王玉敏(云南師范大學(xué)，云南 昆明 650500)

0 引言

水合氫離子是生物系統(tǒng)中具有關(guān)鍵作用的物種。在生物體中細(xì)胞、體液、器官中的酸堿穩(wěn)態(tài)與很多生物過程有關(guān)，如：細(xì)胞的增殖與凋亡、內(nèi)吞作用、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等[1-2]。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)pH 的范圍從4.5(溶酶體)到8.0(線粒體)。

1 溶酶體和線粒體pH 值對(duì)細(xì)胞生物過程的重要意義

溶酶體是細(xì)胞中的“消化車間”，含有多種水解酶，可以降解大多數(shù)生物分子[3-4]。在酸性環(huán)境中，pH 在4.5～5.5 的范圍內(nèi)水解酶保持最佳的生物活性以進(jìn)行消化和降解。對(duì)于癌細(xì)胞而言，細(xì)胞質(zhì)和溶酶體中的pH 值均低于正常細(xì)胞[5]。溶酶體中pH 值的變化[6]可反映細(xì)胞狀態(tài)和代謝過程。線粒體是有氧呼吸和代謝的主要部位，是能源生產(chǎn)的主要細(xì)胞器[7]。此外，線粒體還參與了各種新陳代謝過程[8]，包括細(xì)胞分化，鈣離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞器中與pH 值變化有關(guān)的生物過程維持著生物體的正常功能，pH 值的輕微偏差會(huì)影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，而pH 值的異常變化可能會(huì)神經(jīng)退行性疾病甚至癌癥[9]等多種疾病。

2 亞細(xì)胞器靶向的pH可激活熒光探針的重要意義

近年來，隨著共聚焦激光顯微鏡分辨率的提高，pH 熒光探針已應(yīng)用于細(xì)胞成像。細(xì)胞成像使人們能夠更加深入地了解亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如：溶酶體和線粒體)，為人們更好地了解與pH 有關(guān)的生理和病理過程提供了一種可能。近兩年來，已經(jīng)開發(fā)出了溶酶體和線粒體靶向的pH 可激活的熒光探針。在這篇評(píng)論中，我們總結(jié)了已報(bào)道的兩種pH 熒光探針并探討了它們的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、識(shí)別機(jī)理以及生物學(xué)應(yīng)用。

3 溶酶體靶向的pH 可激活熒光探針

溶酶體是真核細(xì)胞具有的膜結(jié)合囊泡。在解離狀態(tài)下兩親性小分子能夠滲透溶酶體膜，但質(zhì)子化后在酸性溶酶體中不滲透。

一般來說，在熒光探針分子中引入二甲基氨基，氰基和嗎啉的結(jié)構(gòu)用于溶酶體定位。接下來，我們將討論最近剛剛報(bào)道的基于嗎啉基團(tuán)的溶酶體靶向pH 可激活熒光探針。

課題組設(shè)計(jì)了探針1[10](如圖1 所示)，該探針以嗎啉為溶酶體靶向單元，羅丹明B 為熒光團(tuán)，具有獨(dú)特的五元螺環(huán)，在中性和堿性pH 值下，螺環(huán)封閉，羅丹明B 幾乎不發(fā)熒光；在酸性條件下螺環(huán)打開時(shí)，會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。此外，探針1 還有具有良好的光物理特性，極好的光穩(wěn)定性以及低細(xì)胞毒性，因而探針1 適用于活細(xì)胞成像。pH 滴定研究表明探針1 在590 nm 處，出現(xiàn)熒光增強(qiáng)。在pH 范圍5.00～6.00 之間，pH 與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，其pKa 值為5.42，適用于溶酶體pH成像。因此該探針在理解亞細(xì)胞器功能和溶酶體相關(guān)疾病的方面具有巨大的潛力。

圖1 熒光探針1的識(shí)別機(jī)理

4 線粒體靶向的pH 可激活熒光探針

線粒體具有磷脂雙層和蛋白質(zhì)組成的外膜和內(nèi)膜。根據(jù)能斯特方程，線粒體內(nèi)膜上的電化學(xué)勢(shì)能累積親脂陽離子，在熒光探針的熒光團(tuán)上引入親脂性陽離子，即可設(shè)計(jì)成線粒體靶向的熒光探針。一般來說，陽離子部分不參與檢測(cè)過程，僅用于線粒體定位。接下來，我們將討論最近剛剛報(bào)道的線粒體靶向pH可激活熒光探針。

近年來通過在半菁和羅丹明染料中引入閉合螺內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成的中性或弱堿熒光探針，使螺內(nèi)酰胺開環(huán)的pKa 值低，可靶向溶酶體而不是線粒體。理想的具有線粒體靶向能力的熒光探針，應(yīng)具有較高的pKa 值，基于此Tajiri 課題組通過將惡唑烷開關(guān)引入半菁染料設(shè)計(jì)合成了可以靶向監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)線粒體pH 變化的近紅外熒光探針2[11]。探針2 的半花青染料發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)，形成惡唑烷開關(guān)，游離羥基參與對(duì)吲哚部分的親核攻擊，導(dǎo)致熒光猝滅。在酸性條件下惡唑烷開關(guān)轉(zhuǎn)換為半花青素，π 共軛體系增大，并導(dǎo)致725 nm 處的熒光增強(qiáng)。當(dāng)pH 從10.0 降低至5.0 時(shí)，吸光度在713 nm 處增加。探針2 還具有良好的光穩(wěn)定性，對(duì)pH 的適度選擇性，低細(xì)胞毒性和熒光可逆性。此外探針2 還成功應(yīng)用于HeLa 細(xì)胞線粒體pH的測(cè)定以及熒光成像分析。熒光探針2的識(shí)別機(jī)理如圖2所示。

圖2 熒光探針2的識(shí)別機(jī)理

5 亞細(xì)胞器靶向的pH 可激活的熒光探針小結(jié)

綜上所述溶酶體靶向的探針1 具有熒光開啟特征，以酰胺鍵為H+識(shí)別位點(diǎn)，在酸性條件下，五元螺環(huán)被打開，釋放出熒光團(tuán)，嗎啉定位基可以特異性的定位在溶酶體中，可以高靈敏度地測(cè)量溶酶體的pH 值。線粒體靶向探針2 具有惡唑烷開關(guān)，在酸性條件下，惡唑烷開關(guān)轉(zhuǎn)換為帶正電荷的半花青染料，釋放出熒光團(tuán)的同時(shí)定位在線粒體中，可以高靈敏度地測(cè)量線粒體的pH 值。

兩種亞細(xì)胞器靶向pH 可激活的熒光探針均具有可視化細(xì)胞內(nèi)pH 分布和pH 變化的能力，能夠幫助人們了解復(fù)雜的生理和病理過程，具有廣闊的應(yīng)用潛力。