張蜀，張珂，高舸

（成都市疾病預(yù)防控制中心，成都 610041）

硒是動(dòng)物體內(nèi)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，在抗氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶的形成過程中起著重要作用，具有防癌、抗癌、抗氧化等多種生理功能。硒攝入不足會(huì)導(dǎo)致肝壞死，肌肉營(yíng)養(yǎng)不良，可能引發(fā)克山病、大骨節(jié)病、癌癥、心臟病等多種疾?。?–2］。無機(jī)硒的生物利用率差、毒性大；而有機(jī)硒安全性高、更易于被人體吸收利用。由于硒的生物利用性、毒性與其存在形態(tài)有著密切的關(guān)系，因此對(duì)硒的存在形態(tài)及含量進(jìn)行分析尤為重要［2–6］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260 Infinity 型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：8900 型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage 型，默克密理博（中國(guó)）有限公司。

高純氬：體積分?jǐn)?shù)為99.999%，成都世茂氣體有限公司。

pH 計(jì)：510 型，美國(guó)優(yōu)特公司。

檸檬酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于99.5%，CAS 號(hào)為77–92–9，西格瑪奧德里奇（中國(guó)）有限公司。

己烷磺酸鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于98%，CAS 號(hào)為2832–45–3，西格瑪奧德里奇（中國(guó)）有限公司。

氨水：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～22%，A512–P500，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

硒代乙硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 號(hào)為2578–27–0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，加拿大TRC 公司。

普通飲用水樣品：樂百氏桶裝飲用水，樂百氏飲用水有限公司。

富硒礦泉水樣品：稀世寶飲用天然礦泉水，恩施硒之泉礦泉水有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

SeEt 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：25 μg／mL，稱取SeEt 固體粉末6.79 mg，溶于適量超純水中，定容至100 mL（硒形態(tài)質(zhì)量濃度以硒計(jì)）。

6 種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.00 μg／mL，分別準(zhǔn)確吸取6 種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各400 μL，置于同一只10 mL 容量瓶中，用超純水稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)品及溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于4 ℃下冷藏保存，所有工作溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色 譜 柱：Zorbax SB–Aq 型 反 相 色 譜 柱[150 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：1%甲醇–pH 值分別為2.7、7.0的10 mmol／L 檸檬酸溶液（含5 mmol／L 己烷磺酸鈉）；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫條件見表1；進(jìn)樣體積：10 μL；流量：1 mL／min。

表1 梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜

射頻功率：1 550 W；玻璃同心霧化器；采樣深度：8.0 mm；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.3 r／s；載氣：高純氬氣，流量為0.90 L／min；補(bǔ)償氣：高純氬氣，流量為0.25 L／min；霧化室溫度：2 ℃；積分時(shí)間：0.5 s；采集時(shí)間：10 min；反應(yīng)氣：氧氣，流量為25%；采集質(zhì)量數(shù)：雙重四級(jí)桿Q1、Q2質(zhì)量數(shù)分別為80、96。

1.4 樣品處理

水樣及加標(biāo)樣品經(jīng)孔徑為0.22 μm 的聚四氟乙烯濾頭過濾后測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相選擇

2.1.2 己烷磺酸鈉溶液濃度選擇

在流動(dòng)相中添加己烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑可改善各硒形態(tài)的分離效果［6］。考察流動(dòng)相中分別添加濃度為5、10、20 mmol／L 己烷磺酸鈉溶液對(duì)各硒形態(tài)分離的影響。結(jié)果表明，己烷磺酸鈉溶液濃度的增大可使各硒形態(tài)出峰時(shí)間輕微延遲，但對(duì)峰形及出峰時(shí)間的影響不明顯，故選擇在流動(dòng)相中添加濃度為5 mmol／L 的己烷磺酸鈉溶液。

2.1.3 甲醇用量選擇

考察流動(dòng)相中添加體積分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、2%、4%、6%的甲醇對(duì)各硒形態(tài)分離的影響。結(jié)果表明，甲醇的加入對(duì)無機(jī)硒形態(tài)出峰時(shí)間無影響，但可使有機(jī)硒形態(tài)的出峰時(shí)間略微提前。甲醇添加量從0%增加至1%時(shí)，各硒形態(tài)的色譜峰強(qiáng)度均有明顯增高；繼續(xù)增加甲醇濃度，各硒形態(tài)色譜峰強(qiáng)度變化較?。辉诩状继砑恿枯^大時(shí)強(qiáng)度開始減弱（如圖1 所示）。綜合分析色譜峰強(qiáng)度及出峰時(shí)間，選擇在流動(dòng)相中添加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇。

圖1 流動(dòng)相中甲醇用量對(duì)各硒形態(tài)分離的影響

2.1.4 流動(dòng)相pH 值選擇

圖2 流動(dòng)相不同pH 值時(shí)各硒形態(tài)的分離時(shí)間

2.2 碰撞反應(yīng)氣優(yōu)化

以O(shè)2為碰撞反應(yīng)氣，分別考察質(zhì)量濃度為20 ng／mL 的SeO42–標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白溶液在不同O2含量（氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%、23%、25%、27%、29%、31%、33%、37%、39%、41%、43%、45%、47%、49%、51%、53%、55%、57%）下的信號(hào)和背景強(qiáng)度（如圖3所示）。結(jié)果表明，當(dāng)碰撞反應(yīng)池氣體O2體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，硒元素的信噪比較好，故采用碰撞反應(yīng)池氣體O2體積分?jǐn)?shù)為25%。

圖3 不同含量O2 下的信號(hào)和背景強(qiáng)度

2.3 線性方程與檢出限

在1.3 儀器工作條件下，對(duì)1.2 中6 種硒形態(tài)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以各硒形態(tài)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)各組分質(zhì)量濃度均為1 ng／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比計(jì)算方法檢出限。6 種硒形態(tài)的保留時(shí)間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2 可知，6 種硒形態(tài)在8 min 內(nèi)均達(dá)到良好的分離（如圖4 所示），且各形態(tài)硒的質(zhì)量濃度在1～100 ng／mL 范圍內(nèi)與響應(yīng)強(qiáng)度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.097 2～0.166 0 ng／mL。

表2 6 種硒形態(tài)保留時(shí)間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

圖4 6 種硒形態(tài)分離色譜圖（20 ng／mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）

2.4 精密度試驗(yàn)

在普通飲用水樣品中添加質(zhì)量濃度為2 ng／mL 的6 種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 方法進(jìn)行樣品處理，在1.3 儀器工作條件下平行測(cè)定7 次，結(jié)果見表3。由表3 可知，6 種形態(tài)硒測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.65%～7.13%，表明該方法具有較高的精密度。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用所建方法對(duì)富硒礦泉水及普通飲用水進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4 可知，富硒礦泉水及普通飲用水中6 種硒形態(tài)化合物的加標(biāo)回收率為74.6%～97.5%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，滿足測(cè)定要求。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜–電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定水樣中6 種硒形態(tài)的方法。采用O2作為碰撞反應(yīng)氣減小干擾，8 min 內(nèi)可實(shí)現(xiàn)各硒形態(tài)的良好分離和準(zhǔn)確測(cè)定。該方法可為食品樣品中硒形態(tài)的準(zhǔn)確分析提供參考。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果