馬東麗，劉曉峰，任 璐，周建波，殷 輝，趙曉軍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山西太谷030801）

植物內(nèi)生細菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的一類內(nèi)生菌，其廣泛存在于寄主植物的各個部位中，且可以長期穩(wěn)定的在植物體內(nèi)定殖[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細菌可以產(chǎn)生與寄主植物相同或者相似的活性物質(zhì)，起到抗腫瘤[3]、殺蟲[4]、抑菌、抗氧化[5]、降糖[6]等作用。隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，植物內(nèi)生細菌已成為一種不可或缺的生防資源，受到研究者們的重視。

近年來，研究者們對植物內(nèi)生細菌在生物防治方面的應(yīng)用進行了大量研究。OZAKTAN 等[7]證明了黃瓜內(nèi)生細菌在具有較好抑菌活性的同時還有促生作用，可促進種子萌發(fā)和植株的生長。PAVLO 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，IMBG290 在抑制病原真菌的同時也可促進馬鈴薯的發(fā)育。另外，有研究者對植物內(nèi)生細菌的抑菌及促生機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌可通過產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶[9]和纖維素酶[10]等實現(xiàn)抑菌作用，通過分泌IAA[11]、生物固氮[12]、具有溶磷能力[13]等實現(xiàn)促生作用。李鳳芳[14]研究發(fā)現(xiàn)，番茄立枯病的生防菌株B11-4 可以產(chǎn)生IAA 和嗜鐵素，證明菌株B11-4 主要通過產(chǎn)生促生物質(zhì)和嗜鐵素等物質(zhì)來發(fā)揮抗病和促生作用。孔令春[15]研究發(fā)現(xiàn)，抗稻瘟病的拮抗細菌通過提高植株中的幾丁質(zhì)酶和POD 等與抗性相關(guān)的酶活性以及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來發(fā)揮其誘抗、抑菌及促生作用。拮抗細菌對病原真菌的抑菌機制有多種，其中主要有抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)、破壞分解細胞壁和細胞膜以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)作為主要的抗菌機制已被廣泛認可，其產(chǎn)生的揮發(fā)物已被證實在促生、抑菌[16-18]以及誘抗方面[19]發(fā)揮著重要作用。

醉魚草（Buddleja lindleyanaFortune）是醉魚草屬馬錢科的灌木，在我國分布廣泛、生長迅速、容易種植，是一種天然的中藥。在我國古代就常用作中藥，因其有活血、祛風、殺蟲等功效，可用來治跌打損傷、風濕麻木、風寒感冒、蛔蟲和鉤蟲等疾病[20]。有研究證明，醉魚草莖葉具有良好的抗病毒活性。蔡魯[21]研究發(fā)現(xiàn)，醉魚草具有較好的抗H5N1 病毒活性，對醉魚草莖葉化學(xué)成分進行分離提純，提取出6 種有明顯抑菌作用的物質(zhì)。目前尚未見醉魚草內(nèi)生菌的相關(guān)報道。本研究以醉魚草內(nèi)生細菌ZJ1為研究對象，對ZJ1 菌株的胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-l，3- 葡聚糖酶、纖維素酶活性及溶磷能力、產(chǎn)吲哚-3- 乙酸（IAA）能力進行測定，并通過測定番茄保護酶活性對ZJ1 菌株進行抑菌機制初探，以期為該菌株在生物防治方面的應(yīng)用以及后期的市場化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

醉魚草內(nèi)生細菌ZJ1 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護實驗室分離并保存；番茄種子為美國紅將軍（西安市西蘭良種有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 胞外蛋白酶活力測定 將ZJ1 菌株接于酪蛋白培養(yǎng)基（取5 g 脫脂奶粉、1.50 g 瓊脂分別溶于50 mL 蒸餾水中，滅菌后，待冷卻至45～50 ℃，將兩液混合均勻）上，重復(fù)3 次，在26 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶活力測定 稱取5 g 幾丁質(zhì)，加入20 mL 丙酮研磨，研磨過程中再加入適量丙酮，充分研磨至呈糊狀，在4 ℃條件下邊研磨邊加入濃鹽酸60 mL，用磁力攪拌器攪拌2 h，在4 ℃靜置24 h。將混合物過濾，把濾液加入到預(yù)冷的50%乙醇中，經(jīng)低溫離心除去上清液，再加入預(yù)冷的無菌水，離心，除去上清液，如此反復(fù)多次至中性，收集沉淀，即制成膠體幾丁質(zhì)。

將ZJ1 菌株點接于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基（稱取膠體幾丁質(zhì)15 g，（NH4）SO41 g，酵母粉5 g，KH2PO41.4 g，MgSO·45H2O 0.3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 調(diào)至7.0。）上，每皿3 個接菌點，重復(fù)3 次，在26 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.3 β-l，3- 葡聚糖酶活力測定 將ZJ1 菌株接于茯苓粉培養(yǎng)基（K2HPO417.98 g，KH2PO46.80 g，酵母膏5 g，茯苓粉4 g，苯胺藍100 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。）上，在26 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.4 纖維素酶（β-1，4 葡聚糖酶）活性檢測 將ZJ1 菌株點接于羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMC-Na 5 g，MgSO·47H2O 0.10 g，（NH4）2SO40.50 g，K2HPO40.25 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL。）上，重復(fù)3 次，在28 ℃培養(yǎng)48 h 后，用1 mg/mL 剛果紅染色20 min，再用1 mol/L 的NaCl 浸泡15 min，最后用水洗去表面附著的剛果紅，觀察菌周圍是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.5 溶磷能力的測定 將ZJ1 菌株點接于蒙金娜培養(yǎng)基（葡萄糖10 g，（NH）42SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，CaCO35 g，卵磷脂0.20 g，酵母膏0.40 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值調(diào)至7.0）上，每皿5 個接菌點，重復(fù)3 次，置于28 ℃培養(yǎng)5 d 后，觀察是否有溶磷圈產(chǎn)生。

1.2.6 吲哚-3- 乙酸活性檢測 采用Salkowski 比色法測定吲哚-3- 乙酸（IAA），將ZJ1 菌株接種于YSP 培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h 后，取100 μL 菌懸液接入100 mg/μL 色氨酸的King 培養(yǎng)液（MgSO4·7H2O 1.50 g，K2HPO41.15 g，蛋白胨20 g，L- 色氨酸0.10 g，丙三醇15 mL，蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，pH 調(diào)節(jié)至7.0）中，每三角瓶放50 mL 培養(yǎng)液，重復(fù)3 次，以加無菌水的培養(yǎng)液為對照，振蕩培養(yǎng)12 d。分別取菌懸液和對照各5 mL 置于試管中，再加入5 mL 比色液，室溫靜置15 min，觀察其顏色變化。若變紅為陽性，表示ZJ1 菌株可以分泌生長激素IAA。

1.2.7 ZJ1 發(fā)酵液原液的制備 將ZJ1 菌株接種于YSP 培養(yǎng)液中，在28℃、160 r/min 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，以5%的添加量加入新鮮YSP 培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，即得到ZJ1 菌株發(fā)酵液。

1.2.8 對番茄植株防御酶活性測定 室溫盆栽番茄，用清水培育至第4 片真葉出現(xiàn)時，挑選長勢較為一致的幼苗，將ZJ1 發(fā)酵液原液和5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、80 倍、100 倍、200 倍的稀釋液，每隔7 d 分別用20 mL 進行灌根處理，對照組為等量清水。每個處理重復(fù)3 次，40 d 后采集各處理番茄葉片20 g，置于-20 ℃冰箱備用。按照試劑盒操作說明書具體步驟通過比色法測定番茄葉片中CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD 含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS25 進行分析，并用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醉魚草ZJ1 菌株胞外蛋白酶活力測定

由圖1 可知，ZJ1 菌株在酪蛋白培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生透明圈，說明醉魚草ZJ1 菌株可產(chǎn)胞外蛋白酶。

2.2 醉魚草ZJ1 菌株幾丁質(zhì)酶活力測定

由圖2 可知，ZJ1 菌株在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上沒有透明圈產(chǎn)生，說明醉魚草ZJ1 菌株不產(chǎn)幾丁質(zhì)酶。

2.3 醉魚草ZJ1 菌株β-l，3-葡聚糖酶活力測定

由圖3 可知，ZJ1 菌株在茯苓粉培養(yǎng)基上沒有透明圈產(chǎn)生，說明醉魚草ZJ1 菌株不產(chǎn)β-l，3- 葡聚糖酶。

2.4 醉魚草ZJ1 菌株纖維素酶（β-1，4 葡聚糖酶）活性檢測

將ZJ1 菌株在CMC 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后，先用剛果紅染色，后用1 mol/L NaCl 浸泡，洗去附著在表面的剛果紅后（圖4），菌落周圍有明顯的透明圈產(chǎn)生，說明醉魚草ZJ1 菌株可產(chǎn)纖維素酶。

2.5 醉魚草ZJ1 菌株溶磷能力的測定

由圖5 可知，在蒙金娜培養(yǎng)基上的ZJ1 菌落周邊沒有溶磷圈產(chǎn)生，說明醉魚草ZJ1 菌株沒有溶磷能力。

2.6 醉魚草ZJ1 菌株吲哚-3-乙酸活性檢測

由圖6 可知，加入比色液后，ZJ1 菌液沒有變色，所以，醉魚草ZJ1 菌株不分泌IAA。

2.7 ZJ1 菌株發(fā)酵液對番茄葉片防御酶活性的影響

2.7.1 ZJ1 菌株發(fā)酵液對過氧化氫酶（CAT）活性的影響 由圖7 可知，番茄植株經(jīng)不同倍數(shù)稀釋液灌根培養(yǎng)后，葉片內(nèi)CAT 活性均發(fā)生不同程度的變化，在ZJ1 菌株發(fā)酵液原液和稀釋5 倍、100 倍的處理條件下，與對照相比CAT 活性顯著升高，其中，稀釋100 倍處理明顯高于其他處理。

2.7.2 ZJ1 菌株發(fā)酵液對番茄葉片丙二醛（MDA）含量的影響 由圖8 可知，番茄植株經(jīng)不同倍數(shù)稀釋液灌根培養(yǎng)后，10 倍、50 倍、200 倍液處理的番茄葉片MDA 含量與對照相比變化較為明顯，50 倍液處理含量顯著低于對照，而200 倍液處理遠高于對照和其他處理，其余處理葉片MDA 含量與對照相比無顯著差異。

2.7.3 ZJ1 菌株發(fā)酵液對番茄葉片過氧化物酶（POD）活性的影響 由圖9 可知，番茄植株經(jīng)不同倍數(shù)稀釋液灌根培養(yǎng)后，各處理條件下葉片內(nèi)CAT活性均有不同程度上升，5 倍稀釋液處理對POD 活性的促進效果最好，遠高于對照。

2.7.4 ZJ1 菌株發(fā)酵液對番茄葉片多酚氧化酶（PPO）活性的影響 由圖10 可知，番茄植株經(jīng)不同倍數(shù)稀釋液灌根培養(yǎng)后，葉片內(nèi)PPO 活性均發(fā)生不同程度的變化，稀釋10 倍、80 倍處理與對照相比，對葉片PPO 活性的促進效果最好，遠高于其他處理。

2.7.5 ZJ1 菌株發(fā)酵液對番茄葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 由圖11 可知，番茄葉片經(jīng)不同倍數(shù)稀釋液灌根培養(yǎng)后，SOD 活性均發(fā)生不同程度的變化，除稀釋50 倍、200 倍ZJ1 發(fā)酵液處理外，其余各處理下的番茄葉片SOD 活性都明顯高于對照，稀釋5 倍處理最為顯著。

3 結(jié)論與討論

李雪婷[9]研究表明，生防菌株S17-377 可通過產(chǎn)生蛋白酶和幾丁質(zhì)酶發(fā)揮拮抗作用。千慧敏等[22]研究表明，生防細菌PA2101 可致使病原真菌菌絲畸形并抑制分生孢子萌發(fā)，且可產(chǎn)生蛋白酶、β-l，3-葡聚糖酶、纖維素酶以及幾丁質(zhì)酶，還可以分泌IAA 等多種抑菌及促生物質(zhì)，并具有合成可對煙草病害進行防控的DAPG 和PCA 基因。任晶等[23]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌SQR9 可以產(chǎn)生IAA，促進黃瓜植株的生長。本研究表明，ZJ1 菌株可分泌胞外蛋白酶及纖維素酶，但不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-l，3- 葡聚糖酶以及IAA，且不具有溶磷能力。蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和β-l，3- 葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原真菌的生長，是生防菌株發(fā)揮拮抗作用的重要保障，ZJ1 菌株雖不分泌幾丁質(zhì)酶、β-l，3- 葡聚糖酶以及IAA，不具有溶磷能力，但本研究及以往研究發(fā)現(xiàn)，ZJ1 菌株可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，抑制菌絲生長及孢子萌發(fā)，纖維素酶和蛋白酶可分別降解纖維素和蛋白質(zhì)，說明ZJ1 菌株可通過胞外蛋白酶及纖維素酶分解真菌菌絲結(jié)構(gòu)，進而抑制菌絲生長。

CAT、MDA、POD、PPO、SOD 是植物抗病代謝過程中重要的幾種酶，植物內(nèi)生細菌不僅具有良好的生防作用[24]，還能改善防御酶系統(tǒng)，促進宿主植物的生長、增強抗逆[25]。本研究表明，ZJ1 菌株發(fā)酵液能提高番茄葉片的CAT、POD、PPO、SOD 的酶活性，降低葉片中MDA 含量，通過保持番茄植株膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，進而對植株起到防護效果，使之抗病性增強，減少植物病害發(fā)生。同樣地，張妙宜等[26]分離內(nèi)生細菌QN2MO-1 可促進番茄種子萌發(fā)和植株生長。焦蓉等[27]分離出內(nèi)生細菌YN201728 菌株，發(fā)現(xiàn)其能夠促進煙草種子的萌發(fā)及幼苗生長。但是不同菌株對各種酶活性的改善能力有很大差異，可能與菌株來源不同以及菌株在提高互作植物防御酶活性方面有關(guān)?？傊眙~草內(nèi)生細菌ZJ1 菌株具有良好的生防效果，有待進一步通過大田試驗進行測定。