王 鑫，馬 浩，祝東梅，孫 寧，李 清，王貴英，陳 見，孫艷紅，李 佩

( 1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，湖北，武漢 430207; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北，武漢 430070 )

遠(yuǎn)緣雜交是指2個(gè)物種的親緣關(guān)系在種間或種間以上的雜交方式，是使雜交后代基因型和表現(xiàn)型發(fā)生改變的有效方法。魚類遠(yuǎn)緣雜交在脊椎動物中最為常見，因魚類染色體具有很好的可塑性，不同科、亞科、屬或種的魚類雜交后，雙親的染色體能自由配對組合，相容性和協(xié)調(diào)性好，能綜合2個(gè)或多個(gè)品種的優(yōu)勢遺傳物質(zhì)從而產(chǎn)生雜種優(yōu)勢，因此，利用遠(yuǎn)緣雜交可獲得在生長速度、抗病力、抗逆性和品質(zhì)等生產(chǎn)性狀方面比親本更優(yōu)的后代[1-2]。截至2018年，通過我國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定的魚類新品種中，雜交種42個(gè)，占總數(shù)的46.7%。雜交鲌“先鋒1號”是翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)(♀)與黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda)(♂)通過屬間雜交的子一代，于2013年通過審定，品種登記號為GS-02-001-2012[3]。雜交鲌“先鋒1號”在食性、生長速度、飼料蛋白需求量和體型等方面融合了父母本的優(yōu)勢[4]。目前雜交鲌“先鋒1號”已在全國范圍內(nèi)養(yǎng)殖[5]，經(jīng)濟(jì)效益顯著，且2015—2017年連續(xù)3年被湖北省列為湖北省水產(chǎn)十大主推品種。

染色體組型(即核型)包含染色體的數(shù)目、大小以及形態(tài)特征，是物種的重要遺傳屬性[6-8]，因具有直觀形象的分析優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于魚類的細(xì)胞遺傳學(xué)分析[9-12]。DNA含量是物種重要的遺傳特性之一，研究魚類的DNA含量對魚類分類、倍性及進(jìn)化等方面具有重要的參考意義[13-15]。目前對雜交鲌“先鋒1號”的研究涉及到營養(yǎng)、胚胎發(fā)育、毒理和遺傳多樣性等方面[3-4,16-17]，而對于染色體核型及DNA含量的研究尚未見報(bào)道，因此筆者對雜交鲌“先鋒1號”的核型及DNA含量進(jìn)行試驗(yàn)，探究其直觀的遺傳特性，為雜交鲌“先鋒1號”的物種鑒定、親緣關(guān)系研究及推廣與應(yīng)用等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雜交鲌“先鋒1號”取自湖北省武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所國家級鲌魚良種場，總計(jì)10尾，體長20～30 cm、體質(zhì)量22～88 g的幼魚，試驗(yàn)前將魚暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院室內(nèi)水族箱中，用高錳酸鉀提前消毒并曝氣24 h，隔日換水，定期投喂，暫養(yǎng)7 d。試驗(yàn)取材為健康魚的頭腎以及血液。

1.2 雜交鲌“先鋒1號”核型分析

染色體標(biāo)本制備參照文獻(xiàn)[18]采用體內(nèi)注射植物血球凝集素(PHA)的方法，稍作修改。在雜交鲌“先鋒1號”胸鰭基部注射PHA，劑量6 μg/g。待12～14 h后，在魚體胸鰭基部注射8 μg/g秋水仙素，2 h后用一次性注射器尾靜脈抽血放血，解剖魚體，取出頭腎放于盛有淡水魚用生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用鑷子去除血塊，反復(fù)清洗，然后用100目細(xì)胞鋼篩研磨過濾，用吸管將濾液移入15 mL離心管中，1000 r/min離心2次，每次6 min，每次離心后更換上清液并輕輕吹打幾次。加入0.5% KCl溶液，室溫低滲處理30 min，1000 r/min離心9 min后去掉上清液，加入新配制的卡諾氏固定液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1]固定15 min，1000 r/min離心9 min，并再重復(fù)固定2次；去上清液，加入少許卡諾氏固定液，用吸管輕輕吹打成懸液，噴片或滴片在預(yù)先冰凍過的載玻片上。

待空氣干燥后，用10%的Giemsa染液[V(Gi-emsa)∶V(PBS)=1∶9混合]染色5～10 min，用清水輕輕沖洗干燥后于顯微鏡(Olympus，BX53)100倍油鏡下觀察拍照，選取100個(gè)清晰的染色體中期分裂相進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)。用 Photoshop CS 6軟件手工選取測量數(shù)目完整的最佳中期分裂相，按照文獻(xiàn)[19]的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對分析，用Excel 2010軟件對染色體的相對長度、臂比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 DNA含量測定

將試驗(yàn)魚放入麻醉劑(MS-222，100 mg/L)中麻醉，用浸潤過肝素鈉的1 mL一次性注射器在雜交鲌“先鋒1號”的尾靜脈采血0.2～0.5 mL，去掉最開始的一滴血，然后加到含有1 mL PBS的EP管中，在避光條件下用DAPI染液按照V(血液)∶V(染液)=1∶1染色5～10 min，然后將公雞血也按相同的方法進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀(德國Partec，CyFlow? Space)進(jìn)行檢測。本次試驗(yàn)選用公雞血細(xì)胞DNA絕對含量(2.50 pg/2C)進(jìn)行對照檢測(2C：1個(gè)細(xì)胞核中的DNA含量)。雜交鲌“先鋒1號”DNA含量按下式計(jì)算：

P1=(E2/E1)×P2

式中，P1表示雜交鲌“先鋒1號”血細(xì)胞的DNA含量(pg/2C)，P2表示公雞血細(xì)胞的DNA含量(pg/2C)，E1表示公雞血細(xì)胞的消光值，E2表示雜交鲌“先鋒1號”血細(xì)胞的消光值。

同時(shí)以同樣的方法測定了母本翹嘴紅鲌和父本黑尾近紅鲌的DNA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交鲌“先鋒1號”染色體數(shù)目

選取雜交鲌“先鋒1號” 100個(gè)清晰的中期分裂相進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。染色體數(shù)目在44及以下、46、47、49和50以上的很少，而數(shù)目為48條的染色體數(shù)目占總數(shù)的69%，所以雜交鲌“先鋒1號”的染色體眾數(shù)為48，可以確定雜交鲌“先鋒1號”染色體的數(shù)目為2n=48。圖1為雜交鲌“先鋒1號”染色體中期分裂相。

表1 雜交鲌“先鋒1號”染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab.1 Chromosome counts of culter hybrid F1[E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

圖1 雜交鲌“先鋒1號”染色體中期分裂相Fig.1 Metaphase chromosomes of culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

2.2 雜交鲌“先鋒1號”染色體核型

統(tǒng)計(jì)24對染色體的相對長度和臂比，結(jié)果見表2。根據(jù)臂比值將染色體分為3組，其中中部著絲粒染色體(m)為14對，近中著絲粒染色體(sm)為9對，近端著絲粒染色體(st)為1對，無頂端著絲粒染色體(t)，未發(fā)現(xiàn)隨體和次縊痕，也未發(fā)現(xiàn)與性別有關(guān)的異型性染色體。所以，根據(jù)染色體的相對長度、臂比等可以確定雜交鲌“先鋒1號”的染色體核型為28m+18sm+2st。染色體臂數(shù)(NF)為94。雜交鲌“先鋒1號”染色體核型見圖2。

2.3 雜交鲌“先鋒1號”的DNA含量測定

對雜交鲌“先鋒1號”、翹嘴紅鲌和黑尾近紅鲌血細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行測定，其DNA含量的流式細(xì)胞儀直方圖見圖3。用公雞血細(xì)胞DNA做參照，計(jì)算出雜交鲌“先鋒1號”的血細(xì)胞DNA絕對含量為(3.16±0.04) pg/2C，翹嘴紅鲌的血細(xì)胞DNA絕對含量為(3.18±0.05) pg/2C，黑尾近紅鲌的血細(xì)胞DNA絕對含量為(3.14±0.04) pg/2C。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析三者的DNA含量沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 雜交鲌“先鋒1號”染色體核型Fig.2 The karyotype of culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

表2 雜交鲌“先鋒1號”染色體相對長度、臂比及類型Tab.2 Relative length, arm ratio and types of chromosomes in culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

圖3 雜交鲌“先鋒1號”及親本的血細(xì)胞DNA直方圖Fig.3 DNA histogram of erythrocytes of culter hybrid F1 “Xianfeng No. 1” and their parentsa.雜交鲌“先鋒1號”； b.翹嘴紅鲌； c.黑尾近紅鲌； A.公雞血的直方圖； B.魚的直方圖.a.culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”; b.E. ilishaeformis; c.A. nigrocauda;a.the DNA histogram of erythrocytes in the rooster; B.the DNA histogram of erythrocytes in fish.

3 討 論

3.1 雜交鲌“先鋒1號”染色體核型分析

雜交鲌“先鋒1號”為雜交子一代，目前對其母本翹嘴紅鲌染色體核型的研究較多，王曉艷等[20]報(bào)道了洞庭湖翹嘴鲌的染色體數(shù)目2n=48，核型18m+10sm+18st+2t，NF=76；張偉明等[21]報(bào)道，翹嘴紅鲌染色體數(shù)目2n=48，核型20m+24sm+4st，NF=92，余先覺等[22]報(bào)道，翹嘴鲌染色體數(shù)目2n=48，核型16m+26sm+6st，NF=90。三者研究翹嘴鲌染色體數(shù)目相同，而核型卻不同，造成這種差異的原因可能是由于同一物種的分布地域不同，其染色體自身存在多態(tài)性[23]，不同地理位置的同一群體的核型會因地理環(huán)境不同而存在較大差異，從而使得染色體核型不同。還有可能是染色體制備方法不同，不同研究者選取分裂相不盡相同，同時(shí)還存在測量和配組誤差，都會導(dǎo)致同種魚的染色體核型不同[24]。雜交鲌“先鋒1號”父本黑尾近紅鲌染色體核型只有余先覺等[22]報(bào)道過，染色體數(shù)目為2n=48，核型為26m+18sm+4st，NF=92。本試驗(yàn)中，雜交鲌“先鋒1號”染色體數(shù)目2n=48，核型28m+18sm+2st，NF=94，在染色體數(shù)目上與父母本一致，而在核型上存在差異，m數(shù)目比父母本多，st數(shù)目比父母本少，據(jù)此推測雜交鲌“先鋒1號”染色體是翹嘴紅鲌和黑尾近紅鲌各一套染色體的組裝與重新分配。相比來講，雜交鲌“先鋒1號”核型中m、sm和st數(shù)目與黑尾近紅鲌更為接近，表明其與父本的遺傳特性可能更相近，這與陳見等[4]通過AFLP研究得到的雜交鲌“先鋒1號”與黑尾近紅鲌遺傳關(guān)系更近的結(jié)論一致。

關(guān)于魚類雜交子一代與親本染色體的核型分析，國內(nèi)外有許多研究報(bào)道，筆者對部分結(jié)果進(jìn)行匯總分析(表3)，得出以下規(guī)律：第一，雜交子一代與親本的染色體數(shù)目相同，常見于父母本之間的染色體數(shù)目相同，其染色體是父母本各一套染色體的組合，本次試驗(yàn)所得的結(jié)論符合此規(guī)律；第二，雜交子一代與親本的染色體數(shù)目不同，常見于父母本之間的染色體數(shù)目不同，其染色體是父母本染色體數(shù)目之和的均值，也見于雜交子一代染色體數(shù)目僅與母本相同是因雌核發(fā)育的結(jié)果[19]；第三，在核型特征方面，雜交子一代有的與母本完全相同[25-27]，多數(shù)是父母本的染色體發(fā)生了重組，核型介于父母本之間[28-30]。也能發(fā)現(xiàn)親本的核型越相似，雜交也會越成功，可見在遺傳進(jìn)化過程中染色體具有一定的保守性。

表3 已報(bào)道的雜交F1與其親本的核型特征比較Tab.3 Comparison of karyotypes of the hybrid F1 and their parents reported now

3.2 雜交鲌“先鋒1號”的DNA含量

測定生物的DNA含量是研究其基因組的一個(gè)手段，它可以反映出該生物基因組大小和倍性[39]。檢測生物DNA含量可采用顯微分光光度計(jì)法和流式細(xì)胞儀法，其中流式細(xì)胞儀法具有快速、準(zhǔn)確、簡便等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[30,40]。公雞血是流式細(xì)胞儀法中最常用的參考標(biāo)準(zhǔn)，因此本試驗(yàn)采用公雞血作為標(biāo)準(zhǔn)，使用流式細(xì)胞儀測定雜交鲌“先鋒1號”及其親本的DNA含量，結(jié)果表明，雜交鲌“先鋒1號”的DNA含量介于親本之間，與父母本的DNA含量沒有顯著性差異(P>0.05)，均為二倍體。在之前其他雜交魚類的報(bào)道中，雜交F1的DNA含量基本都介于親本之間，如團(tuán)頭魴(♀)×翹嘴鲌(♂)[41]、草魚(♀)×赤眼鱒(♂)[42]、小黃魚(♀)×大黃魚(♂)[43]等，本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致，這也體現(xiàn)出雜交F1保持了親本相對的遺傳穩(wěn)定性。雜交鲌“先鋒1號”DNA含量的測定為其與親本物種鑒定及親緣關(guān)系研究提供了參考。

4 結(jié) 論

國審品種雜交鲌“先鋒1號”(翹嘴紅鲌♀×黑尾近紅鲌♂)的染色體數(shù)目為2n=48，核型公式為28m+18sm+2st，染色體臂數(shù)NF=94，其染色體數(shù)目與父母本相同，核型與父本黑尾近紅鲌更為接近；雜交鲌“先鋒1號”DNA含量為(3.16±0.04) pg/2C，與父母本的DNA含量無顯著性差異。本試驗(yàn)結(jié)果將對雜交鲌“先鋒1號”的基礎(chǔ)研究及推廣應(yīng)用提供積極參考作用。