李曉軍 安 軼 黃李超 曾 為 盧孟柱

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

楊樹(shù)(Populus)是主要造林樹(shù)種之一，是目前再生生物資源和森林碳匯的重要組分，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。另外，楊樹(shù)生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、成材早、木材蓄積量大，且遺傳背景豐富、易于無(wú)性化擴(kuò)繁和遺傳轉(zhuǎn)化，成為木本植物研究的模式物種(Janssonetal.， 2007； Polleetal.， 2013)。隨著毛果楊(Populustrichocarpa)、胡楊(P.euphratica)、新疆楊(P.bolleana)、銀腺楊84K(P.alba×P.glandulosa‘84K’)全基因組測(cè)序的完成(Tuskanetal., 2006; Maetal., 2013; 2019; Huangetal., 2020)，為楊樹(shù)這一木本模式植物功能基因組的研究提供了基礎(chǔ)。對(duì)木本植物來(lái)說(shuō)，高大的樹(shù)體需要龐大的維管組織來(lái)支撐，同時(shí)運(yùn)輸水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。木材就是這些龐大的維管組織的產(chǎn)物，來(lái)源于維管形成層的活動(dòng)。所以了解維管形成層活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制及木質(zhì)部的分化是利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)木材材性進(jìn)行遺傳改良的基礎(chǔ)。但獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株的效率低、周期長(zhǎng)，這些限制阻礙了對(duì)木本植物木材相關(guān)基因功能的大規(guī)模高效率鑒定。因此，建立一種快速、便捷、高效的方法，用以揭示木材形成分子機(jī)制，變得尤為重要。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)可以避開(kāi)冗長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因過(guò)程，只需將目的基因?qū)虢M織或個(gè)體，不涉及再生過(guò)程，轉(zhuǎn)化之后直接進(jìn)行基因表達(dá)分析或表型鑒定，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、通量高的優(yōu)點(diǎn)，可作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的補(bǔ)充，特別適合應(yīng)用于植物自身或異源基因功能及代謝途徑的大規(guī)模遺傳研究，并且可對(duì)無(wú)性繁殖困難的木本植株及同源植物系統(tǒng)(Korolevaetal., 2005; Yooetal., 2007)進(jìn)行基因功能分析。近年來(lái)已有木本植物建立了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，用于品種的選育與開(kāi)發(fā)，基因槍轉(zhuǎn)化(Nowaketal., 2004; Fizreeetal., 2019)、PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Yooetal., 2007)、植物病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Kumagaietal., 1995)和基于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)(Yangetal., 2000; Simmonsetal., 2009)的轉(zhuǎn)化方法已成功應(yīng)用于梨(Pyruscommunis)(Spolaoreetal., 2001)、甜橙(Citrussinensis)(de Oliveiraetal., 2009)、白樺(Betulaplatyphylla)、剛毛檉柳(Tamarixhispida)、黃檗(Phellodendronamurense)(Zhengetal., 2012)、桑(Morusalba)(Wuetal., 2015)、桂花(Osmanthusfragrans)(Hanetal., 2016)、柿(Diospyroskaki)(Moetal., 2019)、蘋果(Malusdomestica)(Lvetal., 2019)等。在楊樹(shù)中，通過(guò)PEG介導(dǎo)法成功獲得了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的葉片原生質(zhì)體(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)； 通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法成功獲得了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的葉片表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞(Nowaketal., 2004)； 通過(guò)農(nóng)桿菌侵染技術(shù)獲得了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的葉片(Takataetal., 2012)和芽(Yangetal., 2009)，這都為木本植物的基因調(diào)控研究提供了快速可靠的技術(shù)支持。

然而，上述瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)只局限于原生質(zhì)體、離體的葉片或芽，不利于研究木本植物形成層活動(dòng)和木質(zhì)部分化相關(guān)基因的功能。因此，本研究以銀腺楊84K 1年生休眠莖段為材料，通過(guò)水培觀察，表明其具有典型的形成層活動(dòng)和木質(zhì)部分化。以人工增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eYGFP)基因作為報(bào)告基因，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透侵染莖段的轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)在形成層區(qū)域的外源基因表達(dá)，為木材形成和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的研究提供了一種快速、高效的轉(zhuǎn)化方法，以促進(jìn)木本植物木材形成機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年11月，在河北任丘中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所試驗(yàn)基地，采集1年生銀腺楊無(wú)性系84K休眠期枝條。截取直徑約1 cm、長(zhǎng)度約10 cm的莖段，封口膜包裹莖段兩端以防止失水，并低溫(4 ℃)保存。

1.2 載體構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定

構(gòu)建表達(dá)載體pK2GW7-eYGFP。首先根據(jù)Chin等(2018)所用載體克隆eYGFP表達(dá)序列35S-COR47-5′-UTR-eYGFP-HSP-T878(1 991 bp)，并通過(guò)酶切位點(diǎn)StuⅠ，使用同源重組方法將此序列構(gòu)建到pK2GW7載體中(pK2GW7載體由浙江農(nóng)林大學(xué)韓瀟博士惠贈(zèng))。引物為F1(5′-CTGACCCACAGA TGGTTAGAGAGGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAAT TT-3′)和R1(5′-GATGAGACCTGCCGCGTAGGTG TGTACAGATATATGTTGAATTATTGA-3′)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)后，在含壯觀霉素(50 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行PCR鑒定。鑒定引物為F2(5′-CAGATGGTTAGAGAGGTGAGACTTTT-3′)和R2(5′-GACCTGCCGCGTAGGTGTGTACAGATAT-3′)。鑒定成功后提取質(zhì)粒并利用凍融法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，并PCR鑒定。表達(dá)載體pK2GW7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞用于試驗(yàn)對(duì)照。

1.3 形成層活動(dòng)的觀察

將休眠莖段從低溫環(huán)境取出，將其垂直培養(yǎng)在水中。對(duì)水培0、5、10、15、20、25、30天的莖段1/2處進(jìn)行切片(40 μm，LEICA VT1200S)、20倍數(shù)顯微鏡下觀察形成層活動(dòng)(LEICA DM6)。培養(yǎng)條件為： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化操作

采用凍融轉(zhuǎn)化法，將pK2GW7質(zhì)粒和含eYGFP基因的雙元載體pK2GW7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，然后將農(nóng)桿菌于固體LB培養(yǎng)基(50 mg·L-1壯觀霉素)上培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度為28 ℃。挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)正確后按1∶100(V/V)的比例取活化菌液接種于200 mL YEB液體培養(yǎng)基(50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1壯觀霉素)中，并置于28 ℃、200 r·min-1搖床內(nèi)過(guò)夜，搖菌至OD600= 0.8。分別對(duì)不帶載體、帶有pK2GW7、帶有pK2GW7-eYGFP的3種GV3101農(nóng)桿菌菌液，在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 880)下觀察，均未發(fā)現(xiàn)任何信號(hào)，故排除農(nóng)桿菌本底表達(dá)的影響。收集pK2GW7、pK2GW7-eYGFP菌體，菌體用重懸液(1/2MS，25 g·L-1蔗糖，10 mmol·L-1MES， 200 μmol·L-1AS，pH5.6)重懸。轉(zhuǎn)化前將低溫保存的84K楊莖段在含25%蔗糖的1/2 MS溶液中浸泡3 h，可促進(jìn)轉(zhuǎn)化(Zhengetal., 2012)。將浸泡過(guò)的莖段豎直放入裝有重懸液的三角瓶中，莖段形態(tài)學(xué)下端浸入重懸液中，形態(tài)學(xué)上端與真空儀器通過(guò)橡膠管連接，在0.08 MPa壓強(qiáng)下，懸浮液從莖段形態(tài)學(xué)下端抽濾至形態(tài)學(xué)上端，轉(zhuǎn)化完畢的莖段進(jìn)行水培，培養(yǎng)條件為： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化單因素試驗(yàn)

根據(jù)楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系(Hanetal., 2000； Anetal., 2020)和桂花、朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)、蘋果、剛毛檉柳等其他木本植物遺傳轉(zhuǎn)化體系(Zhengetal., 2012； Trivellinietal., 2015； Hanetal., 2016； Lvetal., 2019)，本試驗(yàn)選擇了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行研究： 乙酰丁香酮(AS)濃度、農(nóng)桿菌濃度、真空滲透侵染時(shí)間、真空滲透侵染次數(shù)、侵染后培養(yǎng)時(shí)間。所有因子均設(shè)某單一因素為變量進(jìn)行篩選，以報(bào)告基因eYGFP瞬時(shí)表達(dá)反映各因素對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響(瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率 = 觀察到eYGFP綠色熒光信號(hào)的莖段數(shù)目/總轉(zhuǎn)化莖段數(shù)目)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少6個(gè)莖段(P< 0.05； ANOVA)。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為探究不同因素對(duì)84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的相互影響作用，本試驗(yàn)進(jìn)行了不同因素正交試驗(yàn)以選擇最優(yōu)的因子組合。以eYGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。正交試驗(yàn)每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少6個(gè)莖段。采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7 銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率分析

轉(zhuǎn)化后的84K楊莖段可用LUYOR-3415RC手持熒光燈進(jìn)行eYGFP初步觀察分析。在莖段1/2處進(jìn)行切片，切片厚度為40 μm，并使用共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 880)在493～558 nm的藍(lán)色激發(fā)光下觀察熒光信號(hào)。統(tǒng)計(jì)觀察到的eYGFP熒光信號(hào)，計(jì)算瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 解除休眠后莖段形成層的活動(dòng)及木質(zhì)部分化

對(duì)休眠的莖段進(jìn)行水培。如圖1A所示，培養(yǎng)0天時(shí)，形成層排列緊密，呈皺縮狀； 隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，第5天時(shí)的形成層細(xì)胞吸水逐漸恢復(fù)扁平狀態(tài)，形成層寬度和層數(shù)較0天時(shí)變化不顯著(圖1B、C)； 培養(yǎng)10天時(shí)，形成層層數(shù)顯著增加，寬度增加不顯著； 培養(yǎng)15天時(shí)，可觀察到新形成的次生木質(zhì)部，相較之前形成的木質(zhì)部細(xì)胞，其細(xì)胞壁較薄。其中可見(jiàn)體積膨大的細(xì)胞，為新形成的導(dǎo)管。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，新形成的次生木質(zhì)部區(qū)域逐漸增加，并伴隨著大量新導(dǎo)管產(chǎn)生。培養(yǎng)20～30天期間，形成層寬度增加顯著，層數(shù)為5或6層。這表明1個(gè)月內(nèi)水培休眠枝條可以模擬正常木材形成過(guò)程，新生的木質(zhì)部細(xì)胞與前期形成的木質(zhì)部沒(méi)有顯著差異。

2.2 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定

為建立銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，根據(jù)Chin 等(2018)所用載體克隆增強(qiáng)型eYGFP表達(dá)序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)同源重組方法連接到pK2GW7載體中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中待用。pK2GW7-eYGFP載體如圖2所示。

圖1 室溫水培解除休眠后莖段形成層的活動(dòng)和木質(zhì)部分化Fig. 1 Cambium activity and xylem differentiation of dormancy-released stem segments cultured in water at room temperature A： 不同培養(yǎng)天數(shù)形成層變化。CZ： 形成層； P： 韌皮部； Pf： 韌皮纖維； r： 射線； V： 導(dǎo)管； X： 木質(zhì)部。紅框代表新形成的次生木質(zhì)部； 箭頭代表新形成的導(dǎo)管。標(biāo)尺為100 μm。A: Changes of cambium zone following cultured days. CZ: Cambium zone; P: Phloem; Pf: Phloem fibre; r: Ray; V: Vessel; X: Xylem. Red rectangles indicate the newly secondary xylem; Arrowheads point to new vessels. Scale bars: 100 μm. B, C: P < 0.05; one-way ANOVA.下同。The same below.

圖2 pK2GW7-eYGFP表達(dá)載體示意Fig. 2 Schematic diagram of the pK2GW7-eYGFP vector

2.3 不同因素對(duì)84K楊莖段轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1 乙酰丁香酮(AS)對(duì)eYGFP基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響 添加AS與不添加AS相比，eYGFP基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率明顯增加。當(dāng)AS濃度為100、200、300 μmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)化效率無(wú)顯著變化(圖3A)。故添加AS進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，選擇AS濃度為200 μmol·L-1。

2.3.2 菌液濃度對(duì)eYGFP基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響 農(nóng)桿菌濃度OD600為0.3時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化eYGFP基因成功率最低，隨著農(nóng)桿菌濃度增加，轉(zhuǎn)化率增加； 當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600增加到0.9時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。隨著農(nóng)桿菌濃度提高到1.2或1.5時(shí)，轉(zhuǎn)化效率降低(圖3B)。說(shuō)明菌液濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，加快了莖段的腐爛速度，導(dǎo)致莖段生理狀態(tài)較差從而影響轉(zhuǎn)化率。

2.3.3 真空滲透侵染時(shí)間對(duì)eYGFP基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響 如圖3C所示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率在真空滲透侵染時(shí)間5～15 min時(shí)較低，在達(dá)到20 min時(shí)顯著增加，在延長(zhǎng)到30 min時(shí)反而下降。表明，真空滲透侵染達(dá)到一定時(shí)間后處于侵染飽和狀態(tài)，抽吸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而引起莖段結(jié)構(gòu)損傷，影響轉(zhuǎn)化率。

2.3.4 真空滲透侵染次數(shù)對(duì)eYGFP基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響 隨著真空滲透侵染次數(shù)增加(每2次真空滲透侵染間隔72 h)，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。當(dāng)用農(nóng)桿菌重懸液真空滲透侵染2次時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率最高； 減少或增加真空滲透侵染次數(shù)，轉(zhuǎn)化率未顯著增加； 且當(dāng)真空滲透侵染5次時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率最低(圖3D)。表明真空滲透侵染會(huì)不同程度地?fù)p傷莖段，抽吸次數(shù)越多損傷越大，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率越低。

2.3.5 培養(yǎng)天數(shù)對(duì)eYGFP基因瞬時(shí)表達(dá)的影響 真空滲透侵染后，將莖段進(jìn)行水培。水培天數(shù)對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率也有較大影響(圖3E)。當(dāng)水培天數(shù)較短時(shí)，如3天和6天，均觀察不到綠色熒光信號(hào)； 當(dāng)培養(yǎng)到第9天時(shí)，可觀察到綠色熒光； 水培至12天時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。隨后，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，轉(zhuǎn)化率降低。

圖3 不同因素對(duì)84K楊莖段真空滲透轉(zhuǎn)化的影響Fig. 3 Effects of key factors on transient transformation of poplar 84K stem segments via vacuum infiltration

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

為優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，共進(jìn)行了9組不同水平處理的轉(zhuǎn)化因子組合試驗(yàn)。表明水培天數(shù)、真空滲透侵染時(shí)間均對(duì)eYGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率有顯著影響(P< 0.05)，即水培天數(shù)和真空滲透侵染時(shí)間顯著影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率，而菌液濃度和真空滲透侵染次數(shù)的影響不顯著(表2)。4個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響為： 侵染后水培天數(shù)>真空滲透侵染時(shí)間>菌液濃度>真空滲透侵染次數(shù)。

通過(guò)表1顯示，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透瞬時(shí)轉(zhuǎn)化銀腺楊84K莖段的最優(yōu)組合是農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD600= 0.9、真空滲透侵染20 min、真空滲透侵染2次、侵染后水培15天。

2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后eYGFP的表達(dá)觀察

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行水培，經(jīng)切片顯微觀察，維管組織發(fā)育情況與休眠莖段水培的維管組織發(fā)育情況類似。形成層細(xì)胞從最初的皺縮狀恢復(fù)到扁平狀，形成層層數(shù)也隨之增加，培養(yǎng)15天可觀察到新形成的次生木質(zhì)部細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的莖段維管發(fā)育也可追蹤從形成層活動(dòng)到木質(zhì)部形成的全過(guò)程。84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后水培15天時(shí)的eYGFP表達(dá)情況初步觀察如圖4所示。圖4A為正常光下莖段整體情況，莖段下部剝掉部分樹(shù)皮，露出形成層區(qū)域。經(jīng)激發(fā)光照射在已轉(zhuǎn)化的莖段形成層區(qū)域可觀察到eYGFP綠色熒光信號(hào)(圖4B中紅箭頭所示)，紅色為自發(fā)熒光。正常光下莖段橫截面如圖4C所示，照射激發(fā)光后在莖段橫截面上也可觀察到明顯的eYGFP綠色熒光信號(hào)(圖4D)。

表1 84K楊莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化因子L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Factors and levels of L9 (34) orthogonal experiments(Mean ± SE)

圖5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后eYGFP在不同部位的表達(dá)情況Fig. 5 eYGFP expression in different regions A： 周皮(Pd)、皮層(Co)、韌皮部(Ph)； B： 形成層區(qū)域(CZ)； C： 木質(zhì)部(Xy)； D： 髓(Pi)； E： 髓射線(PiR)。標(biāo)尺= 50 μm。A: Periderm(Pd), Cortex(Co), and Phloem(Ph); B: Cambium zone(CZ); C: Xylem(Xy); D: Pith(Pi); E: Pith rays(PiR). Scale bars = 50 μm.

為進(jìn)一步探究84K楊莖段轉(zhuǎn)化后eYGFP綠色熒光信號(hào)具體部位，對(duì)莖段1/2處進(jìn)行切片觀察。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察不同部位eYGFP的表達(dá)情況，在周皮、皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓中未觀察到綠色熒光信號(hào)(圖5A、C、D)。而在形成層區(qū)域細(xì)胞中可觀察到較多的綠色熒光信號(hào)(圖5B)，同時(shí)在髓射線中也可觀察到較少的微弱熒光信號(hào)(圖5E)。結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后eYGFP的表達(dá)主要集中在形成層區(qū)域。說(shuō)明外源基因可以在形成層細(xì)胞中表達(dá)，有利于鑒定它們?cè)谛纬蓪踊顒?dòng)及分化為木質(zhì)部中的作用。

3 討論

現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展已推動(dòng)林木研究從傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)向分子育種，而利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)木材進(jìn)行遺傳改良，首先必須了解木材形成的復(fù)雜過(guò)程。目前，研究木本植物的木材相關(guān)基因大多以穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化植株為材料。穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)需要把目的基因整合到宿主基因組中，使宿主具有目的基因所表現(xiàn)的性狀、功能和表型。多數(shù)穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化需要再生體系，這是一個(gè)繁瑣且漫長(zhǎng)的過(guò)程。由于木本植物具有雜合性高、繁殖時(shí)間長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低等特點(diǎn)，不能快速獲得大量轉(zhuǎn)基因植株，且仍有相當(dāng)一大部分木本植物再生體系沒(méi)有建立，遺傳改良受到限制(Gambinoetal., 2012； van Nockeretal., 2014)。與穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)不涉及再生過(guò)程，可在轉(zhuǎn)化之后直接進(jìn)行表型鑒定，周期短且轉(zhuǎn)化效率高(Uenoetal., 1996)。然而，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化大多以葉片(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)為轉(zhuǎn)化材料，雖轉(zhuǎn)化體系較為成熟，但轉(zhuǎn)化過(guò)程損壞了轉(zhuǎn)化材料使其無(wú)法繼續(xù)正常生長(zhǎng)。而且由于轉(zhuǎn)化材料組織的限制，更不利于木本植物木材發(fā)育相關(guān)基因的研究。

本試驗(yàn)在不破壞植物材料的前提下，通過(guò)真空滲透侵染的方法建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的銀腺楊84K莖段瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)通過(guò)研究菌液濃度、真空滲透侵染時(shí)間、真空滲透侵染次數(shù)、侵染后水培天數(shù)等轉(zhuǎn)化因子，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明真空滲透侵染時(shí)間和水培天數(shù)對(duì)eYGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率有顯著影響。真空滲透侵染方法通過(guò)真空壓力將農(nóng)桿菌菌液從莖段下端抽至莖段上端，此操作方便快捷且可批量轉(zhuǎn)化。此方法增加了84K楊莖段導(dǎo)管的運(yùn)輸能力和細(xì)胞的滲透性，使載體更容易進(jìn)入植物細(xì)胞。切片觀察結(jié)果表明eYGFP報(bào)告基因主要在恢復(fù)活力的形成層區(qū)域中表達(dá)(圖5)。說(shuō)明相較于其他的葉或芽等材料的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，本體系能提供形成層細(xì)胞相關(guān)基因的原位表達(dá)，這都有利于鑒定它們?cè)谛纬蓪踊顒?dòng)方面的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，侵染后水培9～20天后目標(biāo)基因的表達(dá)水平都較高(圖3E)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后直接進(jìn)行水培，15天之前休眠莖段的主要活動(dòng)是形成層恢復(fù)活力，形成層層數(shù)和寬度都有所增加。如果研究的目標(biāo)基因參與形成層細(xì)胞活動(dòng)，則可在15天之前進(jìn)行形成層細(xì)胞的早期表型變化觀察。而15天左右可觀察到新形成的次生木質(zhì)部。因此研究木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)基因的功能，可在15天后再進(jìn)行維管組織發(fā)育的表型變化觀察。本體系的建立可以追蹤木質(zhì)部形成的全過(guò)程，所以可利用它研究形成層及木質(zhì)部發(fā)育的相關(guān)基因功能，但需要注意觀察分析時(shí)間。

建立高效的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，有助于植物基因功能的研究。本體系在不破壞植物材料的基礎(chǔ)上，可快速、便捷、高效地獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)化材料，特別有助于研究維管組織發(fā)育相關(guān)基因。此方法建立對(duì)揭示木材形成的分子機(jī)制有重要意義，同時(shí)也可為研究其他木本植物木材形成相關(guān)基因提供借鑒。

4 結(jié)論

本研究建立了銀腺楊84K莖段真空滲透瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系： 農(nóng)桿菌重懸液OD600為0.9，抽真空20 min，根癌農(nóng)桿菌真空滲透侵染2次，水培15天。外源基因主要在銀腺楊84K莖段形成層細(xì)胞中表達(dá)，可以快速鑒定其在維管組織分化中的功能，有助于研究木質(zhì)部發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，也可為其他木本植物的木材品質(zhì)研究提供新思路。