王婧,高娉娉,田秀,梁麗紅,李敏,韓舜愈

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室,甘肅 蘭州,730070)3(甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司,甘肅 蘭州,730000)

葡萄酒釀造涉及到的酵母菌種主要包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)[1]。釀酒酵母由于酒精轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵徹底而被廣泛用于葡萄酒酒精發(fā)酵。然而,釀酒酵母單獨發(fā)酵常常會造成葡萄酒香氣單一、風(fēng)味同質(zhì)化,地域風(fēng)格欠缺等問題[2]。非釀酒酵母大量存在于葡萄酒酒精發(fā)酵的前期和中期,能夠通過代謝、自溶等生化過程,參與酯類、醇類、萜烯類等揮發(fā)性香氣物質(zhì)的形成,提高葡萄酒的香氣[3]。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是裂殖屬的桿狀酵母,曾被認(rèn)為是腐敗微生物,但近些年研究發(fā)現(xiàn),S.pombe對葡萄酒生境耐受性較強,有較高的乙醇發(fā)酵能力,并能將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為乙醇[4],可以改善紅葡萄酒顏色的穩(wěn)定性,增加葡萄酒中香氣化合物含量[5],降低影響產(chǎn)品質(zhì)量安全的氨基甲酸乙酯的濃度[6],是極具釀酒潛力的非釀酒酵母,國外已將S.pombe應(yīng)用于朗姆酒、棕櫚酒和可可酒的釀造[7]。國際葡萄與葡萄酒組織(International Organisation of Vine and Wine, OIV)也批準(zhǔn)了S.pombe作為生物降酸劑在葡萄酒發(fā)酵中使用[8]。目前葡萄酒行業(yè)對非釀酒酵母的使用多以混菌發(fā)酵方式進行,包括同時接種和順序接種,其中順序接種方式能夠延長非釀酒酵母在發(fā)酵體系中的存活時間,更有效地改善葡萄酒的品質(zhì)和感官特性[6],并縮短酒精發(fā)酵完成的時間[9],因此在混菌發(fā)酵中是一種有效利用非釀酒酵母的接種方式。黑比諾是西北地區(qū)主栽的早熟釀酒紅葡萄品種,喜歡溫和或冷涼的氣候,葡萄皮薄,單寧含量低,帶有成熟的紅色水果的香氣[10]。由于西北產(chǎn)區(qū)屬于溫帶季風(fēng)性氣候,晝夜溫差較大,氣溫偏低,釀酒葡萄成熟時間較短,使成品酒存在酸度過高、香氣復(fù)雜性欠缺、產(chǎn)地特征不明顯等問題[11]。

本試驗以賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊‘黑比諾’葡萄為原料,采用S.pombe和商業(yè)釀酒酵母順序接種發(fā)酵,釀造‘黑比諾’干紅葡萄酒,并對酒精發(fā)酵過程中菌種生長動態(tài)、蘋果酸的變化趨勢、成品酒的色澤及香氣品質(zhì)等進行分析,研究S.pombe與釀酒酵母順序接種發(fā)酵對‘黑比諾’干紅葡萄酒品質(zhì)的影響,為提升西北產(chǎn)區(qū)葡萄酒品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

‘黑比諾’葡萄,采摘于賀蘭山東麓青銅峽市西鴿酒莊葡萄種植基地,糖含量226.8 g/L(以還原糖計),可滴定酸含量6.8 g/L(以酒石酸計),pH值3.67。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

商業(yè)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)活性干粉(紅佳釀Vintage Red),意大利Enartis公司；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒微生物實驗室保藏；商業(yè)酒酒球菌(Oenococcusoeni)活性干粉(OMEGA),法國Lallemand公司。

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：無水葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸粉5,瓊脂10;YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：無水葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸粉5;WL培養(yǎng)基：購于青島海博生物技術(shù)有限公司;葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁與無菌水體積比為1∶1。

所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

偏重亞硫酸鈉,上海源葉生物科技有限公司；EX-V果膠酶,法國Lallemand公司；L-蘋果酸試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司；2-辛醇(色譜純),SIGMA-ALDRICH(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵試驗

1.2.1.1 菌株活化

將商業(yè)釀酒酵母活性干粉按0.2 g/L的添加量置于無菌水中,37 ℃水浴30 min后接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃培養(yǎng)48 h,以2%的接種量接種于葡萄汁培養(yǎng)基中,擴培2次后進行接種試驗。

挑取S.pombe單菌落接種于液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)48 h,再以2%的接種量(體積分?jǐn)?shù))接種于葡萄汁培養(yǎng)基中擴培,于28 ℃培養(yǎng)48 h后進行接種試驗。

1.2.1.2 小容器發(fā)酵

黑比諾葡萄除梗破碎裝罐,加入50 mg/L SO2(以偏重亞硫酸鈉的形式)和20 mg/L果膠酶,16～18 ℃浸漬48 h,取葡萄汁裝入2 L發(fā)酵罐中,裝液量為70%,65 ℃水浴20 min[12],冷卻至室溫后接種酵母,發(fā)酵溫度控制在25～28 ℃,當(dāng)殘?zhí)堑陀? g/L時添加50 mg/L SO2終止發(fā)酵,滿罐于16～18 ℃酒窖貯存。每個處理設(shè)3組重復(fù)。

1.2.1.3 接種試驗

對照組(CK)：單獨接種釀酒酵母于無菌葡萄汁中,使細(xì)胞濃度為107CFU/mL,酒精發(fā)酵結(jié)束后,接種0.02 g/L酒酒球菌,18 ℃進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵。

處理組：在S.pombe接種后的第6、8、10、12天接入釀酒酵母,分別標(biāo)記為SX1、SX2、SX3、SX4,接種后2種菌株的初始細(xì)胞濃度均為107CFU/mL。所有試驗均設(shè)置3組平行。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 菌株生物量測定

采用平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)。發(fā)酵期間,每隔2 d取樣,梯度稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)72 h,然后對S.pombe與釀酒酵母進行菌落計數(shù),根據(jù)S.pombe、釀酒酵母分別在WL培養(yǎng)基上呈深綠色和奶油色帶綠色的菌落形態(tài)進行區(qū)別統(tǒng)計。

1.2.2.2 葡萄酒理化指標(biāo)測定

總糖、總酸、酒精度和揮發(fā)酸等含量參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；單寧含量測定參照農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定分光光度法》中的方法；總花色苷參照史肖等[13]的方法測定；色度、色調(diào)參照莊惠婷等[14]的方法測定；蘋果酸采用試劑盒法進行檢測。

1.2.2.3 柔和指數(shù)的測定

柔和指數(shù)=酒精-(酸度+單寧)[15],其中酒精用體積百分?jǐn)?shù)表示,單寧用g/L表示,酸度用g/L表示(以硫酸計)。

1.2.3 揮發(fā)性香氣化合物測定

參照宋茹茹等[16]的方法進行測定。

1.2.4 感官分析

由10位葡萄酒品嘗員進行感官評價,使用7分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化,分別從外觀(顏色)、口感(酸度、甜味、余味)、香氣(濃郁度、優(yōu)雅度、典型性)和綜合品質(zhì)(整體評分)4個方面對各葡萄酒樣品進行評價。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。使用SPSS 19.0繪制主成分分析圖,并對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,采用Duncan檢驗進行多重比較,顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵過程中的菌株生物量

不同順序接種方式完成酒精發(fā)酵的時間不同(圖1)。其中間隔12 d的SX4在第18天完成酒精發(fā)酵,其他順序接種處理均在第16天完成酒精發(fā)酵,而對照CK在第8天完成酒精發(fā)酵,說明S.pombe與釀酒酵母的順序接種使‘黑比諾’干紅葡萄酒完成酒精發(fā)酵所需時間明顯增加。

在酒精發(fā)酵過程中2種菌株生物量變化如圖1所示。S.pombe和釀酒酵母菌株的起始細(xì)胞濃度均為107CFU/mL,不同間隔天數(shù)的順序接種完成酒精發(fā)酵后釀酒酵母菌株生物量與對照組基本一致,均保持在107CFU/mL的水平；各處理組S.pombe菌株生長趨勢基本一致,于2 d的指數(shù)生長期后進入穩(wěn)定期,釀酒酵母菌株順序接入后,S.pombe菌株細(xì)胞濃度迅速下降,酒精發(fā)酵結(jié)束后細(xì)胞濃度保持在105CFU/mL的水平,釀酒酵母的細(xì)胞濃度基本都維持在107CFU/mL左右。綜上可知,S.pombe與釀酒酵母順序接種發(fā)酵時,S.pombe的最終生物量基本一致,但隨著接種間隔時間的增加,S.pombe在酒中發(fā)揮作用的時間增加。

a-SX1;b-SX2;c-SX3;d-SX4圖1 S.pombe和釀酒酵母順序接種發(fā)酵過程中菌株生物量Fig.1 Strain biomass during alcohol fermentation by the sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae注：圖中實線代表菌株生物量,虛線代表葡萄酒中總糖含量；Gsc代表對照組的總糖含量,G代表處理組的總糖含量；Sp代表Schizosaccharomyces pombe菌株,Sc代表Saccharomyces cerevisiae菌株

2.2 葡萄酒品質(zhì)分析

2.2.1 主要理化指標(biāo)的測定

表1顯示了酒精發(fā)酵結(jié)束后‘黑比諾’干紅葡萄酒的基本理化指標(biāo)。各酒樣中殘?zhí)呛繛?.01～3.60 g/L,均能夠完成酒精發(fā)酵。與對照組相比,處理組酒樣中總酸含量均有降低,降低量為0.25～2.22 g/L,SX2的總酸含量顯著低于其他處理組,說明SX2的降酸能力最好。

表1 S.pombe和釀酒酵母順序接種酒樣的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes under sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae

SX1和SX2與對照組相比揮發(fā)酸含量無顯著差異,有研究表明,S.pombe菌株具有代謝產(chǎn)生乙酸的風(fēng)險[6],本研究中處理組隨著S.pombe菌株在酒樣中作用時間的增加,揮發(fā)酸含量也逐漸增加,但均未超過國標(biāo)限量值1.20 g/L。處理組酒精度與對照組相比顯著降低,降低值在0.95%～1.28%,但各處理組之間沒有顯著差異。以上4個基本理化指標(biāo)均符合國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。單寧是影響葡萄酒質(zhì)量的重要因素之一,賦予了葡萄酒獨特的感官品質(zhì)(收斂性),其含量與葡萄酒品質(zhì)密切相關(guān)[17]。各處理組的單寧含量與對照組間差異不顯著,含量在2.10～2.29 g/L。

2.2.2 對葡萄酒顏色的影響

色澤是評價干紅葡萄酒品質(zhì)的重要依據(jù),是消費者選購和品評葡萄酒的重要參考因素[15]。酒精發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中色度值和色調(diào)值如圖2-a所示,各處理組的色調(diào)值和色度值與對照組相比沒有顯著性差異,其色調(diào)值為0.77～0.85,色度值為1.00～1.05?？偦ㄉ帐怯绊懫咸丫祁伾闹匾笜?biāo)之一。如圖2-b所示,處理組酒樣總花色苷含量與對照組之間無顯著差異,表明S.pombe和釀酒酵母菌株不同間隔天數(shù)的順序接種對葡萄酒中總花色苷含量無顯著影響。

a-色度、色調(diào)；b-總花色苷圖2 S.pombe和釀酒酵母順序接種的色度、色調(diào)和總花色苷測定Fig.2 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on chroma,hueand total anthocyanin content注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.3 對葡萄酒柔和指數(shù)的影響

柔和指數(shù)(suppleness index,IS)可以對紅葡萄酒的味感平衡進行數(shù)字化衡量。IS<5的紅葡萄酒瘦弱粗重;IS>5的紅葡萄酒較為柔和;IS>6～7則表明紅葡萄酒豐滿圓潤,口感平衡[15]。從圖3可知,酒精發(fā)酵結(jié)束后,SX2酒樣的IS為6.89,與對照組無顯著差異,SX1、SX3和SX4的IS顯著低于對照組,但SX1、SX3和SX4間沒有顯著差異,其值分別為5.89、5.91和5.40。上述結(jié)果表明,SX2和CK的酒樣口感平衡協(xié)調(diào)。

圖3 S.pombe和釀酒酵母順序接種的柔和指數(shù)分析Fig.3 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on softness index

2.2.4 對葡萄酒蘋果酸含量的影響

S.pombe在酒精發(fā)酵過程中不僅能降解葡萄糖,還能夠降解蘋果酸,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在S.pombe參與發(fā)酵的酒樣中,蘋果酸幾乎能夠被完全降解[4]。對各供試酒樣蘋果酸的含量分析表明(圖4),不同間隔時間接種處理與經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵的對照酒樣相比,蘋果酸含量均顯著降低,分別降低了20.00%、73.33%、40.00%、26.67%,其中SX2酒樣中蘋果酸含量(0.04 g/L)顯著低于其他酒樣,說明S.pombe與釀酒酵母菌株順序接種發(fā)酵比酒酒球菌對蘋果酸的降解更徹底。

圖4 S.pombe和釀酒酵母順序接種的蘋果酸含量分析Fig.4 Effect of sequential inoculation of S.pombe and S.cerevisiae on malic acid content

2.3 葡萄酒主要香氣化合物分析

香氣是葡萄酒感官品質(zhì)的重要方面。通過頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)儀對供試酒樣香氣物質(zhì)進行檢測分析。試驗酒樣共檢出52種主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)。包括18種脂類,17種醇類,10種酸類,4種萜烯類,3種其他類。

2.3.1 酯類化合物

酯類是葡萄酒中重要的香氣化合物,能為葡萄酒提供令人愉快的花香和果香[19]。酒精發(fā)酵結(jié)束后,與對照組相比,SX2酯類物質(zhì)總量增加了73.58 μg/L,而其他3個處理組的酯類物質(zhì)總量低于對照組。在檢測到的18種酯類物質(zhì)中,共有6種酯類物質(zhì)的OAV>1,分別為乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯。其中月桂酸乙酯具有花果香味和奶香味,該物質(zhì)僅在處理組酒樣中被檢出,并在SX2和SX3酒樣中的含量顯著高于SX1和SX4；己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的OAV值均>10,這幾種物質(zhì)具有濃郁的花果香氣,而處理組中己酸乙酯含量顯著高于對照組,是對照組的9.57～22.89倍；辛酸乙酯和癸酸乙酯在SX2中的含量顯著高于其他組,分別比對照組增加了73.84%和40.01%。由此可以看出,間隔8 d的SX2處理能夠增加月桂酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量,對葡萄酒花果香氣具有積極影響。

2.3.2 醇類化合物

醇類物質(zhì)產(chǎn)生于酒精發(fā)酵期間,是酵母菌的次生代謝物,當(dāng)葡萄酒中的醇類物質(zhì)含量低于300 mg/L時能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性。但當(dāng)其總量超過400 mg/L時,會產(chǎn)生令人不愉快的氣味,導(dǎo)致感官品質(zhì)下降[20]。酒精發(fā)酵結(jié)束后,SX1、SX2和SX3醇類物質(zhì)的總量高于對照組,分別比對照組增加了121.01%、90.18%和10.84%。所檢測的17種醇類物質(zhì)中,共有3種物質(zhì)的OAV>1,分別為正辛醇、1-壬醇和正戊醇。正辛醇和正戊醇具有茉莉、檸檬和面包等香氣,這2種物質(zhì)僅在對照組、SX1和SX2中被檢出,其中,SX1和SX2的正戊醇含量顯著高于對照,分別是對照組的1.26倍和1.61倍。此外,苯乙醇能夠為葡萄酒帶來玫瑰、蜂蜜和薔薇等香氣,該物質(zhì)僅在處理組中被檢出,其中SX1的苯乙醇含量顯著高于其他處理組。上述結(jié)果表明,SX1和SX2能夠顯著增加正戊醇和苯乙醇的含量,能夠為葡萄酒帶來明顯的花香味。

2.3.3 酸類化合物

酸類物質(zhì)能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性,其部分物質(zhì)可以賦予葡萄酒果香、奶酪和脂肪等的風(fēng)味[21]。所檢測到的10種酸類物質(zhì)中,對照組中異丁酸和己酸的OAV>1,增加了酒體中異味,但在各處理組中均低于閾值,能夠增加酒樣香氣復(fù)雜性,降低不良風(fēng)味的影響。

2.3.4 萜烯類化合物

萜烯類為葡萄酒提供花香和果香,且閾值較低,因此較低含量的萜烯也會在一定程度上影響葡萄酒的香氣[22]。酒精發(fā)酵結(jié)束后,相比于對照組,處理組均能夠顯著增加萜烯類物質(zhì)的總量,是對照組的1.60～7.18倍。SX2的香茅醇OAV>1，且含量顯著高于其他組,是對照組的6.78倍,能夠為葡萄酒帶來青草香、丁香花香和薔薇香等香氣。上述結(jié)果表明,SX2能夠增加香茅醇的含量,為葡萄酒帶來比較濃郁的花香味。

2.3.5 其他類化合物

其他類化合物相對含量少。處理組的其他類化合物總量高于對照組,增加了37.23%～112.23%。所檢測到的3種物質(zhì)中,只有丁香酚的OAV>0.1,該物質(zhì)具有丁香味和甘草香等香氣,僅在處理組中被檢出。

2.4 主要香氣化合物的主成分分析

如圖5-a所示,2個主成分(PC1和PC2)分別占總體方差的56.71%和26.29%,二者累計貢獻率達到了83.00%。PC1主要反映了醇類和酸類的香氣物質(zhì)信息,PC2主要反映了酯類和萜烯類的香氣物質(zhì)信息。由圖5-b可知,根據(jù)不同接種方式的葡萄酒發(fā)酵特性,可以將其聚為3類。其中SX2位于PC2的正向端,與辛酸乙酯(A6)、癸酸乙酯(A11)、甲酸苯乙酯(A18)、月桂酸乙酯(A13)、正戊醇(B11)和香茅醇(D1)等物質(zhì)的相關(guān)性強,主要為葡萄酒香氣貢獻了比較濃郁的花香和果香。CK位于PC1正向端,與乙酸異戊酯(A3)、辛酸甲酯(A5)、癸酸甲酯(A10)、硬脂酸乙酯(A7)、壬酸乙酯(A9)、1-壬醇(B7)、庚醇(B5)、己酸(C5)、異丁酸(C3)和3-羥基月桂酸(C2)等物質(zhì)有密切的聯(lián)系,主要為葡萄酒香氣貢獻了果香和花香,但同時也增加了葡萄酒的不良風(fēng)味。SX1、SX3和SX4位于PC1和PC2的負(fù)向端,說明這幾種接種方式釀造的葡萄酒香氣特征差,不適合用于高質(zhì)量葡萄酒的釀造。通過主成分分析,可以看出不同間隔天數(shù)的順序接種處理與對照組之間有較大的香氣差異,其中SX2能夠在一定程度上增加葡萄酒的香氣。

a中A1～A18為酯類物質(zhì);B1～B17為醇類物質(zhì);C1～C10為酸類物質(zhì);D1～D4為萜烯物質(zhì)a-因子載荷圖；b-樣品分布圖圖5 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖和樣品分布圖Fig.5 Loading plot and score plot from principal component analysis of volatile aroma compounds

2.5 感官分析

對供試酒樣進行感官分析(圖6),各試驗組在顏色、甜度、余味和優(yōu)雅度方面的得分無明顯差異。在口感方面,各處理組的酸度得分略低于對照組,SX2的得分略低于其他3個處理組,表明SX2的酒樣降酸效果明顯。

圖6 感官分析雷達圖Fig.6 Radar map of sensory analysis

在香氣方面,SX2和對照組之間的濃郁度沒有顯著差異,SX1、SX3和SX4的濃郁度略低于對照組,且SX1、SX3和SX4之間的濃郁度無差異,這與香氣化合物主成分分析的結(jié)果一致,處理組的香氣典型性略高于對照組,SX1、SX2和SX3的香氣典型性略高于SX4,表明S.pombe和釀酒酵母順序接種方式能夠增加葡萄酒的典型性。

在整體評分方面,SX2酒樣的分值略高于其他供試酒樣,具有良好的口感和較為濃郁的花香和果香。

3 結(jié)論

粟酒裂殖酵母與商業(yè)釀酒酵母分別以間隔6、8、10、12 d順序接種方式發(fā)酵‘黑比諾’干紅葡萄酒,對蘋果酸的降解能力顯著高于酒酒球菌,間隔8 d的接種發(fā)酵方式降解蘋果酸的能力顯著高于6、10、12 d的接種發(fā)酵；其次,間隔8 d的順序接種發(fā)酵與商業(yè)釀酒酵母單獨接種并經(jīng)過蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒樣相比能夠增加月桂酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、正戊醇、苯乙醇和香茅醇的含量,對葡萄酒花果香氣具有積極影響,能夠在一定程度上提升‘黑比諾’干紅葡萄酒的感官品質(zhì)。