武雄雄，楊成蘭，祁存英，熊輝巖，段瑞君

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

在高等植物中，長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(LACS)是酰基激活酶(acyl-activating enzyme，AAE)超家族的成員，具有AMP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。LACS可活化游離脂肪酸，維持細(xì)胞內(nèi)?；o酶A的含量，是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的一類酶[1]。

目前，已經(jīng)從多種高等植物中分離到LACS基因，其中，擬南芥LACS基因家族有9個(gè)基因成員，并且大部分LACS基因在花以及萌發(fā)的種子中大量表達(dá)，表明這些基因不僅參與花組織的油脂代謝，而且在種子甘油酯的合成中起關(guān)鍵作用[2]。近年來(lái)，研究者在棉花[3]、蓖麻[4]、山羊草[5]、水稻[6]、向日葵[7]、牡丹[8]、蘋(píng)果[9]、甘藍(lán)型油菜[10]等植物中也相繼分離到LACS基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行了初步研究。

小麥(TriticumaestivumL.)是一種在全世界廣泛種植的農(nóng)作物之一，我國(guó)是小麥主產(chǎn)區(qū)之一，隨人口的不斷擴(kuò)大，對(duì)小麥的需求量也不斷增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)，LACS基因家族在脂質(zhì)的合成代謝和分解代謝中有著不可代替的作用，對(duì)提高植物中脂質(zhì)產(chǎn)量具有重要意義[12]。但迄今為止，小麥LACS基因家族成員尚未被鑒定。因此，本研究基于小麥全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)LACS基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，并進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序分布、系統(tǒng)進(jìn)化以及組織和脅迫表達(dá)圖譜進(jìn)行分析，以期為后續(xù)小麥LACS基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥LACS基因家族成員的鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

用EMBL-Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//pfam.xfam.org/)下載AMP結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(HMM)文件(AMP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域：PF00501)[13]；用HMMER 3.1軟件搜索EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/index.html)下載的小麥基因組文件[14]；從擬南芥信息資源(TAIR，http：//www.Arabidopsis.org/index.jsp)下載9個(gè)擬南芥LACS蛋白[15]，從The Rice Annotation Project(RAP，https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)下載4個(gè)水稻LACS蛋白[16]作為種子序列；用BLASTP搜索小麥LACS蛋白。使用EMBL-Pfam、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和 CD Search(Conserved Domain Search Service,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)來(lái)驗(yàn)證AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以確定小麥LACS基因家族成員，命名為T(mén)aLACS；用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.expasy.org/)中對(duì)小麥所有LACS蛋白的氨基酸長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2 TaLACS基因的染色體定位分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥的染色體定位數(shù)據(jù)，用MapChart 2.32軟件分析TaLACS基因在染色體上的定位。

1.3 TaLACS蛋白質(zhì)保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME Version 5.1.1(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守基序的鑒定。重復(fù)次數(shù)的為任意次數(shù)，最大基序數(shù)量為20，以及最佳基序?qū)挾认拗圃?～200殘基之間。使用TBtools軟件[17]進(jìn)行可視化。從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥的蛋白和基因結(jié)構(gòu)信息,利用基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制TaLACS基因結(jié)構(gòu)。

1.4 TaLACS系統(tǒng)發(fā)育分析

用小麥、擬南芥和水稻LACS基因家族蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)算法為最大似然法(ML)法，校檢參數(shù)：重復(fù)1 000次。生成的圖形使用Evolview v3[18](https://www.evolgenius.info/evolview/#login)進(jìn)行美化。

1.5 TaLACS基因的組織表達(dá)譜分析

從Wheat Exp數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.wheat-expression.com/)檢索小麥RNA-Seq數(shù)據(jù)，用Tpm(transcripts per million reads)值評(píng)估小麥LACS基因的轉(zhuǎn)錄本豐度值。用HEML軟件繪制小麥LACS基因表達(dá)熱圖。

1.6 TaLACS基因的啟動(dòng)子分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥基因組序列數(shù)據(jù)，并截取小麥條TaLACS基因起始密碼子上游1.5 kb的DNA序列。用Plant CARE軟件[19](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析與脅迫響應(yīng)和植物激素有關(guān)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥LACS基因家族成員的鑒定結(jié)果及其編碼蛋白的理化性質(zhì)

根據(jù)擬南芥9個(gè)LACS基因和水稻4個(gè)LACS基因的蛋白序列，利用HMM和BLASP搜索小麥LACS蛋白序列，之后進(jìn)行比對(duì)，去除冗余序列后合并，利用Pfam和SMART結(jié)構(gòu)域搜索檢驗(yàn)LACS候選基因是否含有AMP-bing結(jié)構(gòu)域，最終在小麥基因組中共鑒定出148個(gè)LACS候選基因，根據(jù)結(jié)構(gòu)域信息以及在基因組的位置，將其命名為T(mén)aLACS1～TaLACS148。在ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)小麥所有LACS蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，小麥LACS基因家族蛋白氨基酸長(zhǎng)度為134～1 593 aa，分子量為 3 654.70～264 379.85 Da，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.23～10.06，均值為7.23，推測(cè)大部分蛋白為中性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)中，有48個(gè)蛋白的數(shù)值大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余均小于40，為穩(wěn)定蛋白；總平均疏水指數(shù)中，正值的疏水性蛋白和負(fù)值的親水性蛋白各有57和91個(gè)；脂溶系數(shù)為 78.19～104.94，說(shuō)明大部分TaLACS蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，為親水脂溶性蛋白。

2.2 TaLACS基因染色體定位分析

染色體物理定位結(jié)果(圖1)顯示，除TaLACS147和TaLACS148兩個(gè)基因未獲得位置信息外，其余146個(gè)TaLACS基因不均勻分布在21條染色體上，其中，在5號(hào)染色體組上分布最多(36個(gè))，1號(hào)染色體組上分布最少(9個(gè))。在2D、4A、4B、5A、5B、5D染色體上基因分布比較集中，且有成簇分布現(xiàn)象。

圖1 小麥LACS基因在染色體上的定位

2.3 TaLACS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析和氨基酸保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果(圖2a)顯示，TaLACS蛋白家族分為6個(gè)亞家族，且每個(gè)亞家族的保守基序個(gè)數(shù)與類別基本一致。保守基序分布結(jié)果(圖2b)顯示，TaLACS蛋白保守性較高，共包含5個(gè)保守元件，motif1和motif7構(gòu)成了AMP保守結(jié)構(gòu)域?？偟膩?lái)說(shuō)，每個(gè)TaLACS蛋白的motif為2～15個(gè)。TaLACS13、TaLACS20和TaLACS27比較特異，motif長(zhǎng)且分散。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)motif1和motif5、motif1和motif16、motif8和motif10經(jīng)常會(huì)一起出現(xiàn)。在基因結(jié)構(gòu)中，大部分小麥TaLACS基因的基因結(jié)構(gòu)基本相似，由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成。其外顯子子數(shù)目為1～23個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目為0～23個(gè)，存在內(nèi)含子缺失現(xiàn)象。其中，TaLACS3和TaLACS114基因不含內(nèi)含子。個(gè)別TaLACS基因結(jié)構(gòu)只有編碼區(qū)，無(wú)非編區(qū)，如TaLACS3、TaLACS19、TaLACS20等25個(gè)基因無(wú)非編碼區(qū)，占總基因的16.8%。

a：小麥LACS蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析；b：小麥LACS蛋白的保守基序分布。

同時(shí)，在148個(gè)編碼小麥蛋白的TaLACS基因之中檢測(cè)到55個(gè)旁系同源基因?qū)?，如TaLACS129的同源基因?yàn)門(mén)aLACS122，TaLACS79的同源基因?yàn)門(mén)aLACS5，這些同源基因在TaLACS基因中占到74.3%。為了進(jìn)一步探究TaLACS基因家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及該基因家族的進(jìn)化過(guò)程，結(jié)合9個(gè)擬南芥和4個(gè)水稻LACS蛋白序列，利用MEGAX對(duì)161個(gè)LACS蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。聚類分析結(jié)果(圖3)表明，148個(gè)TaLACS基因家族成員編碼的蛋白可分為三大組，分別為GroupI、GroupII和GroupIII。其中，GroupI中有73個(gè)成員，GroupII有38個(gè)成員，GroupIII有37個(gè)成員，GroupIII成員又被細(xì)分為GroupIIIa、GroupIIIb、GroupIIIc和GroupIIId 4個(gè)亞組，成員數(shù)量分別為9、6、6和16。

圖3 小麥、擬南芥和水稻LACS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 TaLACS基因的表達(dá)譜分析

利用Wheat Exp數(shù)據(jù)庫(kù)中TaLACS基因在種子、葉、根和穗的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4a)發(fā)現(xiàn)，TaLACS基因的表達(dá)模式在不同組織或發(fā)育階段差異明顯，總體來(lái)說(shuō)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的表達(dá)量低于生殖生長(zhǎng)階段。其中，有10個(gè)TaLACS基因在種子中表達(dá)量較高，有15個(gè)TaLACS基因在根中表達(dá)量較高，有12個(gè)TaLACS基因在葉中表達(dá)量較高，有18個(gè)TaLACS基因在穗中表達(dá)量較高。表明TaLACS基因家族中，在穗和根中高表達(dá)的TaLACS基因數(shù)目多于在種子和葉中的表達(dá)數(shù)目。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TaLACS122和TaLACS129在各個(gè)時(shí)期和組織中表達(dá)量均較高，表明這些基因可能參與調(diào)控小麥種子、根、葉和穗的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程；部分基因在某一組織中表達(dá)量較高，而在其他組織中不表達(dá)或低表達(dá)，如TaLACS1、TaLACS18、TaLACS25等，說(shuō)明這些基因具有組織特異性表達(dá)特點(diǎn)，可能在植物形態(tài)建成中起著重要作用。

a：TaLACS基因在不同組織中的表達(dá)熱圖；b：TaLACS基因在低溫、干旱和赤霉病脅迫下的表達(dá)熱圖。

用Wheat Exp庫(kù)中TaLACS基因在低溫、干旱脅迫和赤霉病誘導(dǎo)的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果(圖4b)顯示，不同脅迫處理后部分TaLACS基因上調(diào)表達(dá)，響應(yīng)赤霉病脅迫后TaLACS基因的表達(dá)量高于低溫和干旱脅迫。其中，TaLACS16、TaLACS23、TaLACS26、TaLACS33、TaLACS39、TaLACS45、TaLACS85、TaLACS88等49個(gè)基因在幼苗冷脅迫處理兩周后，表達(dá)量均明顯上升，表明這些基因可能在響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用；在對(duì)幼苗進(jìn)行干旱脅迫后，TaLACS8、TaLACS16、TaLACS51、TaLACS82、TaLACS123、TaLACS139等34個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這些基因可能在干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用；此外，TaLACS10、TaLACS16、TaLACS24、TaLACS33、TaLACS83、TaLACS139等37個(gè)基因在感染赤霉病后上調(diào)表達(dá)，推測(cè)這些基因可能在抗赤霉病感染中起一定作用。

2.5 TaLACS基因的啟動(dòng)子分析

利用Plant CARE軟件分析小麥TaLACS基因啟動(dòng)子序列的順式作用元件，共鑒定到15種與脅迫響應(yīng)和植物激素有關(guān)的順式作用元件。其中，與脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件有5種，分別為厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)、真菌引誘應(yīng)答元件(BOX-W1)、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeat)、低溫誘導(dǎo)元件(LTR)和干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)，其中，含有低溫誘導(dǎo)元件和干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件的TaLACS基因分別占34.9%和 46.0%；與植物激素相關(guān)的元件有10種，分別為脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(TGA-element、AuxRR-core)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif、CGTCA-motif)、乙烯應(yīng)答元件(ERE)、赤霉素響應(yīng)元件(TATC-box、P-box、GARE-motif)和水楊酸應(yīng)答元件(TCA-element)，其中，含有脫落酸反應(yīng)元件的TaLACS基因占85.8%。

3 討 論

近年來(lái)，從擬南芥、水稻、蘋(píng)果、甘藍(lán)型油菜等植物中獲得LACS基因[20]，并且對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能作用進(jìn)行了初步研究，雖然LACS基因在植物蠟質(zhì)合成和抗脅迫性中發(fā)揮著重要作用，但迄今為止，在小麥中還沒(méi)有對(duì)該家族基因進(jìn)行詳細(xì)鑒定和功能研究的報(bào)道。本研究首次對(duì)小麥LACS基因家族進(jìn)行鑒定分析，依據(jù)基因組的注釋信息，共獲得148個(gè)小麥LACS基因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于擬南芥(9個(gè))和蘋(píng)果(11個(gè))LACS基因家族的成員數(shù)目。原因可能是小麥?zhǔn)翘厥獾牧扼w結(jié)構(gòu)，在染色體組A、B、D上存在同源基因[21-22]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果的LACS蛋白長(zhǎng)度為596～730 aa，分子量為64.96～79.44 Da，理論等電點(diǎn)為5.56～8.12。Xiao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜中LACS蛋白長(zhǎng)度為129～960 aa，理論等電點(diǎn)為5.11～9.51。本研究發(fā)現(xiàn)，TaLACS蛋白長(zhǎng)度為134～1 593 aa，分子量為3 654.70～ 264 379.85 Da，理論等電點(diǎn)為5.23～10.06。與蘋(píng)果和甘藍(lán)型油菜LACS相比，TaLACS蛋白長(zhǎng)度較長(zhǎng)，分子量較大，且呈中性。蛋白長(zhǎng)度和分子量存在差異，推測(cè)原因可能是對(duì)蘋(píng)果中LACS蛋白鑒定時(shí)只取長(zhǎng)度為300～ 1 000 aa的氨基酸序列，而小麥和甘藍(lán)型油菜未作處理；另外小麥較復(fù)雜的基因組也可能是原因之一。

將小麥LACS蛋白與擬南芥、水稻LACS蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LACS蛋白可分為GroupI、GroupII和GroupIII三大組，其中，GroupIII包含擬南芥和水稻的LACS蛋白，GroupI和GroupII均只有小麥LACS蛋白。GroupIII中TaLACS蛋白有37個(gè)，占全部蛋白的四分之一，與AtLACS1和AtLACS2聚在GroupIIIa亞組，與AtLACS3、AtLACS4和AtLACS5聚在GroupIIIb亞組，與AtLACS6和AtLACS7聚在GroupIIIc亞組，與AtLACS8和AtLACS9聚在GroupIIId亞組，這與擬南芥9個(gè)LACS蛋白的聚類一致[1]；在不同物種中，LACS的分類存在差異。LACS是?；罨?AAE)家族中的成員，根據(jù)其聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LACS基因與AAE基因相似性高[23]，所以GroupI和GroupII的TaLACS蛋白可能與AAE家族有一定的聯(lián)系，LACS的進(jìn)化關(guān)系還需要進(jìn)一步細(xì)分。Xu等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，擬南芥、水稻和小麥LACS基因同時(shí)聚類在一個(gè)小支上[24]，因此，推測(cè)TaLACS可能與其他物種LACS基因有相似的功能。Pulsifer等[25]研究發(fā)現(xiàn)，AtLACS2和TaLACS115相似性高，AtLACS2可提高脂肪酸含量，推測(cè)TaLACS115在小麥中也有類似的功能；Jessen等[26]發(fā)現(xiàn)，AtLACS4有形成脂質(zhì)花粉外壁的功能，與其相似度高的TaLACS100和TaLACS87可能也有類似功能；Fulda等[27]發(fā)現(xiàn)，AtLACS6在脂肪酸β-氧化起作用，在種子及幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育階段中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)TaLACS110在小麥種子的萌發(fā)過(guò)程中也發(fā)揮作用。

Fan等[28]研究表明，LACS蛋白可激活長(zhǎng)鏈脂肪酸，然后通過(guò)β-氧化作用進(jìn)行降解、合成細(xì)胞脂質(zhì)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtLACS1、AtLACS2和AtLACS4參與蠟的生物合成[29-31]，蠟的積累有助于增強(qiáng)植物對(duì)ABA和干旱脅迫的耐受性[31-33]。Wang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，蠟主要在小麥葉片和穗部組織中合成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分TaLACS基因家族成員在穗和根中上調(diào)表達(dá)，在葉片和種子中也有上調(diào)表達(dá)的TaLACS基因，說(shuō)明大部分TaLACS基因家族成員與蠟合成有關(guān)；本研究還發(fā)現(xiàn)，TaLACS16、TaLACS39等基因在兩種或以上不同脅迫單獨(dú)處理下均上調(diào)表達(dá)，其中，TaLACS16在受到冷脅迫、干旱脅迫和赤霉病誘導(dǎo)時(shí)均上調(diào)表達(dá)，響應(yīng)較為明顯。表明小麥TaLACS基因在響應(yīng)生物脅迫或非生物脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這為L(zhǎng)ACS基因的功能解析奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究TaLACS基因在抗生物脅迫和非生物脅迫功能和品種選育提供一定理論指導(dǎo)和實(shí)踐意義。