代曉朋，宋 兵，牛霄英，蓋麗娜，張 麗，焦艷梅，傅占江，崔 澂

HBV感染是一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題，全世界有超過(guò)2.5億HBV攜帶者，每年約有78萬(wàn)人死于HBV相關(guān)性肝病[1-2]。HBV感染可引起免疫介導(dǎo)的肝損傷和癌變，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌[3]。盡管目前存在有效的疫苗和基于干擾素和核苷酸/核苷類(lèi)似物的治療策略，但徹底清除患者體內(nèi)的HBV仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[4-5]。因此，深入研究HBV復(fù)制和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，尋找新的有效抑制HBV感染和復(fù)制的靶點(diǎn)，有助于制定更好的治療策略來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV的控制。

微小 RNAs（microRNAs,miRNAs）是一類(lèi)由19～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA分子，miRNAs可以通過(guò)與靶基因的3′ -非翻譯區(qū)（untranslated region,UTR）完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)降解靶mRNA或抑制mRNA翻譯調(diào)控靶基因表達(dá)[6]。MiRNAs不僅參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)過(guò)程，而且參與復(fù)雜的宿主-病毒相互作用和病毒生命周期調(diào)控[7]。在病毒性肝炎等多種疾病中miRNAs表達(dá)異常，研究表明，miRNAs能調(diào)控HBV和HCV等病毒復(fù)制[8-10]。因此，對(duì)miRNAs的深入研究不僅有助于了解疾病發(fā)生的機(jī)制，也有助于開(kāi)發(fā)新型的治療癌癥和病毒感染藥物。

研究表明，miR-1231、miR-101、miR-581和miR-199a-5p等miRNAs參與調(diào)控HBV復(fù)制[11-14]。miRNAs參與癌癥的發(fā)展和纖維化的形成，提示它們?cè)诳刂埔倚透窝祝ㄒ腋危┫嚓P(guān)的肝臟病理?yè)p傷（如肝細(xì)胞癌和肝纖維化）方面具有潛在的治療優(yōu)勢(shì)[15-16]。但是，絕大多數(shù)miRNAs在HBV復(fù)制中的作用仍不明確，尋找新的調(diào)控HBV復(fù)制的miRNAs，深入研究miRNAs在病毒-宿主中的相互作用，對(duì)于制定新的更有效的控制病毒感染和抗病毒治療的策略具有十分重要的意義。

MiR-27a在肝臟中表達(dá)豐富，有研究表明，肝癌患者血循環(huán)中miR-27a的表達(dá)水平較健康者、慢性乙肝患者以及肝硬化患者降低[17]。HBV相關(guān)肝癌組織中miR-27a較其癌旁組織表達(dá)增加，且過(guò)表達(dá)miR-27a可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，縮短細(xì)胞的周期[18]。另外，分離HBV感染者血液中的HBsAg顆粒，可以檢測(cè)到HBsAg攜帶的包括miR-27a在內(nèi)的多個(gè)miRNAs，這些miRNAs可能與病毒的分布、持續(xù)感染和致病有關(guān)[19]。上述研究結(jié)果提示，miR-27a可能在HBV-宿主相互作用中發(fā)揮重要的作用。

本研究首先檢測(cè)了miR-27a在HBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系HepG2.2.15和對(duì)照細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)差異。然后，運(yùn)用生物信息學(xué)和功能實(shí)驗(yàn)方法，闡明了miR-27a在調(diào)節(jié)HBV復(fù)制和表達(dá)中的作用及潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 腺病毒Ad-HBx、pcDNA3.1-HBx等HBV蛋白表達(dá)載體由本研究室留存。MiR-27a mimics、miR-27a inhibitor及其無(wú)關(guān)陰性對(duì)照（negative control,NC）由 GenePharma Co.Ltd.（中國(guó)上海）合成；HBsAg診斷試劑盒、HBeAg檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；HBsAg測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）、HBeAg測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自北京中同蘭博醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司；HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┵?gòu)自凱杰生物工程（深圳）有限公司；GoScript Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq qPCR Master Mix定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。連接酶、pMD-18T載體等基因克隆及表達(dá)相關(guān)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HBXIP 抗體（H-5）購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7由本實(shí)驗(yàn)室留存，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。HepG2.2.15（由HepG2細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1.3倍全長(zhǎng)HBV獲得）由本實(shí)驗(yàn)室留存，培養(yǎng)條件為含380 μg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)基。細(xì)胞均在37 ℃含5% CO2的恒溫孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)換液。

將HBx全長(zhǎng)序列克隆pcDNA3.1質(zhì)粒中，構(gòu)建重組pcDNA3.1-HBx表達(dá)載體；將HBx 3′ UTR的基因序列克隆到報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3中，構(gòu)建重組 pGL3-HBx 3′ UTR；構(gòu)建 HBx 3′ UTR 靶位點(diǎn)突變報(bào)告基因檢測(cè)載體pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant?？寺?gòu)建、靶位點(diǎn)突變等相關(guān)引物見(jiàn)表1。

表1 引物和序列Table 1 Primers and sequences

提前24 h將要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后鋪6孔板（5×106個(gè)/孔）或 12 孔板（5×105個(gè)/孔）（轉(zhuǎn)染時(shí)每組3個(gè)重復(fù)），16～18 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%～95%融合度用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。mRNA和蛋白質(zhì)檢測(cè)于72 h后收集細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)于48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR,qRTPCR）檢測(cè)miRNA、mRNA和HBV DNA 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，首先按照 TRIzol Reagent（invitrogen）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，檢測(cè)基因表達(dá)水平。根據(jù)GoScript Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16 ℃退火30 min，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min。然后根據(jù)Go Taq qPCR Master Mix定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，取2 μl反轉(zhuǎn)錄的cDNA，分別以U6 snRNA和β-actin為miRNAs和HBV mRNA檢測(cè)內(nèi)參，檢測(cè)miR-27a、HBV mRNA相對(duì)表達(dá)水平（反轉(zhuǎn)錄及定量檢測(cè)引物見(jiàn)表1）。反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線。用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[20]。HBV DNA檢測(cè)按照HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┱f(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 ELISA檢測(cè)HBsAg、HBeAg吸光度及濃度 吸光度檢測(cè)根據(jù)HBsAg診斷試劑盒、HBeAg檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；濃度檢測(cè)根據(jù)HBsAg測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）、HBeAg測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 Western blot檢測(cè)HBx蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理：將細(xì)胞用PBS清洗，用胰酶消化后收集細(xì)胞，加入適量的冰上預(yù)冷的裂解液（含蛋白酶抑制劑）置于冰上10～20 min裂解細(xì)胞，12 000×g 4 ℃離心5 min去除細(xì)胞碎片，取等量樣品加5×loading buffer煮沸10 min 后上樣。電泳：以初始電壓為 60 V的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)樣品跑到濃縮膠與分離膠交界處時(shí)調(diào)為80 V，當(dāng)目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm左右結(jié)束。轉(zhuǎn)膜：使用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA，45 min。取出膜并用TBST洗膜液漂洗，在含5%牛奶的封閉液中封閉1 h。將一抗稀釋后室溫下輕搖孵育1 h，4 ℃靜置過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后用洗膜液洗5次，每次 8 min。根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，1∶1000稀釋?zhuān)谑覝貤l件下輕搖1 h。二抗孵育結(jié)束后用洗膜液洗5次，每次8 min。在暗室中顯色。

1.2.5 靶基因預(yù)測(cè) 使用ViTa（http://vita.mbc.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)miR-27a在HBV上的靶位點(diǎn)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將含有miR-27a結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-HBx 3′ UTR或結(jié)合位點(diǎn)突變的pGL3-HBx 3′ UTR-M與miR-27a表達(dá)質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK）按照 Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后用PBS清洗細(xì)胞，加入Passive Lysis Buffer裂解細(xì)胞，室溫震蕩15 min。按照說(shuō)明書(shū)分別加入裂解液檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度和內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。RLU1為螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2 為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，相對(duì)熒光強(qiáng)度為Ratio=RLU1/ RLU2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示。2組熒光素酶相對(duì)活性、mRNA和miRNAs表達(dá)水平的比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MiR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響 將miR-27a mimics及NC分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a表達(dá)水平，結(jié)果如圖1A所示，miR-27a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-27a表達(dá)水平顯著升高。進(jìn)一步探究miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響，將miR-27a mimics及NC分別與pHBV1.2組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)HBV DNA和HBV RNA的影響，結(jié)果如圖1B（HBV DNA）和圖1C（HBV RNA）所示，miR-27a表達(dá)抑制HBV DNA和HBV RNA，提示miR-27a抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；ELISA檢測(cè)miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)HBeAg和HBsAg的影響，吸光度檢測(cè)結(jié)果如圖1D（HBeAg）和圖1E（HBsAg）所示，濃度檢測(cè)結(jié)果如圖1F（HBeAg）和圖1G（HBsAg）所示，結(jié)果提示miR-27a過(guò)表達(dá)抑制HBeAg和HBsAg表達(dá)，提示miR-27a抑制HBV蛋白表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，在肝癌細(xì)胞系Huh7中，miR-27a過(guò)表達(dá)抑制了HBV復(fù)制和表達(dá)。

圖1 MiR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響A.MiR-27a mimics及NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，miR-27a相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)；B～G.MiR-27a mimics及NC分別與pHBV1.2組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，HBV復(fù)制和表達(dá)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，HBV DNA（B）、HBV RNA（C）、HBeAg 吸光度（D）、HBsAg 吸光度（E）、HBeAg 濃度（F）、HBsAg 濃度（G）Figure 1 Effect of miR-27a overexpression on HBV replication and expression

2.2 抑制內(nèi)源性miR-27a表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響 將miR-27a inhibitor及NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a表達(dá)水平，結(jié)果如圖2A所示，轉(zhuǎn)染miR-27a inhibitor后miR-27a表達(dá)水平顯著降低，提示miR-27a inhibitor可有效抑制miR-27a表達(dá)。將miR-27a inhibitor及NC分別與pHBV1.2組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，qRTPCR檢測(cè)抑制內(nèi)源性miR-27a對(duì)HBV DNA和HBV RNA的影響，結(jié)果如圖2B（HBV DNA）和圖2C（HBV RNA）所示，抑制內(nèi)源性miR-27a使HBV DNA和HBV RNA表達(dá)水平升高，提示抑制內(nèi)源性miR-27a表達(dá)能夠促進(jìn)HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；ELISA檢測(cè)抑制內(nèi)源性miR-27a對(duì)HBeAg和HBsAg的影響，吸光度檢測(cè)結(jié)果如圖2D（HBeAg）和圖2E（HBsAg）所示，濃度檢測(cè)結(jié)果如圖2F（HBeAg）和圖2G（HBsAg）所示，結(jié)果顯示抑制內(nèi)源性miR-27a表達(dá)促進(jìn)HBeAg和HBsAg表達(dá)，提示miR-27a促進(jìn)HBV蛋白表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，在肝癌細(xì)胞系Huh7中，抑制內(nèi)源性miR-27a表達(dá)促進(jìn)了HBV復(fù)制和表達(dá)。

圖2 抑制內(nèi)源性miR-27a表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響A.MiR-27a inhibitor及NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，miR-27a相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)；B～G.MiR-27a inhibitor及NC分別與pHBV1.2組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，HBV復(fù)制和表達(dá)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，HBV DNA（B）、HBV RNA（C）、HBeAg 吸光度（D）、HBsAg 吸光度（E）、HBeAg 濃度（F）、HBsAg 濃度（G）Figure 2 Effect of downregulation of endogenous miR-27a expression on HBV replication and expression

2.3 MiR-27a直接靶向HBx 以上研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)，進(jìn)一步分析miR-27a調(diào)控HBV復(fù)制和表達(dá)的分子機(jī)制。推測(cè)存在兩種可能的機(jī)制，第一種是miR-27a通過(guò)直接靶向HBV RNA而抑制HBV復(fù)制和表達(dá)；第二種是miR-27a通過(guò)靶向HBV復(fù)制過(guò)程中的調(diào)控因子而間接影響HBV復(fù)制和表達(dá)。通過(guò)ViTa在線預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HBx含有miR-27a的靶位點(diǎn)，如圖3A所示 。

圖3 MiR-27a直接靶向HBxA.MiR-27a與HBx的結(jié)合位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)；B.MiR-27a mimics/miR-27a inhibitor及其各自的NC分別與miR-27a結(jié)合位點(diǎn)的HBx報(bào)告基因載體組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度；C.MiR-27a mimics及NC分別與miR-27a結(jié)合位點(diǎn)突變HBx報(bào)告基因載體組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度；D～E.MiR-27a mimics及NC分別與HBx表達(dá)載體組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測(cè)HBx RNA（D）和HBx蛋白（E）Figure 3 MiR-27a targets HBx directly

將miR-27a mimics/miR-27a inhibitor及相應(yīng)的NC分別與pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)雙螢光素酶活性，結(jié)果如圖3B所示，miR-27a使含有HBx 3′ UTR的報(bào)告基因活性降低。進(jìn)一步將HBx上miR-27a的結(jié)合位點(diǎn)突變（突變位點(diǎn)如圖3A所示），構(gòu)建含有HBx 3′ UTR突變序列的報(bào)告基因載體pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant，將 miR-27a mimics及其 NC 分 別 與 pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant組 合 轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)雙螢光素酶活性，結(jié)果如圖3C所示，miR-27a表達(dá)對(duì)含有突變位點(diǎn)的報(bào)告基因活性沒(méi)有顯著影響。以上結(jié)果提示miR-27a能夠直接靶向HBx RNA。進(jìn)一步構(gòu)建含有HBx序列的表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx，探究miR-27a對(duì)HBx RNA及蛋白表達(dá)的影響，將miR-27a mimics及NC分別與pcDNA3.1組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)HBx RNA，結(jié)果如圖3D所示，western blot檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3E所示，轉(zhuǎn)染miR-27a能夠抑制HBx RNA和蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示，miR-27a能夠直接靶向HBx RNA，從而間接抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。

2.4 HBV對(duì)miR-27a表達(dá)的影響 將pHBV1.2及其空載體轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a表達(dá)水平，結(jié)果如圖4A所示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pHBV1.2使miR-27a的表達(dá)水平下降，提示HBV能夠抑制miR-27a的表達(dá)。與對(duì)照細(xì)胞HepG2的miR-27a表達(dá)水平相比，穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞miR-27a表達(dá)水平顯著降低，如圖4B所示。由于miR-27a能夠直接靶向HBx 3′ UTR，本研究將表達(dá)HBx的腺病毒（Ad-HBx）感染Huh7細(xì)胞，檢測(cè)HBx的表達(dá)對(duì)miR-27a的影響，結(jié)果如圖4C所示，Ad-HBx感染Huh7細(xì)胞使miR-27a表達(dá)水平下降，提示HBx使miR-27a表達(dá)水平降低。

圖4 HBV對(duì)miR-27a表達(dá)的影響A.pHBV1.2及其對(duì)照（Ctr）轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a相對(duì)表達(dá)；B.qRT-PCR檢測(cè)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞miR-27a相對(duì)表達(dá)；C.Ad-HBx表達(dá)載體和空腺病毒Ad感染Huh7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)miR-27a相對(duì)表達(dá)Figure 4 Effect of HBV on miR-27a expression

3 討 論

HBV感染是導(dǎo)致活動(dòng)性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌等肝臟疾病的主要因素[21]。盡管針對(duì)HBV感染的診斷和治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但這并不能從根本上消除HBV感染[22]。因此，亟需尋找和開(kāi)發(fā)新的抗HBV靶點(diǎn)和藥物。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNAs在HBV感染中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MiR-27a在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括基因多態(tài)性、腫瘤發(fā)生、增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移和血管生成[23]。在患肝癌的肥胖患者中，miR-27a通過(guò)靶向FOXO1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[24]。MiR-27a在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR-γ的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，并作為癌基因在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[25]。然而，miR-27a在HBV感染中的潛在作用和分子機(jī)制仍未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染的肝癌細(xì)胞Huh7中miR-27a表達(dá)水平顯著降低；隨著miR-27a表達(dá)水平的升高，Huh7細(xì)胞中HBV RNA、HBV DNA、HBeAg和HBsAg等HBV復(fù)制和基因表達(dá)的指標(biāo)顯著降低；抑制內(nèi)源性miR-27a的表達(dá)能夠促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá)。提示miR-27a可能是一種潛在的HBV復(fù)制抑制因子。

MiRNAs調(diào)控HBV的機(jī)制主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)是miRNAs直接靶向作用于HBV的轉(zhuǎn)錄本，如 miR-125a-5p、miR-199a-3p、miR-210、miR-1231，其中miR-125a-5p和miR-199a-3p靶位點(diǎn)位于表面蛋白和聚合酶重疊的編碼區(qū)域，而miR-210的靶位點(diǎn)位于pre-s1編碼區(qū)域，miR-1231靶向 HBV 核心蛋白 mRNA[12，26]。第二類(lèi)是通過(guò)作用于相關(guān)的細(xì)胞蛋白影響HBV生命周期，如miR-146a靶向 flap endonuclease 1[27]，miR-802靶向SMARCE1分 子[28]，miR-200c靶 向 nuclear factor IA[29]，miR-302c-3p 靶 向 BMPR2[30]，miR-185-5p 靶向 ELK1分子等[31]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可以直接靶向HBx 3′ UTR，抑制HBx轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)。

研究表明，HBV X蛋白可以引起宿主miRNAs的變化，如：HBx 促進(jìn)miR-29a和miR-143表達(dá)，抑制miR-101、miR-122、miR-132、miR-148a、miR-152、let-7和miR-16家族的成員表達(dá)[32]。目前HBV影響miRNA表達(dá)的分子機(jī)制主要有兩種，一種是HBV mRNA通過(guò)自身含有的miRNAs互補(bǔ)位點(diǎn)與miRNAs結(jié)合，這樣細(xì)胞內(nèi)大量的HBV RNA起到海綿體作用從而抑制其miRNAs發(fā)揮作用，例如miR-122和miR-15a[33-34]；另一種是轉(zhuǎn)錄因子參與HBV對(duì)miRNAs的調(diào)控，如c-Myc參與HBx對(duì)miR-15a/16的抑制作用[35]。本研究表明miR-27a可以直接靶向HBx 3′ UTR，提示在HBV感染中，HBx的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能作為“海綿體”與miR-27a結(jié)合，從而使miR-27a表達(dá)水平降低。

本研究尚有不足之處，由于缺乏體內(nèi)研究，可能會(huì)削弱miR-27抑制HBV復(fù)制和表達(dá)的證據(jù)。HBV感染導(dǎo)致miR-27a表達(dá)水平下降，但是有研究表明在肝癌中miR-27a的表達(dá)水平升高，因此，miR-27a在HBV相關(guān)的肝癌中的變化及臨床意義須要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-27a在HBV感染的Huh7細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；miR-27a通過(guò)直接靶向抑制HBx mRNA進(jìn)而抑制了HBV復(fù)制和表達(dá)。上述研究結(jié)果提示，miR-27a在HBV-宿主的相互作用中發(fā)揮重要作用，miR-27a可作為一種潛在的控制病毒感染的治療靶點(diǎn)。