王明芳，高相楠，徐微微，叢玉婷，柴曉杰

( 大連海洋大學(xué)，遼寧省省級高校水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核生物[1]，屬綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、多鞭藻科、鹽藻屬，又稱鹽藻，其具有極強(qiáng)的耐鹽能力，廣泛分布于海洋、鹽田及鹽湖中，能夠在NaCl濃度為0.05～5.0 mol/L的培養(yǎng)液中生長、繁殖。簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和極強(qiáng)的耐鹽性，引起了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注[1]。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)[2-4]、耐鹽基因[5-6]、鹽藻轉(zhuǎn)錄組[7-9]、miRNA組[10]及蛋白質(zhì)組[11-12]等方面進(jìn)行了研究，取得了一些重要研究成果。但是到目前為止，關(guān)于鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號的分子機(jī)制尚未完全查明。

鈣調(diào)素(CaM)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一種分布最廣、功能最重要的鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白。研究者已經(jīng)從蘋果、擬南芥、馬鈴薯、水稻、小麥、綠藻中分離出鈣調(diào)素基因，在高等植物中至少存在6～12種鈣調(diào)素基因。鈣調(diào)素是一種小分子量的單鏈的可溶性球蛋白，其中心有一個(gè)靈活的螺旋區(qū)，該螺旋區(qū)連接兩個(gè)球形區(qū)。每個(gè)球形區(qū)域均具有2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，與Ca2+正向結(jié)合[13-14]。在模式植物擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因編碼鈣調(diào)素蛋白，該蛋白家族保守區(qū)含有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，與游離態(tài)Ca2+結(jié)合[15]。鈣調(diào)素自身并沒有酶活性，必須經(jīng)過Ca2+激活后，才能進(jìn)一步與其靶蛋白結(jié)合，將鈣信號向下游傳遞[16]，從而調(diào)控植物細(xì)胞分裂[17]、生長發(fā)育[18-19]、抗逆[20]等生物學(xué)過程。目前，尚未見關(guān)于鹽藻鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)和功能的報(bào)道。因此，深入探討鹽藻鈣調(diào)素基因的結(jié)構(gòu)與功能對于闡明鹽藻響應(yīng)鹽脅迫信號的分子途徑具有重要的科學(xué)意義。

筆者采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆鹽藻鈣調(diào)素基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并應(yīng)用qRT-PCR方法對鹽脅迫條件下鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究，為進(jìn)一步闡明鈣調(diào)素在鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號傳遞中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽藻藻種由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，pMDTM18-T vector購自TaKaRa(寶生物)公司。

RNAiso Plus、DNA Marker DL-2000、限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ、Hind Ⅲ)、Taq酶、溶菌酶、IPTG、X-gal、DEPC、PrimeScriptTMRT Master Mix、TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司。SMART?RACE 5′/3′ kit、NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up試劑盒購自Clontech公司。柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。鹽藻鈣調(diào)素基因克隆所用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Lists of primer sequences

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽藻的培養(yǎng)與鹽脅迫處理

向300 mL無菌海水中加入固體NaCl至終濃度1 mol/L，再加入鹽藻培養(yǎng)液(康威方營養(yǎng)液)300 μL，25 ℃，光照度1250 lx，12L∶12D交替靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)5～7 d至對數(shù)生長期(藻種密度達(dá)到107)，再向培養(yǎng)液中加入固體NaCl，使其終濃度達(dá)到3 mol/L，脅迫1 h。

1.2.2 鹽藻總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取處于對數(shù)生長期的鹽藻20 mL離心收集藻細(xì)胞，按照RNAiso Plus試劑盒操作說明書提取總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。按照SMART?RACE 5′/3′ kit說明將鹽藻總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 鹽藻鈣調(diào)素基因的 5′、3′- RACE擴(kuò)增

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對鹽藻轉(zhuǎn)錄組測序(美國國立生物技術(shù)信息中心SRA數(shù)據(jù)庫：PRJNA471570)獲得的鈣調(diào)素基因序列，使用美國國立生物技術(shù)信息中心的Primer BLAST設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE特異性引物M1和M2(表1)。3′-RACE的擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，M2和Long primer為引物，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)。以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，M2和Short primer為引物，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。 將獲得的3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接及轉(zhuǎn)化，陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。5′-RACE擴(kuò)增的引物，擴(kuò)增條件和3′-RACE相同，獲得了5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

1.2.4 鹽藻鈣調(diào)素開放閱讀框的擴(kuò)增

利用DNAman軟件對中間段序列及3′端序列、5′端序列進(jìn)行拼接，根據(jù)得到的鹽藻鈣調(diào)素基因全長序列設(shè)計(jì)1對引物(表1)，以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，F(xiàn)1和F2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序。

1.2.5 鹽藻鈣調(diào)素基因的生物信息學(xué)分析

利用美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫ORF Finder在線軟件(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)進(jìn)行開放閱讀框的查找；利用DNAman軟件分析鈣調(diào)素基因的核酸序列組成；利用Expasy軟件包中的ProtParam(http:∥www.expasy.ch/tools)進(jìn)行相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、疏水性等基本理化性質(zhì)分析；利用ProtComp 9.0(http:∥linux1.softberry.com)進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析，使用默認(rèn)參數(shù)；利用KinasePhos(http:∥kinasephos.mbc.nctu.edu.tw)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽分析和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測；利用SMART軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和功能區(qū)分析；利用SOPMA軟件https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用美國國立生物技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫中的Blastp軟件進(jìn)行同源性分析；利用MEGA 7軟件的鄰接歸并法構(gòu)建進(jìn)化樹，自展檢驗(yàn)重復(fù)1000次。

1.2.6 qRT-PCR檢測不同時(shí)間鹽脅迫下鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)情況

使用RNAiso Plus提取未脅迫(對照組)、鹽脅迫(3 mol/L NaCl)5 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h的鹽藻總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)鹽藻鈣調(diào)素基因的特異性qRT-PCR引物：F，ATGACCTCCAAGATGGGCGA，R，AAGC GTGATGAAGCCTGTGT；選取鹽藻18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性擴(kuò)增引物：18S-sense，TTGGGTAGTCGGGCTGGTC，18S-anti-sense，CGCTGCGTTCTTCATCGTT。應(yīng)用TB Green?Premix Ex TaqTM在96孔板中進(jìn)行目的基因的qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)PCR反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽藻鈣調(diào)素基因的克隆

2.1.1 鹽藻鈣調(diào)素基因3′末端和5′末端的擴(kuò)增

以鹽藻為材料提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1a，兩條清晰、完整的條帶分別為28S rRNA和18S rRNA，所提取的RNA質(zhì)量較好。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對鹽藻轉(zhuǎn)錄組測序獲得的鈣調(diào)素基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1b、c。在250～500 bp之間有一條清晰的條帶，經(jīng)測序，獲得一條423 bp的核苷酸序列(圖1b)。在接近1000 bp處有一條清晰的條帶，經(jīng)測序，獲得一條856 bp的核苷酸序列，并且含有poly A尾結(jié)構(gòu)(圖1c)，確定鹽藻鈣調(diào)素基因的3′-末端擴(kuò)增成功。

2.1.2 鹽藻鈣調(diào)素基因開放閱讀框的擴(kuò)增

將5′-末端序列、中間段及3′-末端序列用DNAman軟件拼接得到一條全長為1061 bp的核苷酸序列，包括5′-UTR為115 bp和3′-UTR為451 bp，可以編碼164個(gè)氨基酸的ORF序列為495 bp，起始密碼子是ATG,終止密碼子是TAG。根據(jù)DNAman軟件拼接得到的鹽藻鈣調(diào)素全長基因序列設(shè)計(jì)一對引物，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1d，約在500 bp處有一條清晰的條帶，經(jīng)測序獲得一條495 bp的核苷酸序列，與預(yù)期結(jié)果完全一致。成功克隆的鹽藻鈣調(diào)素(DsCaM)基因序列的GenBank登錄號為MN428415。

2.2 鹽藻鈣調(diào)素基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 鹽藻鈣調(diào)素基因的基本理化性質(zhì)分析

鹽藻鈣調(diào)素基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)分析顯示,鹽藻鈣調(diào)素分子式為C791H1247N211O271S10，氨基酸數(shù)為164，相對分子質(zhì)量為18 369，pI為4.20，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu)為38，帶正電荷殘基總數(shù)(精氨酸Arg+賴氨酸Lys)為15，原子總數(shù)為2530，不穩(wěn)定系數(shù)為26.57，表明鹽藻鈣調(diào)素為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)為72.62，親水性評估為-0.534，根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律，表明該蛋白為親水性蛋白。組成鹽藻鈣調(diào)素多肽鏈的18種氨基酸中，谷氨酸最多，所占比例為14%。鈣調(diào)素基因cDNA全長序列和翻譯的氨基酸序列見圖2，黑色方框標(biāo)出的是起始密碼子和終止密碼子。

圖1 鹽藻鈣調(diào)素基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of DsCaM genea.鹽藻總RNA； b.5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物； c.3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物； d.鹽藻鈣調(diào)素開放閱讀框的擴(kuò)增產(chǎn)物； M.DL2000 marker.a.total RNA of green alga D. salina； b.5′-RACE amplification product； c.3′-RACE amplification product； d. amplified product of the open reading frame of DsCaM; M.DL2000 marker.

圖2 鹽藻鈣調(diào)素基因cDNA全長序列和翻譯的氨基酸序列Fig.2 Full-length of cDNA and deduced amino acid sequences of DsCaM gene

2.2.2 鹽藻鈣調(diào)素的亞細(xì)胞定位及功能域的預(yù)測

鹽藻鈣調(diào)素信號肽分析結(jié)果顯示，其D值為0.102，根據(jù)D=0.450是區(qū)分信號肽和非信號肽的臨界值，推測該蛋白無信號肽，無跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白；亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)。功能區(qū)域預(yù)測結(jié)果顯示，從N端到C端由24～52、60～88、97～125、133～161位的氨基酸形成4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，為鈣離子的結(jié)合區(qū)域。

2.2.3 鹽藻鈣調(diào)素的空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測

鹽藻鈣調(diào)素的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，由93個(gè)氨基酸殘基組成的α-螺旋，占整個(gè)二級結(jié)構(gòu)的56.71%；由43個(gè)氨基酸殘基組成的無規(guī)則卷曲，占二級結(jié)構(gòu)的26.22%；β-轉(zhuǎn)角和伸展片段均由14個(gè)氨基酸殘基組成，在二級結(jié)構(gòu)中所占比例為8.54%。利用SWISS-MODEL軟件構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型(圖3)，該蛋白外形似啞鈴狀，中間1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)連接2個(gè)球狀末端，每個(gè)末端有2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，具有典型的鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)特征。

圖3 鹽藻鈣調(diào)素的三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Three-dimensional constitution of the DsCaM

2.2.4 鹽藻鈣調(diào)素的生物進(jìn)化分析

利用美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件將該蛋白氨基酸序列與GenBank中的氨基酸序列進(jìn)行比對及相似性搜索，獲得相似度80%以上的18個(gè)物種的序列,用ClustalW 4軟件進(jìn)行鈣調(diào)素氨基酸的多重比對，進(jìn)化樹采用MEGA 7軟件的鄰接歸并法構(gòu)建，自展檢驗(yàn)重復(fù)1000次。結(jié)果顯示，鹽藻鈣調(diào)素與萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii，XP_001703420.1)鈣調(diào)素親緣關(guān)系最近(圖4)，序列相似度為89%。

2.3 鹽脅迫條件下鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)，以18 S rRNA為內(nèi)參基因,分析鹽脅迫不同時(shí)間鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，在鹽脅迫5 min時(shí)，鹽藻鈣調(diào)素的表達(dá)量就出現(xiàn)顯著性上調(diào)變化(P<0.01)，鹽脅迫6 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高值，為正常生長條件(1 mol/L NaCl)的9倍(圖5)。隨著脅迫時(shí)間的延長其表達(dá)量有所下降，但仍高于正常水平。說明鹽藻鈣調(diào)素為鹽脅迫快速上調(diào)基因，與鹽藻耐受高鹽的分子機(jī)制有密切關(guān)系。

3 討 論

3.1 鹽藻鈣調(diào)素的克隆與生物信息學(xué)分析

通過對鹽藻鈣調(diào)素基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確了其為親水性穩(wěn)定蛋白，無信號肽，無跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)。

圖5 鹽藻鈣調(diào)素基因在鹽脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)分析Fig.5 Real-time RT-PCR analysis of the relative expression of the DsCaM gene during various periods of NaCl stress *.P<0.01.

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋(56.71%)和無規(guī)則卷曲(26.22%)為主，三級結(jié)構(gòu)同源建模成功，并明確了鹽藻鈣調(diào)素的功能域，具有典型的鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)特征，該蛋白外形似啞鈴狀，中間1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)連接2個(gè)球狀末端，每個(gè)末端有2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，為與鈣離子的結(jié)合區(qū)域。

鹽藻鈣調(diào)素氨基酸數(shù)量為164，通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，與氨基酸數(shù)為149的擬南芥和水稻在13～161位氨基酸同源；與氨基酸數(shù)為150的果蠅蛋白序列在14～161位，氨基酸數(shù)為163的衣藻蛋白序列在10～156位高度同源。說明鹽藻鈣調(diào)素N端蛋白序列是高度可變，這可能與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)，后續(xù)的工作將進(jìn)一步明確其功能。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，鹽藻鈣調(diào)素與萊茵衣藻鈣調(diào)素親緣關(guān)系最近，序列相似度為89%，這符合物種之間的親緣關(guān)系。

3.2 鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)分析

鈣調(diào)素是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在、高度保守的一類最重要的鈣離子受體蛋白[21]。鈣及鈣調(diào)素信號途徑在調(diào)節(jié)生物體的基因表達(dá)、細(xì)胞分裂、分化等生命活動(dòng)起到重要的作用[22-24]。為了探討鈣調(diào)素基因在鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號中的作用，筆者采用qRT-PCR技術(shù)對鹽藻鈣調(diào)素基因在高鹽脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，該基因在受鹽脅迫的過程中被誘導(dǎo)表達(dá)，在鹽脅迫5 min時(shí)，鹽藻鈣調(diào)素基因的表達(dá)量就出現(xiàn)顯著性上調(diào)變化，鹽脅迫6 h時(shí)其表達(dá)量升高到對照組的9倍，這與大多數(shù)植物中鈣調(diào)素基因的脅迫應(yīng)答反應(yīng)相似。表明鹽藻鈣調(diào)素基因?yàn)辂}脅迫快速上調(diào)基因，可能在鹽藻應(yīng)答高鹽脅迫的生理過程中起到重要作用。后續(xù)的工作將采用RNA干擾和免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步鑒定該基因的功能和篩選與其互作的蛋白質(zhì)，構(gòu)建分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié) 論

本研究首次從鹽藻中成功克隆了鈣調(diào)素基因(GenBank 登錄號為MN428415)。鹽藻鈣調(diào)素為親水蛋白，無跨膜區(qū)域，不存在信號肽，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋(56.71%)和無規(guī)則卷曲(26.22%)為主，具有典型的鈣調(diào)素的結(jié)構(gòu)特征，鹽藻鈣調(diào)素與萊茵衣藻鈣調(diào)素親緣關(guān)系最近。鹽藻鈣調(diào)素為鹽脅迫快速應(yīng)答基因，與鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境有密切關(guān)系。