丁文玉,何聰芬,劉蕾,楊笑笑,董坤*

1(北京工商大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院,北京,100048)2(北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京工商大學(xué)),北京,100048)

皮膚中的膠原蛋白主要包括I型(collagen I,COL I)和III型(collagen III,COL III),為皮膚提供強(qiáng)度和支撐。人類(lèi)年輕皮膚中COL I和COL III分別占總膠原蛋白的80%和15%,隨年齡增長(zhǎng),COL I明顯丟失,同時(shí)合成速度減慢,導(dǎo)致COL I和COL III的比值逐漸降低,引起皮膚老化,故COL I是維持皮膚豐盈飽滿(mǎn)的重要蛋白[1]。膠原蛋白的主要合成場(chǎng)所在成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB),FB首先合成帶有氨基(N-)端和羧基(C-)端的無(wú)活性膠原前體,其N(xiāo)-和C-端經(jīng)過(guò)相關(guān)蛋白酶切割(翻譯后加工)釋放出成熟的三股螺旋膠原蛋白,最終形成膠原纖維,發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP-1)參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix,ECM)中的多種蛋白質(zhì)肽鏈的切割,包括膠原蛋白、小型富含亮氨酸蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans,SLRPs)、SIBLING(small integrin binding ligand,N-linked glycoprotein)蛋白、賴(lài)氨酸氧化酶(the enzyme lysyl oxidase,LOXs)等[2]。其中,BMP-1參與膠原蛋白前體C端水解過(guò)程,促使膠原蛋白功能化[3],如圖1所示。

圖1 膠原蛋白成熟過(guò)程Fig.1 Collagen maturation process

草莓葉是草莓種植過(guò)程中最主要的副產(chǎn)品,其富含多種生物活性成分,如有機(jī)酸、槲皮素和山柰酚衍生物等黃酮類(lèi)化合物,咖啡酸和綠原酸等酚酸,鞣花單寧、萜類(lèi)化合物等[4-5]。此外,草莓葉提取物具有抑制膠原酶活性,可改善因膠原蛋白流失引起的皮膚衰老[6]；抑制炎癥介質(zhì)釋放,表現(xiàn)出潛在的抗過(guò)敏性[7]；對(duì)胰脂肪酶有微弱的抑制作用,表現(xiàn)出潛在的抗肥胖活性[7]。法國(guó)植物專(zhuān)家BERKEM曾將一種高多酚含量的草莓葉提取物用于化妝品中,可有效改善皮膚的光澤和質(zhì)地[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期針對(duì)草莓葉水提物(water extractions from strawberry leaves,SLWE)研究發(fā)現(xiàn),其具有良好的提高膠原蛋白含量和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP-1)活性，進(jìn)而減少膠原蛋白降解的功效,而SLWE是否存在促進(jìn)膠原蛋白成熟的功效未知。

本文通過(guò)測(cè)SLWE主成分和抗氧化活性酶酶活力,分析SLWE對(duì)HFF-1中COL I和BMP-1含量的影響,探究SLWE作為開(kāi)發(fā)延緩衰老功效性原料的可能性,為提高草莓廢棄物綜合利用效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts,HFF-1),由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供；新鮮紅顏草莓葉,北京市欣寶萊科技股份有限公司。DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),Hyclone；胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鏈霉素/青霉素,gibco；CCK-8試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司；COL I試劑盒,南京建成生物研究所；BMP-1試劑盒,北京安迪華泰科技有限公司；維生素C,北京奧拓達(dá)科技有限公司；人參皂苷Rb1、蘆薈多糖,上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器

206471-6608型恒溫培養(yǎng)箱，Thermo；Centrifuge 5810 R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Eppendorf；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，TECAN；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松原華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SLWE制備

新鮮紅顏草莓葉冷凍干燥24 h,打磨成粉,過(guò)100目篩,料液比1∶25(g∶mL),超聲30 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液,即為SLWE。用HFF-1培養(yǎng)基稀釋SLWE至體積分?jǐn)?shù)為12.5%、6.25%、3.125%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%,備用。

1.2.2 HFF-1培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、鋪板

當(dāng)HFF-1生長(zhǎng)率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代流程如下：棄去培養(yǎng)基廢液,用1 mL PBS溶液清洗2次,加入1 mL胰酶,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化3 min,當(dāng)細(xì)胞消化至80%以上,加入2 mL培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,1 000 r/min、25 ℃下離心4 min。棄去培養(yǎng)基,加入1 mL培養(yǎng)基吹打懸浮,按照一分二原則于5 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

按照傳代方法,將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,取10 μL沿蓋玻片打入血球計(jì)數(shù)板中,于顯微鏡下計(jì)數(shù),遇到邊框上的細(xì)胞,按照數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右原則計(jì)數(shù),按公式(1)計(jì)算:

(1)

依據(jù)實(shí)際需要,將已知密度的細(xì)胞懸液稀釋至密度為5×104個(gè)/mL,每100 μL細(xì)胞懸液接到96孔板中。

1.2.3 SLWE主要成分和酶活性分析

以SLWE原液為研究對(duì)象,參照陳金娥等[9]方法,利用鉬酸銨比色法測(cè)定還原型Vc含量；可溶性糖含量參照南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)提取、含量測(cè)定,參照全式金B(yǎng)CA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)；原花青素含量采用香草醛-濃鹽酸法[10]；總酚含量,參照CHAVAN等[11]采用的Folin-酚法；總黃酮含量測(cè)定,采用NaNO2-AlCl3-NaOH法[12]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)提取及含量,參照魏彥珍[13]等方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 SLWE安全濃度篩選

參考CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū),以正常培養(yǎng)HFF-1為陰性對(duì)照組,不鋪細(xì)胞只有培養(yǎng)基為空白對(duì)照,以1.2.1小節(jié)制備8個(gè)濃度梯度SLWE為測(cè)試樣品,以HFF-1存活率大于80%為標(biāo)準(zhǔn),確定SLWE對(duì)HFF-1的安全濃度,通過(guò)公式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率：

(2)

式中:在450 nm處測(cè)定OD值。

1.2.5 SLWE對(duì)HFF-1合成COL I的影響

以0.01% Vc為陽(yáng)性對(duì)照組,更換培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,用培養(yǎng)基稀釋SLWE體積分?jǐn)?shù)至0.2%、1.5%、2%、6.25%作為試驗(yàn)組,分別作用于HFF-1培養(yǎng)24 h后取上清液,COL I試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 SLWE對(duì)HFF-1分泌BMP-1的影響

鋪板的HFF-1培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基,用無(wú)血清的DMED處理12 h。研究表明HFF-1培養(yǎng)24 h后是BMP-1含量的最適檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)[14],所以,更換培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,100 μg/mL Vc、200 μg/mL蘆薈多糖、10 ng/mL TNF-α、40 ng/mL人參皂苷Rb1、100 μg/mL人參皂苷Rb1為預(yù)選的陽(yáng)性對(duì)照,培養(yǎng)基稀釋SLWE體積分?jǐn)?shù)至0.5%、1%、2%、3.125%作為試驗(yàn)組,分別作用于處理好的HFF-1培養(yǎng)24 h,取上清液,按BMP-1試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 SLWE主要成分及抗氧化酶SOD、POD分析

Vc、原花青素、多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物和多酚類(lèi)化合物的抗氧化活性主要通過(guò)清除自由基而體現(xiàn)出現(xiàn)，同時(shí)活性成分之間具有協(xié)同增效的作用，從而提高抗氧化活性[15-18]。由表1可知，SLWE中Vc含量為(0.88±0.025)mg/mL，約是新鮮葉片Vc含量的11倍[19]；SLWE中的原花青素含量為(0.28±0.027)mg/mL，約是山葡萄籽中原花青素的含量(水提：0.075 mg/mL)的4倍[20]；SLWE中多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物和多酚類(lèi)化合物含量分別達(dá)到(10.00±0.28)、(1.47 ±0.05)和(2.05 ±0.03)mg/mL，故SLWE具有一定的抗氧化能力。此外，SLWE有一定SOD和POD酶活力，SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，能催化超氧陰離子自由基(·O2-)歧化生成O2和H2O2[21]，進(jìn)而被POD徹底還原生成H2O排出體外。

表1 SLWE活性成分和主要酶活力Table 1 Contents of active components and activities of main antioxidant enzymes in SLWE

人體正常新陳代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，主要以·OH、·O2-以及H2O2的形式存在[22]，是造成肌膚老化最主要的原因；SLWE中的活性成分和酶可以通過(guò)清除新陳代謝產(chǎn)生的氧自由基，從而起到抗氧化的作用，延緩皮膚衰老。

2.2 SLWE對(duì)HFF-1活性影響

由圖2可知,SLWE在體積分?jǐn)?shù)0.062 5%～12.5%范圍內(nèi)對(duì)HFF-1沒(méi)有明顯細(xì)胞毒性,且與陰性對(duì)照相比,不同體積分?jǐn)?shù)的SLWE對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯增殖作用。

圖2 SLWE對(duì)HFF-1存活率的影響Fig.2 Effect of SLWE on HFF-1 viability注：細(xì)胞存活率≥80%,沒(méi)有明顯細(xì)胞毒性；細(xì)胞存活率<80%,存在細(xì)胞毒性[14]

2.3 SLWE對(duì)HFF-1合成COL I的影響

結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果,選取了4個(gè)SLWE體積分?jǐn)?shù)(0.2%、1.5%、2%、6.25%)考察其對(duì)HFF-1合成COL I的影響,結(jié)果如圖3所示。SLWE在0.2%～6.25%體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi),能顯著促進(jìn)HFF-1分泌COL I。此外,結(jié)果表明SLWE對(duì)HFF-1無(wú)明顯增殖作用(圖2),說(shuō)明SLWE不是通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)COL I的含量,而是具有促進(jìn)HFF-1細(xì)胞中COL I表達(dá)的作用。

圖3 SLWE對(duì)HFF-1合成COL I影響Fig.3 Effect of SLWE on the synthesis of COL Ⅰ by HFF-1

Vc具有羥基化前膠原多肽的脯氨酸和賴(lài)氨酸殘基[23-24]、抑制MMP-1基因的轉(zhuǎn)錄[25]以及促進(jìn)和維持細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中I型膠原的合成的作用,此外,SLWE中活性成分及酶能有效清除氧自由基。所以推測(cè)SLWE可通過(guò)促進(jìn)阻斷因ROS激活的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路引起的膠原蛋白的降解,從而維持膠原蛋白含量。綜上,SLWE中的活性成分通過(guò)減少膠原蛋白降解及促進(jìn)COL I合成2種途徑來(lái)增加膠原蛋白的含量。但HFF-1合成的只是膠原蛋白前體,而生物體內(nèi)只有成熟的膠原蛋白才能發(fā)揮其生物學(xué)功能,所以本文又進(jìn)行了SLWE能否促進(jìn)COL I成熟過(guò)程中最關(guān)鍵的C端蛋白酶BMP-1的表達(dá)。

2.4 SWEL對(duì)HFF-1分泌BMP-1影響

2.4.1 陽(yáng)性對(duì)照的篩選

理想陽(yáng)性對(duì)照品可以確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),Vc能促進(jìn)COL I合成[26];蘆薈多糖可促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)COL I、COL III合成及表達(dá)[27];TNF-α可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌BMP-1[28];而人參皂苷Rb1在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的同時(shí),可促進(jìn)I型前膠原蛋白表達(dá)[29]。故本文以VC、蘆薈多糖、TNF-α以及人參皂苷Rb1作為預(yù)選陽(yáng)性對(duì)照品,同時(shí)參照相應(yīng)參考文獻(xiàn)中的最適濃度進(jìn)行試驗(yàn)[14],用BMP-1試劑盒檢測(cè)其對(duì)HFF-1分泌BMP-1的影響。設(shè)定陰性對(duì)照組HFF-1分泌BMP-1的含量為100%,計(jì)算上述幾種成分作用于HFF-1分泌BMP-1的相對(duì)生成率,結(jié)果如圖4所示。

1-VC 100μg/mL;2-TNF-α 10 ng/mL;3-蘆薈多糖 200μg/mL;4-人參皂苷 40ng/mL;5-人參皂苷 100 μg/mL圖4 幾種成分對(duì)HFF-1分泌BMP-1的影響Fig.4 Effect of several components on the secretion of BMP-1 by HFF-1

結(jié)果表明,100 μg/mL Vc與陰性對(duì)照組差異十分顯著(0.001

2.4.2 SLWE對(duì)HFF-1分泌BMP-1的影響

由圖5可知，SLWE體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，與陰性對(duì)照組差異十分顯著(0.001

1-SLWE 0.5%;2-SLWE 1%;3-SLWE 2%;4-SLWE 3.125%圖5 SLWE對(duì)HFF-1分泌BMP-1的影響Fig.5 Effect of SLWE on BMP-1 secretion by HFF-1

SWEL中Vc含量為(0.88±0.025)mg/mL(表1),則體積分?jǐn)?shù)為1% SLWE中的Vc含量為8.8 μg/mL,其對(duì)HFF-1分泌BMP-1的相對(duì)生成率(157.77%)與陽(yáng)性對(duì)照100 μg/mL Vc的作用(143.26%)相當(dāng),如表2所示,說(shuō)明SLWE對(duì)HFF-1分泌BMP-1的促進(jìn)作用相當(dāng)于Vc的10多倍,這可能與SLWE中其他活性成分(如原花青素、多糖、黃酮類(lèi)化合物多酚等)密切相關(guān),可能是多種活性成分的協(xié)同增效作用,明確的機(jī)理有待研究。

表2 SLWE與陽(yáng)性對(duì)照組中Vc濃度及促進(jìn)BMP-1作用的對(duì)比Table 2 Comparison of Vc content and BMP-1 promoting effect between SLWE and positive control

3 結(jié)論

(1)SLWE富含多糖、酚類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、Vc、原花青素和蛋白質(zhì),以及一定的SOD和POD酶活力,為SLWE促進(jìn)COL I合成和BMP-1分泌提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

(2)SLWE在0.2%～6.25%(體積分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)沒(méi)有促進(jìn)HFF-1增殖作用,但可以促進(jìn)HFF-1合成COL I,0.5%～3.125%范圍內(nèi)促進(jìn)HFF-1分泌BMP-1。SLWE可以通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白合成和成熟(功能化),如圖6所示,為SLWE作為延緩皮膚衰老化妝品功效成分提供理論基礎(chǔ)。

圖6 SLWE對(duì)HFF-1合成COLI及分泌BMP-1的影響Fig.6 Effects of SLWE on COL I synthesis and BMP-1 secretion by HFF-1注：加粗實(shí)線表示本試驗(yàn)結(jié)果；細(xì)實(shí)線表示文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果

(3)草莓葉作為草莓產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物,存在處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力及其污染環(huán)境的問(wèn)題,開(kāi)發(fā)SLWE作為化妝品原料,有助于植物資源廢棄物的再利用,促進(jìn)農(nóng)村二三產(chǎn)業(yè)發(fā)展,提高草莓產(chǎn)業(yè)。