張雨，陳愛華，吳楊平，曹奕，陳素華，張志東,2，田鎮(zhèn),2，李秋潔,2

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306）

大竹蟶Solen grandis 俗稱蟶子王，是廣泛分布我國(guó)沿海的經(jīng)濟(jì)貝類之一，在江蘇呂四漁場(chǎng)內(nèi)如東、啟東一線歷來具有相當(dāng)?shù)馁Y源量。但近年來圍填海和港口建設(shè)等因素不同程度影響了海洋生境，大竹蟶呼吸代謝狀態(tài)受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)。本課題組嘗試進(jìn)行大竹蟶池塘養(yǎng)殖。轉(zhuǎn)向池塘養(yǎng)殖的大竹蟶因養(yǎng)殖地點(diǎn)的不同，海水鹽度、溫度及pH 等也存在顯著差異。研究表明，鹽度影響水生動(dòng)物鰓纖毛運(yùn)動(dòng)和心臟的跳動(dòng)[1,2]；溫度和pH 變化改變了生物體內(nèi)各種酶的活力，影響水生動(dòng)物的呼吸代謝[3,4]。耗氧率和排氨率是反映水生動(dòng)物呼吸代謝的重要指標(biāo)，估算貝類養(yǎng)殖容量的重要參數(shù)[5]。目前有關(guān)魚類[6-8]、甲殼類[9,10]及貝類[11-14]耗氧率和排氨率的研究均有報(bào)道。然而目前僅限于單一環(huán)境因素的研究，較少考慮環(huán)境因素的聯(lián)合作用。而研究多種環(huán)境聯(lián)合條件下大竹蟶的呼吸代謝狀況，對(duì)大竹蟶池塘健康養(yǎng)殖具有積極意義。

響應(yīng)面法是一種解決多變量問題的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法，主要通過提供合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、評(píng)價(jià)多種變量之間的交互作用而建立數(shù)學(xué)模型和三維立體響應(yīng)曲面圖形，最終得出最優(yōu)參數(shù)組合的多元回歸方程[15-17]。目前響應(yīng)面法已較多地運(yùn)用在工藝優(yōu)化和藥物研發(fā)等領(lǐng)域[18]，而在水產(chǎn)動(dòng)物中的運(yùn)用研究較少。本研究利用響應(yīng)面法研究鹽度、溫度和pH 三因素及其聯(lián)合效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，利用多元回歸方程模擬出大竹蟶耗氧率及排氨率最高時(shí)的養(yǎng)殖條件，以期為大竹蟶養(yǎng)殖條件優(yōu)化、人工苗種繁育和增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大竹蟶平均體質(zhì)量（5.42±0.23）g，取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所文蛤良種場(chǎng)，選取規(guī)格相似，健康無損的個(gè)體在聚乙烯水槽中暫養(yǎng)7 d，投喂105ind·mL-1的球等鞭金藻Isochrysis galbana，每日換水一次，實(shí)驗(yàn)開始前停喂1 d。

1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1 鹽度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

參照朱曉聞[4]等試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)在聚乙烯桶中的恒溫密閉呼吸瓶中進(jìn)行，每個(gè)桶中放3 個(gè)大竹蟶，溫度為26℃，pH 為7.82。用沙濾海水、海水晶和淡水將鹽度調(diào)節(jié)為22、25、28、31 和34，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在白天進(jìn)行，持續(xù)2 h，分別用溶氧儀和氨氮測(cè)定儀測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在精確度0.0001 g 的電子天平上精確稱量大竹蟶總重。

1.2.2 溫度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設(shè)5 個(gè)溫度梯度：20℃、23℃、26℃、29℃和32℃，每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，室溫為26℃，采用冰塊或加熱板調(diào)節(jié)溫度，實(shí)驗(yàn)鹽度為28，pH 為7.82。實(shí)驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

1.2.3 pH 對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設(shè)5 個(gè)pH 梯度：7、7.5、8、8.5 和9，每個(gè)pH 設(shè)3 個(gè)重復(fù)，室溫為26℃，通過添加NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH。實(shí)驗(yàn)鹽度為28，溫度為26℃。實(shí)驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

1.3 多因素實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大竹蟶耗氧率和排氨率為指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken 模型，選擇三因素三水平的中心組合方案，以鹽度、溫度和pH 為主要考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見表1，實(shí)驗(yàn)裝置及方法同1.2.1。

表1 因素水平表Tab.1 The design table of factors and levels

1.4 耗氧率及排氨率的測(cè)定

分別用YSI 溶氧儀和次溴酸鈉氧化法測(cè)定初始和結(jié)束時(shí)呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮含量。耗氧率OC 及排氨率AE 的計(jì)算公式如下：

式中：OC 為單位大竹蟶體質(zhì)量的耗氧率（mg·g-1·h-1），DO0和DOt分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)水中的溶解氧量（mg·L-1），AE 為單位體質(zhì)量的排氨率（μg·g-1·h-1），N0和Nt分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)水中NH4+-N 含量（mg·L-1），V 為呼吸瓶體積（L），W 為大竹蟶總重（g），t 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間（h）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2016 進(jìn)行整理，用SPSS19.0 進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，最后用Origin8.0 作圖。多因素實(shí)驗(yàn)根據(jù)Design-expert 8.0 軟件中BBD 模型設(shè)計(jì)，用該軟件進(jìn)行二元二次多項(xiàng)式回歸分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鹽度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖1 可知，鹽度顯著影響大竹蟶耗氧率與排氨率（P＜0.05），鹽度22～28 時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率均呈上升趨勢(shì)，在鹽度為28 時(shí)均達(dá)到最大值，OC=（0.48±0.10）mg·g-1·h-1，AE=（38.32±5.21）μg·g-1·h-1；鹽度超過28 時(shí)，耗氧率及排氨率均呈下降趨勢(shì)。單因素方差分析表明，鹽度28 時(shí)，顯著高于在鹽度22 與34 時(shí)的耗氧率（P＜0.05），與鹽度25和31 時(shí)的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；排氨率在鹽度28 時(shí)，顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）。

圖1 不同鹽度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.1 Effects of different salinities on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.2 溫度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

不同溫度下，大竹蟶耗氧率及排氨率如圖2 所示：在20～26℃時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率均隨溫度的升高而增加；在26℃時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率達(dá)峰值，OC=（0.49±0.07）mg·g-1·h-1，AE=（39.13±3.23）μg·g-1·h-1；超過26℃后，大竹蟶耗氧率及排氨率呈下降趨勢(shì)。單因素方差分析表明，26℃時(shí)顯著高于20℃、29℃及32℃的耗氧率（P＜0.05），與23℃時(shí)的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；溫度26℃時(shí)，排氨率顯著高于其他溫度組（P＜0.05）。

圖2 不同溫度對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.2 Effects of different temperature on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.3 pH 對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖3 可知：pH 為7.0～8.0 時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率均pH 的升高而升高；在pH 為8.0 時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率均達(dá)到峰值，OC=（0.49±0.04）mg·g-1·h-1，AE=（36.25±6.23）μg·g-1·h-1；超過8.0后，大竹蟶的耗氧率及排氨率下降。單因素方差分析表明，pH 為8 時(shí)，大竹蟶的耗氧率及排氨率顯著高于pH 為8.5 和9 時(shí)（P＜0.05），與pH7 和7.5 時(shí)的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；pH 為8 時(shí)，顯著高于在pH 為7、7.5 及9 時(shí)的排氨率（P＜0.05），與pH8.5時(shí)的排氨率差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同pH 對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.3 Effects of different pH values on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.2 多因素實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面法分析

按照BBD 設(shè)計(jì)了17 組多因素實(shí)驗(yàn)，通過RSM建立回歸模型，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，大竹蟶耗氧率及排氨率回歸模型的F 值分別為149.49 和465.47，P-value 均小于0.0001，表明BBD 優(yōu)化法可靠，變量對(duì)響應(yīng)值的影響極為顯著，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其次，兩個(gè)模型的擬合系數(shù)（R2）分別為0.9948 和0.9983，說明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值擬合度高。校正決定系數(shù)（Adj R2）分別為0.9882 和0.9962，均可解釋數(shù)據(jù)變異性的85%以上。精密度（Adeq Precisior）均大于25%，回歸模型可準(zhǔn)確用于結(jié)果分析。由表3 可知，溫度一次效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率的影響不顯著（P＞0.05）；鹽度和pH 一次效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）；鹽度、溫度及pH 交互效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率影響不顯著（P＞0.05），鹽度、溫度及pH 二次效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）。因此需要剔除交互作用項(xiàng)，然后對(duì)模型重新進(jìn)行回歸。根據(jù)方差分析結(jié)果得出大竹蟶耗氧率OC 與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項(xiàng)回歸方程。大竹蟶預(yù)測(cè)值OC 對(duì)編碼值自變量A、B 和C 的二次多項(xiàng)回歸方程為：OC=0.48-8.75×10-3A-5×10-3B-0.011C-0.088A2-0.1B2-0.098C2；大竹蟶預(yù)測(cè)值OC 對(duì)實(shí)際值自變量A、B 和C 的二次多項(xiàng)回歸方程為：OC=-39.51+0.56A+0.56B+6.27C-9.72×10-3A2-0.01B2-0.39C2。

由表4 可知，鹽度及pH 一次效應(yīng)對(duì)大竹蟶排氨率的影響顯著（P＜0.05），溫度對(duì)大竹蟶排氨率的影響不顯著（P＞0.05）；溫度與鹽度、鹽度與pH 交互效應(yīng)大竹蟶排氨率影響不顯著（P＞0.05），溫度與pH交互效應(yīng)對(duì)大竹蟶排氨率影響顯著（P＞0.05）；鹽度、溫度及pH 二次效應(yīng)對(duì)大竹蟶排氨率影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)方差分析結(jié)果得出大竹蟶排氨率AE與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項(xiàng)回歸方程大竹蟶預(yù)測(cè)值A(chǔ)E 對(duì)編碼值自變量A、B和C 的二次多項(xiàng)回歸方程。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design with the observed responses

表4 大竹蟶排氨率回歸模型方差分析Tab.4 ANOVA for the regression model of ammonia excretion rate (AE) in razor clam Solen grandis

大竹蟶預(yù)測(cè)值A(chǔ)E 對(duì)編碼值自變量A、B 和C的二次多項(xiàng)回歸方程為：AE=38.85+1.37A-0.30B+2.91C+0.085AB+0.19AC-0.87BC-6.75A2-7.89B2-11.54C2。

大竹蟶預(yù)測(cè)值A(chǔ)E 對(duì)實(shí)際值自變量A、B 和C 的二次多項(xiàng)回歸方程為：AE=-4238.24+41.23A+49.83B+755.92C+9.44×10-3AB+0.13AC-0.58BC-0.75A2-0.88B2-46.16C2。

根據(jù)所建立的上述數(shù)學(xué)模型，得出大竹蟶耗氧率及排氨率的最佳條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。

3 討論

鹽度對(duì)貝類呼吸和代謝有重要影響。一般認(rèn)為，鹽度的改變不僅影響貝類的攝食能力，還影響鰓纖毛運(yùn)動(dòng)和心臟的跳動(dòng)。鹽度過高或過低時(shí)，貝類會(huì)關(guān)閉進(jìn)出水管，緊閉雙殼，形成組織和外部條件的隔離，呼吸和排泄減慢[1,2]。本研究結(jié)果顯示：鹽度的一次效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率影響顯著（P＜0.05）。在鹽度22～31 范圍內(nèi)，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，鹽度28 時(shí)，耗氧率與排氨率最大。這與九孔鮑Haliotis diversicolor supertexta[19]、毛蚶Scapharca subcrenata[20]、褐菖鲉Sebastisucus marmoratus[21]及黃斑籃子魚Siganus oramin[22]等耗氧率及排氨率隨鹽度變化規(guī)律一致。

溫度的變化會(huì)引起生物體內(nèi)各種酶活力的變化，影響生物的新陳代謝[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度20～32℃時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，26℃時(shí)，大竹蟶耗氧率及排氨率最大。這與褶紋冠蚌Cristaria plicata、背角無齒蚌Anodonta woodiana、河蜆Corbicula fluminea、銅銹環(huán)棱螺Bellamya aeruginosa 等[23]耗氧率及排氨率變化規(guī)律相同。水體pH 不僅影響水產(chǎn)動(dòng)物新陳代謝，還會(huì)影響貝類血液的pH 和貝殼的分泌與形成[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)大竹蟶耗氧率和排氨率的影響極顯著（P＜0.01）。在pH 7.0～9.0 范圍內(nèi)，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規(guī)律，pH 為8 時(shí)，大竹蟶耗氧率與排氨率達(dá)到最大。這與縊蟶Sinonovacula constricta[5]、鯔Mugil cephalus[24]及 尖 紫 蛤Soletellina acuta[25]耗 氧率和排氨率變化規(guī)律相似。其原因可能是pH 過高或者過低均會(huì)損壞貝類鰓纖毛的組織細(xì)胞，抑制鰓纖毛的活力，不同程度影響貝類的呼吸與排泄[26]。具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

對(duì)貝類耗氧率及排氨率的研究較少考察環(huán)境因素的聯(lián)合作用及曲面效應(yīng)。本試驗(yàn)分析了鹽度、溫度和pH 的交互作用對(duì)大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，構(gòu)建的Box-Behnken 模型擬合度很高，說明該模型能很好地解釋大竹蟶耗氧率及排氨率隨環(huán)境因素的變化。研究大竹蟶呼吸代謝的最佳條件時(shí)，還應(yīng)進(jìn)一步考慮放養(yǎng)密度和規(guī)格、底質(zhì)條件、溶氧水平等交互作用對(duì)耗氧率及排氨率的影響。利用Design-expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析了影響大竹蟶耗氧率及排氨率的3 個(gè)因素及其交互作用，得出大竹蟶的最佳呼吸代謝條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。在此環(huán)境條件下大竹蟶代謝旺盛，而溫度、鹽度和pH 的聯(lián)合效應(yīng)對(duì)于大竹蟶生長(zhǎng)和生理的影響還需進(jìn)一步探討。