心臟、腎臟LC3、Beclin-1 蛋白的表達(dá)結(jié)果

3 討論

心腎綜合征是心臟和腎臟由于一種器官急性或慢性功能不全而導(dǎo)致另一器官急性或慢性功能損害的臨床綜合征，以尿量顯著減少、頑固性水腫、喘憋不能平臥等為主要臨床表現(xiàn)，多以難糾正的心力衰竭或腎衰竭為其主要特點(diǎn)［8］。參附強(qiáng)心丸是天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠研制的國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有益氣助陽(yáng)，強(qiáng)心利水功效，臨床用于慢性心力衰竭，屬心腎陽(yáng)衰者治療藥物［9-10］。本實(shí)驗(yàn)旨在闡明“益氣溫陽(yáng)，活血利水”治法對(duì)心腎共損后治療機(jī)制與調(diào)控心腎組織細(xì)胞自噬通路有關(guān)。并為CRS 臨床用藥提供了重要的藥理學(xué)參考。

研究表明，肌體組織受到損傷后，會(huì)通過(guò)激活自噬或者凋亡來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)［11］。細(xì)胞中的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子［12］。mTOR 的活化狀態(tài)抑制細(xì)胞的自噬作用。Beclin-1 也是近年發(fā)現(xiàn)參與自噬調(diào)控的蛋白之一［13-15］，Beclin-1 表達(dá)的增加被認(rèn)為是一種應(yīng)激反應(yīng)，其作為自噬表達(dá)產(chǎn)物的變化反映了細(xì)胞代謝的異常，Beclin-1 也成為人工干預(yù)自噬活性的靶點(diǎn)之一。本研究采用參附強(qiáng)心丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性心腎綜合征大鼠模型進(jìn)行了調(diào)控細(xì)胞自噬作用機(jī)制的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥明顯改善模型大鼠心腎組織中自噬相關(guān)因子LC3 和自噬基因Beclin-1 的表達(dá)，這也進(jìn)一步詮釋參附強(qiáng)心丸在治療心腎共損疾病中的作用機(jī)制，明確揭示了“益氣溫陽(yáng)、活血利水”的方藥能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬以達(dá)到抑制心腎衰竭的作用。這為參附強(qiáng)心丸調(diào)控心腎組織細(xì)胞自噬作用治療機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)支持。