馬穩(wěn)霞,馮升來,涂藝馨,令利軍

(西北師范大學生命科學學院/甘肅特色植物生物活性產(chǎn)品工程研究中心,甘肅 蘭州 730070)

蘭州百合為百合科多年生植物,是中國國家地理標志產(chǎn)品,甘肅省名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品及世界上唯一的藥膳兩用甜百合,在國內(nèi)外享有盛名[1]。蘭州百合富含人體所需的糖、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì),具有促進胃腸功能、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用,被譽為“蔬菜人參”,在中藥中以新鮮的鱗莖、干燥的鱗片和粉末等不同的形式出現(xiàn),主要用于心肺疾病治療[2]。2016年,蘭州百合種植面積達到 7 133 hm2,年產(chǎn)量3 000～4 000萬kg[3]。近年來,蘭州百合產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展,但品種退化和嚴重的采后病害問題一直困擾著蘭州百合產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4]。研究表明,百合的采后病害主要由機械損傷和致病菌侵染所致,機械損傷發(fā)生在采收、儲藏和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)中,機械損傷同時為致病菌侵染提供了機會[5]。

目前,關于蘭州百合采后病害的研究鮮有報道。鞏慧玲等[6]發(fā)現(xiàn)黃曲霉和米曲霉可以引起蘭州百合采后病害。本課題組已從采后低溫貯藏腐敗的蘭州百合中分離到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、沙福芽胞桿菌(Bacillussafensis)和2株美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)4種采后致病菌。細菌性病害主要包括細菌性軟腐病和細菌性枯萎病,僅次于真菌性病害[2]。

黃花蒿(Artemisiaannua)是我國傳統(tǒng)中草藥,具有清熱、解暑和截瘧之功效,同時可作為香料用于釀酒和醬油等領域。我國西北地區(qū)野生黃花蒿資源豐富,同時具有悠久的栽培歷史。黃花蒿精油主要產(chǎn)生于葉和花中的毛狀體,富含單萜和倍半萜,主要成分包括石竹烯、異木酚酮和1,8-cineole等[7]。1,8-cineole作為黃花蒿精油主要活性成分,具有抗炎和抗氧化活性,可控制全身炎癥、延緩疾病進展和惡化速度,還對肺氣腫具有潛在的緩解作用,因此,黃花蒿在醫(yī)學領域常用作輔助治療慢性阻塞性肺疾病、哮喘和鼻竇炎等[8]。

本研究以自然腐敗的蘭州百合采后鱗莖為研究材料,分離純化致病菌,并通過形態(tài)學及分子生物學方法對分離到的致病菌進行鑒定;利用黃花蒿精油及其主要活性成分1,8-cineole對采后致病菌進行體外防治試驗,為蘭州百合采后病害的防治提供理論依據(jù)和技術指導,并為減少蘭州百合的經(jīng)濟損失和延長保質(zhì)期及為蘭州百合產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:采后病變和新鮮蘭州百合樣品均于2019年6月由蘭州市七里河區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣站提供,試驗中所用蘭州百合均屬于同一基因型。

Luria-Bertani(LB)固體及液體(不加瓊脂粉)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,瓊脂粉14～16 g·L-1;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯浸粉3 g·L-1,葡糖糖20 g·L-1,瓊脂粉14～16 g·L-1,氯霉素0.2 g·L-1;酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD):酵母粉10 g·L-1,蛋白胨 20 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂14～16 g·L-1,pH7.0。

儀器:BSC-1300ⅡA2生物安全柜(蘇州,安泰);生化培養(yǎng)箱(上海,一恒);T100TMThermal cycler PCR儀、721BR02621凝膠成像儀(美國,Bio-Rad)。

1.2 蘭州百合采后病害致病菌的分離與純化

參考文獻[9-10]的方法對蘭州百合滅菌處理后,采用無菌手術刀切取病-健相間的百合樣品分別置于LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基及YPD培養(yǎng)基,分別于37、28和28 ℃培養(yǎng)48～72 h。待菌落形成后,根據(jù)顏色和形態(tài)進行初次分離純化,然后將分離到的菌體轉移到相應培養(yǎng)基上,劃線培養(yǎng)48～72 h。依次純化2～3次獲得菌株并于20%的甘油中-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性驗證

根據(jù)柯赫氏法則,取分離純化得到的病原菌活化于無菌的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48～72 h以獲得每個分離物的活化培養(yǎng)物[11]。將成熟健康的蘭州百合滅菌處理后,用無菌手術刀將表面無菌的百合切成同樣大小的百合塊(1.5 cm×1.5 cm)后分為2部分,一部分直接接種病原菌,另一部分用滅菌后的接種針,在中間的位置扎孔致傷后接種病原菌,并以等量的無菌水作為對照。7 d后根據(jù)百合塊腐爛變質(zhì)的癥狀以確定所接病原菌是否能使蘭州百合腐爛,從腐爛的傷口處分離病原菌觀察是否為接種的病原菌,從而確定該菌是否為蘭州百合采后腐爛的致病菌[12-13]。所有試驗設置3組平行。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定細菌:用接種針挑取少許保藏的菌種于LB固體培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)1～2 d,觀察單菌落大小、形狀、高度、邊緣、顏色、表面狀態(tài)、密度、硬度等形態(tài)學特征,再通過顯微鏡觀察單個菌體的形態(tài)。真菌:打取菌餅接種于PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)3～4 d,參考文獻[14]觀察并記錄菌落形態(tài),再通過顯微鏡觀察其孢子形態(tài)。

1.4.2 分子生物學鑒定細菌:采用煮沸裂解法提取基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增反應體系(25 μL):模板1 μL,引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACG-ACTT-3′)各0.1 μL,Taq酶1 U,10×PCR緩沖液2.5 μL,ddH2O補充至25 μL。參考夏樂先等[15]的方法進行PCR擴增。真菌:通過CTAB法提取真菌DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆肹16-17]。PCR擴增反應體系(25 μL):模板1 μL,引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各0.1 μL,Taq酶1 U,10×PCR緩沖液2.5 μL,ddH2O補充至25 μL,參考劉瑞玲等[10]的方法進行PCR擴增。

10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后,將有效產(chǎn)物送到華大基因公司測序。測序結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫并通過MEGA 6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.5 黃花蒿精油成分的GC-MS分析

GC-MS條件參考文獻[19]稍作修改:初始溫度設定為60 ℃保持1 min,10 ℃·min-1上升至180 ℃保持1 min,然后以20 ℃·min-1升至280 ℃保持15 min。噴射器溫度保持在270 ℃,載氣為高純氦氣,將樣品(1 μL,用己烷稀釋至1%)以10∶1的分流比注入,流速為1.0 mL·min-1。在相同的操作條件下使用同系列的正構烷烴(C5—C36)計算保留指數(shù)(RI)。比較它們的質(zhì)譜并計算它們的RI,與NIST 05數(shù)據(jù)庫比對并結合相關文獻鑒定成分,通過平均GC-FID峰面積報告獲得精油各成分的相對百分比。

1.6 熏蒸法測定黃花蒿精油及1,8-cineole的體外抑菌活性

1.6.1 黃花蒿精油及1,8-cineole對細菌抑菌活性的測定將分離到的病原細菌B-6活化至對數(shù)期后稀釋至106CFU·mL-1,取0.1 mL于新鮮的LB固體培養(yǎng)基上涂布均勻。不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6和0.7 mL·L-1)的精油及1,8-cineole加到4張無菌的濾紙片(直徑6 mm)上,以相同體積的無菌水作為對照,置于培養(yǎng)皿蓋子中央,于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,每組試驗3個重復。菌落計數(shù)后按如下公式計算精油的抑菌率。

式中:A(C)為對照組菌落數(shù);A(T)為試驗組菌落數(shù)。

1.6.2 黃花蒿精油及1,8-cineole對真菌抑菌活性用無菌打孔器取菌餅置于PDA固體培養(yǎng)基中央,不同濃度的精油(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.22、0.28、0.34、0.40和0.46 mL·L-1)及1,8-cineole(0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.30、0.40和0.60 mL·L-1)加到4張無菌濾紙片(直徑6 mm)上,將濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋子中央,密封培養(yǎng)48 h后測量菌落大小,每組試驗3組重復。按如下公式計算抑菌率。

式中:d(C)為對照組菌落直徑;d(T)為試驗組菌落直徑[20]。

1.7 直接接觸法測定黃花蒿精油及1,8-cineole的體外抑菌活性

1.7.1 黃花蒿精油及1,8-cineole對細菌的抑菌活性通過倍比稀釋法測定黃花蒿精油及單體1,8-cineole的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericide concentration,MBC)。MIC被確定為沒有明顯細菌增長的精油及1,8-cineole的最低濃度,此濃度下具有不可見(無濁度)的細菌生長,MBC濃度下初始接種細菌(106CFU·mL-1)被全部殺死[21]。

1.7.2 黃花蒿精油及1,8-cineole對真菌的抑菌活性測定黃花蒿精油及1,8-cineole的MIC和最低殺真菌濃度(minimum fungal concentration,MFC)。通過微量稀釋法得到含不同濃度黃花蒿精油及1,8-cineole的PDB培養(yǎng)液,取不同濃度的含藥培養(yǎng)液0.2 mL于2 mL離心管中。無菌打孔器打取菌餅,用無菌牙簽挑取菌餅分別置于相應的離心管中,28 ℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。挑取液體培養(yǎng)基中的菌餅,接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上,置于28 ℃培養(yǎng)48 h。以在離心管中無菌絲生長的黃花蒿精油及1,8-cineole濃度為MIC,將無可見菌絲生長的菌餅接種于PDA固體培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)24 h后,以無菌絲生長的濃度為MFC。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將病原菌的核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關微生物物種的序列進行比對。系統(tǒng)發(fā)育關系使用MEGA 6.0軟件通過鄰接法結合p-距離分析確定,對系統(tǒng)進化樹內(nèi)部分支的強度采用1 000次引導復制進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2019和SPSS 20.0軟件,采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 致病性檢測

從腐爛的百合鱗莖中共分離純化到6株真菌(F-1—F-6)和9株細菌(B-1—B-9),經(jīng)過柯赫氏回接試驗(圖1)表明:菌株B-6、F-2、F-3及F-6為蘭州百合采后病害致病菌,且致病性存在差異。

圖1 柯赫氏回接試驗結果Fig.1 Experimental results of Koch’s Back ConnectionCK. 對照Control;B-1—B-9. 細菌Bacteria;F-1—F-6. 真菌Fungus. 下同。The same as follows.

將得到的4株病原菌接種于無致傷的蘭州百合鱗片上,結果(圖2)顯示:菌株B-6對無致傷的蘭州百合無侵染現(xiàn)象,菌株F-2、F-3及F-6引起蘭州百合病變,并在無致傷的蘭州百合表面生長繁殖。但是,無致傷情況下,病原真菌侵染速度較慢,說明致傷會促進病原菌對蘭州百合的侵染從而導致其快速腐爛。

圖2 無致傷回接試驗結果Fig.2 Experimental results of injury-free test

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定形態(tài)學觀察結果(圖3)表明:B-6菌落不規(guī)則,乳白色,表面粗糙且不透明,單個菌體形態(tài)呈桿狀;F-2菌落呈廣鋪的棉絮狀,起初為白色致密的平坦菌絲,而后邊緣出現(xiàn)淺綠色的孢子叢束,反面呈白色,孢子呈圓形;F-3菌落呈廣鋪毛氈狀,外圈白色,內(nèi)圈及反面呈淡紫色,孢子橢圓形;F-6菌落呈廣鋪絮狀,白色,孢子呈長橢圓鐮刀型。

圖3 蘭州百合采后病害致病菌形態(tài)Fig.3 Morphology of postharvest diseases pathogens isolated from Lilium davidii

2.2.2 分子生物學鑒定分子生物學分析(圖4)表明:致病菌B-6與摩加夫芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)位于同一分支,序列同源性達到99.86%;F-2與李氏木霉(Trichodermalixii)位于同一分支,序列同源性達到99.34%;F-3與籃狀菌(Talaromycestumuli)位于同一分支,序列同源性達到99.25%;F-6與鐮刀菌(Fusariumannulatum)位于同一分支,序列同源性達到99.46%。各分支的自展值均高于50%,結合形態(tài)學與分子生物學分析,B-6為摩加夫芽胞桿菌,F-2為李氏木霉,F-3為籃狀菌,F-6為鐮刀菌。

圖4 蘭州百合采后病原菌分離株及其近緣種的系統(tǒng)進化樹Fig 4 Molecular phylogenetic tree of the pathogens isolates from postharvest L.davidii and their closely related speciesa. 基于16S rDNA基因序列構建的致病細菌B-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Phylogenetic tree of pathogenic bacteria B-6 constructed based on 16S rDNA gene sequences;b. 基于18S rDNA基因序列構建的致病真菌F-2、F-3及F-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Phylogenetic tree of pathogenic fungi F-2,F-3 and F-6 constructed based on 18S rDNA gene sequences.Bacillus mojavensis:摩加夫芽胞桿菌;Bacillus tequilensis:特基拉芽胞桿菌;Bacillus nakamurai:中村芽胞桿菌;Bacillus vallismortis:死谷芽胞桿菌;Bacillus velezensis:貝萊斯芽胞桿菌;Trichoderma lixii:李氏木霉;Trichoderma zeloharzianum:希羅哈茨木霉;Trichoderma pleuroti:胸膜木霉;Trichoderma ghanense:甘南木霉;Fusarium obliquiseptatum:斜皮鐮刀菌;Fusarium annulatum:鐮刀菌;Fusarium beomiforme:鐮形鐮刀菌;Fusarium babinda:鐮刀菌巴賓達;Penicillium nalgiovense:納地青霉;Talaromyces thailandensis:泰國芳香菌;Talaromyces fuscoviridis:褐綠色芳香菌;Talaromyces tumuli:籃狀菌。

2.3 黃花蒿精油成分分析

GC-MS分析結果(表1)顯示:黃花蒿精油中共有30種化合物,主要成分為α-愈創(chuàng)木烯(41.36%)、β-石竹烯(13.73%)、木羅烯(12.28%)以及1,8-桉葉素(1,8-cineole)等活性成分。黃花蒿精油中萜烯類化合物根據(jù)結構的不同可分為單萜衍生物(5.38%)和倍半萜衍生物(94.62%)。

表1 黃花蒿精油化學成分Table 1 Chemical composition of the essential oil derived from Artemisia annua

2.4 體外抑菌活性檢測

2.4.1 熏蒸法檢測黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病害致病菌的抑菌活性黃花蒿精油及 1,8-cineole對致病細菌B-6具有良好的抑菌活性,當黃花蒿精油及1,8-cineole的濃度為0.7 mL·L-1時,抑菌率達到100%(圖5-a)。低濃度的1,8-cineole對B-6的抑菌活性高于黃花蒿精油,當其濃度為0.1 mL·L-1時,其抑菌率達到90%以上。黃花蒿精油和1,8-cineole對3種蘭州百合采后致病真菌均有抑菌活性(圖5-b,c及表2)。低濃度的黃花蒿精油對F-3和F-6的抑菌活性高于F-2,但高濃度時,對F-2的抑菌活性明顯高于F-3和F-6;1,8-cineole高濃度時,對F-2和F-3的抑菌活性高于F-6,且具有劑量依賴性,濃度越大,抑菌活性越強。黃花蒿精油對 F-2、F-3、F-6的EC50范圍為0.314～0.357 mL·L-1,1,8-cineole對 F-2、F-3、F-6的EC50范圍為0.280～0.420 mL·L-1。

表2 黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病原真菌抑制作用Table 2 Inhibitory effects on pathogenic fungi in postharvest L.davidii with essential oil from A.annua and 1,8-cineole

2.4.2 直接接觸法檢測黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病害致病菌的抑菌活性直接接觸法檢測結果(表3,圖6及圖7)表明:黃花蒿精油和1,8-cineole對B-6的MIC值均為1.25 mL·L-1,MBC值分別為1.25和5.00 mL·L-1,因此,菌株B-6對黃花蒿精油更加敏感。黃花蒿精油和1,8-cineole對病原真菌F-2的MFC分別為10.00和20.00 mL·L-1,說明黃花蒿精油比1,8-cineole對F-2具有更好的抑菌活性。黃花蒿精油對病原真菌F-3及F-6的MFC均為40.00 mL·L-1,1,8-cineole對病原真菌F-3及F-6的MFC均為20.00 mL·L-1,說明病原真菌F-3和F-6對1,8-cineole更加敏感,同種病原菌對不同抗菌材料的敏感度不同。此外,黃花蒿精油對病原菌B-6、F-2、F-3及F-6的殺菌濃度分別為1.25、10.00、40.00和 40.00 mL·L-1,說明不同菌株對同一抗菌材料的敏感度不同。相對于黃花蒿精油,1,8-cineole具有更好的體外抗真菌活性。

圖6 黃花蒿精油及1,8-cineole對B-6抑菌及殺菌濃度Fig.6 Antibacterial and bactericidal concentration of essential oil from A.annua and 1,8-cineole on B-6CK. 對照Control;a. 1.25 mL·L-1黃花蒿精油處理Treated with 1.25 mL·L-1 essential oil from A.annua;b. 2.5 mL·L-1黃花蒿精油處理Treated with 2.5 mL·L-1 essential oil from A.annua;c. 1.25 mL·L-1 1,8-cineole處理Treated with 1.25 mL·L-1 of 1,8-cineole;d. 2.5 mL·L-1 1,8-cineole處理Treated with 2.5 mL·L-1 of 1,8-cineole.

圖7 黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病原真菌的抑制作用Fig.7 Inhibitory effects on pathogenic fungi in postharvest L.davidii with essential oil from A.annua and 1,8-cineole

表3 黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病原菌的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity on pathogenic bacteria and fungi in postharvest L.davidii of essential oil from A.annua and 1,8-cineole

3 討論

摩加夫芽胞桿菌能夠有效防治馬鈴薯壞疽病[22],但有研究表明摩加夫芽胞桿菌能夠產(chǎn)生有毒成分,該成分經(jīng)鑒定為3種不同表面活性素類似物的復合物,具有細胞毒性,可以引起食物中毒[23]。李氏木霉可引起三七等植物的采后腐爛[24],其產(chǎn)生的胞壁降解酶——纖維素酶,可能是引起蘭州百合采后病害的原因之一[25]。然而對于籃狀菌(Talaromycestumuli)研究較少。鐮刀菌是常見的植物病害致病菌,可引起辣椒[26]等常見果蔬的采后病害。本研究中分離得到的4株采后病害致病菌可導致蘭州百合腐爛,產(chǎn)生毒素,對人體健康構成威脅。因此,亟需對蘭州百合采后病害致病菌進行防治。

黃花蒿精油對常見的病原細菌大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性[27],對常見的病原真菌如黑曲霉、啤酒酵母菌、產(chǎn)黃青霉、馬青霉、毛霉、青霉和根霉也具有較強的抑菌活性。黃花蒿精油中成分復雜,其中萜類化合物在生活中常被用作醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品添加劑和動物飼料添加劑等[28]。研究表明,1,8-cineole是多種具有抗菌活性精油的主要活性成分之一,并且對痤瘡丙酸桿菌具有體外抑菌活性[29]。

本研究發(fā)現(xiàn),黃花蒿精油及其活性成分1,8-cineole對蘭州百合采后病害致病菌均具有抑菌活性,同一菌株對黃花蒿精油和1,8-cineole敏感程度不同,且不同菌對同一抗菌材料的敏感程度也不同。采用熏蒸法和直接接觸法研究黃花蒿精油及1,8-cineole對蘭州百合采后病害致病菌的體外活性,結果表明,熏蒸法相比直接接觸法需要的最低抑菌濃度及殺菌濃度更小,這可能與黃花蒿精油及1,8-cineole的揮發(fā)性有關。已有研究表明,蒿屬植物精油和香薷精油會導致流感嗜血桿菌細胞壁損傷、細胞變形及皺縮,還會導致DNA損傷[30],從而抑制病原菌的生長甚至殺死病原菌。黃花蒿精油及1,8-cineole的抑菌機制尚未有明確的報道,因此其抑菌機制有待進一步的研究。

蘭州百合在采后貯藏運輸過程中會不可避免地引起表面創(chuàng)傷,導致致病菌侵染而腐爛,在造成嚴重經(jīng)濟損失的同時也嚴重威脅著人體健康。本研究從腐爛的蘭州百合中分離得到1株采后病害致病細菌及3株采后病害致病絲狀真菌,研究顯示黃花蒿精油以及1,8-cineole對獲得的4種采后病害致病菌均有良好的體外抑菌活性,并且熏蒸法優(yōu)于直接接觸法。該結論為黃花蒿精油及1,8-cineole用于蘭州百合采后保鮮提供了理論基礎。