崔小緩 蔣興旺# 張延平 李麗娜 冉桃桃 畢欣欣佟明望 段國英 陳浩 陳援凱 劉倩 韓靈

咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux, LPRD)是指胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位，引起一系列癥狀和體征的總稱[1],其發(fā)病機(jī)制不明，癥狀復(fù)雜多樣，體征無特異性，缺乏診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，給該病的診斷和治療帶來很多困惑，亟待進(jìn)行深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)LPRD患者普遍存在食管上括約肌低張力、食管體部運動能力減退等胃腸道動力異?，F(xiàn)象[2]，但原因不清楚。

咽喉部微生態(tài)失衡、致病菌占據(jù)優(yōu)勢時，可能引起感染和炎癥，而胃內(nèi)容物進(jìn)入咽喉及口腔可進(jìn)一步加重患者咽喉部菌群失調(diào)程度[3]；有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可以使喉-食管上括約肌和咽-食管括約肌感受器功能下降，有可能誘發(fā)LPRD[4]，因此咽部微生物狀態(tài)可能與LPRD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但由于口腔和咽部微生物受環(huán)境因素影響遠(yuǎn)大于基因背景的影響程度[5]，給研究該部位微生態(tài)環(huán)境帶來一定的困難。有研究發(fā)現(xiàn)胃液、口腔[6,7]、喉[8]、食管遠(yuǎn)端[9]、胃粘膜[8]和糞便[10]中放線菌、擬桿菌門、厚壁菌門、梭菌門和變形菌門均占主導(dǎo)地位，口腔微生物與腸道菌群間種群重復(fù)率可以達(dá)到45%[11]，59%的口腔微生物會頻繁向腸道轉(zhuǎn)移和定植[12]，提示腸道菌群與口腔和咽、喉菌群組成具有一致性，腸道菌群變化情況在一定程度上可以反映口腔及咽喉部微生物狀態(tài)。本研究通過16S rDNA測序方法對LPRD患者與健康人腸道菌群的多樣性和差異性進(jìn)行研究，希望為探索LPRD發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)好的診斷和治療方法提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 從2019年1～5月就診于解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心耳鼻喉科門診疑似LPRD的患者中，以隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)選取30例為LPRD組，其中男21例，女9例，年齡8～60歲，平均37.17±12.15歲;以與病例組性別、年齡相匹配的健康志愿者30例為對照組，其中男女各15例，年齡10～64歲，平均34.63±9.81歲。

LPRD組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合LPRD診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，有咽部不適癥狀，病史1個月以上，RSI>13；對照組納入標(biāo)準(zhǔn)為無咽喉及胃部不適，無全身性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):①結(jié)核病、紅斑狼瘡、麻風(fēng)、莖突綜合征、梅毒等可能引起咽部特異性炎癥表現(xiàn)的全身性疾病；高血壓、糖尿病、惡性腫瘤及相關(guān)手術(shù)史；②胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)〔既往診斷GERD或胃食管返流病自測表(GerdQ)量表評分≥8視為GERD〕；③1個月內(nèi)服用抗生素或微生態(tài)制劑；④2周內(nèi)服用質(zhì)子泵抑制劑;⑤1個月內(nèi)飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣有變化。

本研究經(jīng)過解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(309201905171045)，入組前征得患者本人同意，并簽署知情同意書。

1.2腸道菌群檢測標(biāo)本采集 LPRD組、對照組均采用TinyGene糞便微生物DNA采集保存套裝(CJ-01KA，上海微基生物技術(shù)有限公司)按照說明書留取糞便，-20 ℃冰箱存儲待檢測。

1.3腸道菌群檢測方法

1.3.116S rDNA測序 由上海微基生物技術(shù)有限公司完成，DNA獲取與質(zhì)檢：糞便樣本采用化學(xué)裂解法裂解細(xì)胞膜及細(xì)胞核膜，提取DNA，以樣本提取的DNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增16S rDNA基因的V4-V5區(qū)域；全部PCR產(chǎn)物回收、定量，均一化混勻后完成文庫構(gòu)建，在IlluminaMiSeq 2×300 bp平臺上完成測序。

1.3.2生物信息學(xué)分析 對測得的原始數(shù)據(jù)通過barcode分配樣品reads，得到每個樣本的有效序列，采用Trimmomatic軟件，將測序結(jié)果末端低質(zhì)量的序列去掉，根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，采用flash軟件將成對的reads 拼接成一條序列，同時采用mothur軟件對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，將模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)、過長和過短的序列以及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體去除，從而得到優(yōu)化序列，之后進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)聚類(UPARSE software)，OTU代表序列與silva 128數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種信息注釋?；诜诸悓W(xué)信息，在門、綱、目、科、屬、種分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。利用Mothur(Version 1.33.3)進(jìn)行Alpha多樣性、Beta多樣性分析，物種的差異分析采用LEfSe方法。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 在進(jìn)行統(tǒng)計分析之前，進(jìn)行Shapiro-Wilk test方法檢驗來評估所有定量變量的分布正態(tài)性。采用配對樣本t檢驗或kruskal_wilcox非參數(shù)檢驗行統(tǒng)計學(xué)分析；除有特殊說明數(shù)據(jù)外，其余數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1物種單元分類及OTU聚類 共獲得2 364 658條有效序列,平均每個樣本的序列數(shù)目為39 410.97±5 513.34條,序列長度主要集中在247～451 bp之間,平均長度為410.15±0.44 bp。對照組30例標(biāo)本共1 205 013條有效序列，其平均序列數(shù)目為40 417.1±4 920.23條，進(jìn)行OTU聚類后得到1 027 170條優(yōu)化序列(平均序列數(shù)目為34 239±4 188.42條)；LPRD組30例標(biāo)本共1 159 645條有效序列，其平均序列數(shù)目為38 654.83±6 037.38條，進(jìn)行OTU聚類后得到967 183條優(yōu)化序列(平均序列數(shù)目為32 239.43±5 485.52條)。兩組間有效序列數(shù)、優(yōu)化序列數(shù)含量均無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.29，P=0.12)。

2.2腸道菌群稀釋性曲線分析 稀釋性曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線。它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。從圖1可以看出，隨著抽樣數(shù)量的增加，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，基本達(dá)到測序深度。

圖1 LPRD患者和健康對照組腸道菌群的稀釋性曲線

2.3腸道菌群的物種分布及多樣性分析 60個樣本中的1 994 353條優(yōu)化序列歸至細(xì)菌界的10個門、19個綱、29個目、47個科、116個屬、130個種，99.99%的菌群可以劃分到10個菌門中,其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、軟壁菌門占菌群的99.37%。

2.3.1α多樣性分析 LPRD組患者腸道菌群Ace指數(shù)、Chaoz指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)略高于對照組，辛普森指數(shù)略低于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示與健康人相比，LPRD患者腸道菌群豐度和多樣性均無明顯改變(圖2)。

圖2 LPRD組與健康對照組間alpha多樣性分析 分別采用ace 指數(shù)(P=0.50)、chao指數(shù)(P=0.41)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(P=0.94)、香農(nóng)指數(shù)(P=0.28)、辛普森指數(shù)(P=0.30)、sobs指數(shù)(P=0.56)行兩組間alpha多樣性分析均無顯著差異

2.3.2β多樣性分析 主坐標(biāo)分析(PCoA)：橫坐標(biāo)表示一個主成分，縱坐標(biāo)表示另一個主成分，百分比表示主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖3中的每個點表示一個樣品，以TM和TF開頭的為LPRD組，以CM和CF開頭的為對照組。如果樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。如圖3所示，LPRD組和對照組樣本較為聚集未出現(xiàn)明顯分離傾向，說明兩組菌群的物種組成無明顯差異。

圖3 LPRD組與健康對照組間Beta多樣性分析

2.4LPRD組和對照組腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異分析

2.4.1門水平差異菌分析 在門分類水平上，厚壁菌門相對豐度在兩組中均為最高，相對豐度最高的前5位一致，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門，與對照組相比，LPRD組放線菌門相對豐度顯著高于對照組(P=0.03，圖4)。

2.4.2綱水平差異菌分析 LPRD組放線菌門的紅蝽菌綱相對豐度顯著高于對照組(P=0.011，圖4)。

2.4.3目水平差異菌分析 LPRD組紅蝽菌目相對豐度顯著高于對照組(P=0.011)，假單胞菌目相對豐度顯著低于對照組(P=0.018，圖4)。

2.4.4科水平差異菌分析 LPRD組紅蝽菌科、鏈球菌科相對豐度顯著高于對照組(P=0.011，P=0.048)，生絲微菌科、假單胞菌科相對豐度顯著低于對照組(P=0.022，P=0.04，圖4)。

2.4.5屬水平差異菌分析 LPRD組瘤胃球菌屬、柯林斯氏菌屬相對豐度顯著高于對照組(P=0.007 9，P=0.004 5)，海洋桿菌屬、假單胞菌屬相對豐度顯著低于對照組(P=0.022 2，P=0.040 1，圖4)。

2.4.6種水平差異菌分析 LPRD組普雷沃氏菌種、梭狀桿菌種、乳桿菌種相對豐度顯著高于對照組(P=0.02，P=0.037，P=0.042，圖4)。

圖4 不同分類水平兩組腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異

2.4.7LPRD組與對照組腸道菌群LEfSe差異分析 在LDA值≥2的條件下，兩組中有顯著性差異的物種有9種，其中有2個在對照組富集，即生絲菌科(P=0.022)和海洋桿菌屬(P=0.022)，另外7個在LPRD組富集，即放線菌門(P=0.030)、紅蝽菌綱(P=0.010)、紅蝽菌目(P=0.010)、紅蝽菌科(P=0.010)、柯林斯氏菌屬(P=0.004)、瘤胃球菌屬(P=0.008)和普雷沃氏菌種(P=0.019)(圖5)，其中普雷沃氏菌在對照組樣品中相對豐度為零，提示LPRD患者腸道菌群發(fā)生菌群失調(diào)，上述物種可能與LPRD有關(guān)(圖6)。

圖5 LEfSe差異分析LPRD組與健康對照組物種間差異 在LDA值≥2的條件下，兩組中有顯著性差異的物種有9種，生絲菌科(P=0.022)和海洋桿菌屬(P=0.022)在對照組富集，放線菌門(P=0.030)、紅蝽菌綱(P=0.010)、紅蝽菌目(P=0.010)、紅蝽菌科(P=0.010)、柯林斯氏菌屬(P=0.004)、瘤胃球菌屬(P=0.008)和普雷沃氏菌種(P=0.019)在LPRD組富集

圖6 普雷沃氏菌種在LPRD組與健康對照組腸道相對豐度 兩組間LEfSe差異分析普雷沃氏菌種相對豐度比較，對照組相對豐度趨向于零，提示了明顯的差異

3 討論

本研究采用16S rDNA測序的方法比較了LPRD患者與健康對照者腸道菌群的差異，對LPRD組和對照組腸道微生物菌群多樣性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示代表腸道菌群豐度指數(shù)的Ace和Chao指數(shù)以及代表腸道菌群多樣性的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均無明顯差異，PCoA分析顯示LPRD組和對照組樣本較為聚集未出現(xiàn)明顯分離傾向，提示LPRD患者較正常人腸道菌群豐度和多樣性均無明顯改變。對兩組腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)顯著差異菌，門、綱、目、科、屬、種各水平分析顯示放線菌門、紅蝽菌綱、紅蝽菌目、紅蝽菌科、鏈球菌科、瘤胃球菌屬、柯林斯氏菌屬、普雷沃氏菌種、梭狀桿菌種、乳桿菌種相對豐度LPRD組高于對照組，假單胞菌目、生絲微菌科、假單胞菌科、海洋桿菌屬、假單胞菌屬相對豐度對照組高于LPRD組。采用LEfSe組間群落差異分析兩組腸道菌群，顯示放線菌門、紅蝽菌綱、紅蝽菌目、紅蝽菌科、柯林斯氏菌屬、瘤胃球菌屬、普雷沃氏菌種在LPRD組富集，生絲菌科、海洋桿菌屬在健康對照組富集。放線菌門、紅蝽菌綱、紅蝽菌目、紅蝽菌科、柯林斯氏菌屬、瘤胃球菌屬、普雷沃氏菌種可能為LPRD組的標(biāo)志物，提示這些優(yōu)勢菌與LPRD可能具有相關(guān)性，可能在LPRD發(fā)生和發(fā)展中起作用。

胃腸道與支配其活動的神經(jīng)中樞之間形成了一個雙向的神經(jīng)通路，稱為腦-腸軸，而腸道菌群與腦腸軸之間還存在著密切的雙向聯(lián)系，構(gòu)成了微生物-腦-腸軸。迷走神經(jīng)含有80%的傳入神經(jīng)纖維，分布于胃腸道各個部位，通過感知其中的各種變化，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞信息，在微生物和大腦溝通中起重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)LPRD患者普遍存在迷走神經(jīng)功能減低，以及交感神經(jīng)功能的亢進(jìn)[14]，腸道菌群是否通過微生物-腦-腸軸影響自主神經(jīng)功能、引起胃腸動力異常與LPRD的發(fā)病相關(guān)，目前還不清楚。Henke等[15]發(fā)現(xiàn)Crohn’s病患者腸道瘤胃球菌屬合成活躍并分泌一種具有鼠李糖骨架鏈和葡萄糖側(cè)鏈的復(fù)合葡聚糖多糖，這種葡聚糖多糖很有可能作用于TLR4，能有效誘導(dǎo)樹突細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子(TNFα)，提示瘤胃球菌屬在腸道炎癥反應(yīng)中可能起作用；Jie[16]的研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者腸道內(nèi)瘤胃球菌屬增多，提示瘤胃球菌屬與冠心病的發(fā)生有相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)TLR4信號傳導(dǎo)通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一，腎小管上皮細(xì)胞、心臟、呼吸道上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞也均表達(dá)TLR4[17]。Hoyles等發(fā)現(xiàn)腸道菌群的代謝產(chǎn)物可以通過TLR4信號通路對血腦屏障起調(diào)節(jié)作用[18]，而迷走神經(jīng)傳入纖維上表達(dá)TLR4，這些纖維能感知細(xì)菌產(chǎn)物[19]，本研究中瘤胃球菌屬在LPRD組富集，為其優(yōu)勢菌，推測腸道瘤胃球菌屬的代謝產(chǎn)物通過作用于迷走神經(jīng)傳入纖維的TLR4調(diào)節(jié)大腦，并通過迷走神經(jīng)傳出纖維調(diào)節(jié)食管、胃腸道，在LPRD發(fā)病中起作用。

放線菌門是目前公認(rèn)的主要譜系中最大的分類學(xué)單位之一[20]，GERD患者遠(yuǎn)端食管組織中存在放線菌的富集，可能在GERD發(fā)病中起作用[21]。神經(jīng)系統(tǒng)通過膽堿能抗炎通路參與炎癥的調(diào)節(jié)[22,23]，也就是迷走神經(jīng)將炎癥信號傳入中樞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過整合促使迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿，后者與炎癥細(xì)胞表面的α7亞基N型膽堿能受體(α7 nicotinic acetylcholine receptors,α7nACHR)結(jié)合，調(diào)控炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)放線菌中的肽聚糖相關(guān)脂蛋白具有誘導(dǎo)TLR2和TLR4表達(dá)增加的作用[24，25]。本研究結(jié)果顯示LPRD組不僅放線菌門相對豐度顯著高于健康對照組，而且同屬于放線菌門的紅蝽菌綱、紅蝽菌目、紅蝽菌科、柯林斯氏菌屬均在LPRD組富集，為其優(yōu)勢菌。推測放線菌在LPRD患者腸道中富集，增加迷走神經(jīng)傳入纖維上的TLR表達(dá)，對腸道菌群的炎性代謝產(chǎn)物更加敏感，一方面通過傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺激釋放大量乙酰膽堿，使迷走神經(jīng)傳出活性增強(qiáng)，激活膽堿能抗炎通路試圖抑制炎癥反應(yīng)，另一方面有些放線菌還可合成膽堿酯酶抑制劑，產(chǎn)生擬膽堿樣作用，進(jìn)一步激活迷走神經(jīng)傳出活性；大量的乙酰膽堿則激活了N受體[26]，使自主神經(jīng)節(jié)突觸傳遞受阻，迷走神經(jīng)功能下降，可能引起食管括約肌、食管體部甚至等胃腸道動力改變，從而與LPRD發(fā)生有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)鏈球菌科、普雷沃氏菌種、梭狀桿菌種在LPRD組富集，為LPRD的優(yōu)勢菌。有學(xué)者認(rèn)為梭桿菌屬、普雷沃菌屬、消化鏈球菌屬等為牙髓根尖周病的優(yōu)勢菌[27]；一項單側(cè)鼻竇炎的鼻竇菌群研究發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬在上頜竇富集，為其感染菌[28]。這些研究提示梭桿菌屬、普雷沃菌屬、消化鏈球菌屬在一定的環(huán)境下為致病菌，可能與上氣道炎性疾病的發(fā)生相關(guān)。本研究通過LEfSe差異分析發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌種在健康對照組相對豐度為零，提示其可能在LPRD發(fā)病中起到更重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPRD患者腸道菌群與健康人相比雖然多樣性無顯著差異，但菌群結(jié)構(gòu)存在不同，表現(xiàn)為一些特定優(yōu)勢菌的富集，提示LPRD患者可能存在腸道菌群失調(diào)，腸道菌群與LPRD具有相關(guān)性，優(yōu)勢菌可能在LPRD發(fā)病中起作用。推測LPRD患者腸道優(yōu)勢菌或其代謝產(chǎn)物可能通過TLR通路作用于迷走神經(jīng)傳入纖維，通過微生物-腸-腦軸的整合作用，將信號傳遞到迷走神經(jīng)傳出纖維而引起食管上、下括約肌松弛和胃腸功能變化，在LPRD發(fā)病中起作用。因咽喉菌群與腸道菌群有一致性的特點，LPRD患者這些優(yōu)勢菌或其代謝產(chǎn)物可能直接作用于咽喉部黏膜或通過迷走神經(jīng)反射在LPRD發(fā)病中起作用。本研究只是初步對LPRD患者和健康人腸道菌群差異性進(jìn)行了研究，推測腸道菌群與LPRD可能存在相關(guān)性，具體機(jī)制還需要進(jìn)行深入的研究。