杜欣穎，王 笳，王建明，周 磊，鄭程莉*

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610200；2.四川養(yǎng)麝研究所，四川 成都 610200)

【研究意義】麝香是中國名貴中藥，為雄性麝類動物香囊分泌的產(chǎn)物，其產(chǎn)量受激素調(diào)控影響。FSHβ和LHβ基因在林麝泌香過程中發(fā)揮重要作用，然而它們與泌香的關(guān)聯(lián)分析鮮有報道。本文采用DNA混池測序技術(shù)對FSHβ和LHβ基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并將突變位點(diǎn)位點(diǎn)與麝香產(chǎn)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期從遺傳水平上揭示林麝產(chǎn)香性能機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】麝香(Moschus)是傳統(tǒng)中藥的重要成分，具有開竅醒神，活血通經(jīng)，消腫止痛的功效[1]。麝香主要由我國一級重點(diǎn)保護(hù)瀕危野生藥用動物林麝(Moschusberezovskii)雄性個體分泌。為了保護(hù)野生林麝資源，我國從1958年開始人工養(yǎng)麝。歷經(jīng)半個世紀(jì)，現(xiàn)仍處于試養(yǎng)階段，麝香產(chǎn)量低[2]，其根本原因在于林麝選育程度低下，傳統(tǒng)遺傳育種方法費(fèi)時費(fèi)力，在林麝上實(shí)施起來有較大困難。家畜中，人們運(yùn)用多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析[3-4]、分子標(biāo)記輔助選擇[5]等技術(shù)極大地提高了一些家畜的選育進(jìn)程?？v觀林麝的選育還較為原始，在家畜中研究得較為深入的多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析[6-8]還鮮有報道，因此本研究以多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析為實(shí)驗方法，從遺傳水平上揭示林麝產(chǎn)香性能機(jī)理，以期為加快林麝選育提供理論依據(jù)。FSHβ和LHβ基因是位于性腺軸上的關(guān)鍵基因，也是影響產(chǎn)香性能的候選基因[9]。在泌香過程中，垂體前葉堿性細(xì)胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通過調(diào)節(jié)雄性激素的分泌進(jìn)而影響麝香的生成[10-11]。汪建隆等也證實(shí)FSHβ與LHβ影響麝香分泌[12]。然而在林麝群體中，F(xiàn)SHβ和LHβ基因及其上下游到底有多少個多態(tài)性位點(diǎn)還不得而知?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究利用Hiseq混池測序方法在林麝全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)篩選，重點(diǎn)關(guān)注FSHβ、LHβ基因及其上下游2 k區(qū)域，再結(jié)合所研究的林麝個體的產(chǎn)香數(shù)據(jù)做關(guān)聯(lián)性分析，獲得的顯著性多態(tài)位點(diǎn)可運(yùn)用于后續(xù)的分子標(biāo)記輔助選擇?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對于了解林麝種群的遺傳特性有重大意義，也對于提高麝香的產(chǎn)量具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取四川養(yǎng)麝研究所馬爾康養(yǎng)獐場100頭林麝為試驗材料，統(tǒng)一于2018年10月集中采香，取盡每頭林麝香囊中的麝香，現(xiàn)場稱重記錄，獲取每頭林麝的年產(chǎn)香數(shù)據(jù)。在取香前稱取的每頭林麝體重，對應(yīng)采集每頭林麝后肢靜脈血管的2 mL血液用于提取DNA。

1.2 基因組DNA混池Hiseq測序

用天根血液DNA提取試劑盒(貨號DP304)提取血液樣本DNA，并用Nanodrop檢測樣本DNA質(zhì)量和濃度。將提取的DNA樣本均勻稀釋至50 ng/μl，每個樣品取2 μl均勻混合，構(gòu)建試驗林麝DNA混池構(gòu)建文庫。采用Illumina平臺進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)以ls35[13]為參考序列進(jìn)行注釋比對。

1.3 試驗群體質(zhì)譜分型

根據(jù)Hiseq檢測到的潛在SNP位點(diǎn)，本實(shí)驗采用飛行質(zhì)譜檢測方法對林麝個體進(jìn)行基因分型。根據(jù)FSHβ和LHβ基因的20個SNP 已知的序列信息，設(shè)計引物，引物信息如表1所示。

表1 質(zhì)譜引物信息

續(xù)表1 Continued table 1

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 2013統(tǒng)計各個位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗。

其中：NAA、NAB、NBB分別為群體中基因型為AA、AB、BB的個數(shù)。

其中,N為等位基因個數(shù)，P和Pi為第和第i個等位基因在群體中的頻率。

其中,Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，m為等位基因數(shù)。

采用SPSS 軟件對個體基因型與麝香品質(zhì)和產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，設(shè)定SPSS中最小二乘法擬合線性模型和Ducan法進(jìn)行多重比較?？紤]場效應(yīng)，建立以下統(tǒng)計分析模型。

(1)單基因效應(yīng)方差分析：Y=μ+G+p+e;

Y表示性狀測定值，μ代表群體均值，G為基因型效應(yīng)，p為場效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差。

(2)組合基因型效應(yīng)方差分析：Y12=μ+G1+G2+G12+p+e;

Y12表示性狀測定值，μ為群體均值，G1是第一個位點(diǎn)的基因型效應(yīng)，G2是第二個位點(diǎn)基因型效應(yīng)，G12是位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的交互效應(yīng)，p是場效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hiseq測序結(jié)果及SNP位點(diǎn)分析

利用Qubit Fluorometer對提取的林麝基因組DNA濃度和純度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示混池樣品質(zhì)量合格。結(jié)合體重與產(chǎn)香數(shù)據(jù)，去除提取DNA質(zhì)量差的個體，在100個樣品中，有74個樣品符合實(shí)驗要求。通過Illumina Hi-Seq2000測序平臺，總共測得1014.48 G raw data，去除低質(zhì)量reads和冗余數(shù)據(jù)后得到151.9 G clean data。以ls35為參考基因組[10]，整體比對率達(dá)到99.55 %，測序深度為52.49 X，覆蓋率達(dá)到94.96 %?？偣驳玫?259 941個SNP位點(diǎn)，其中98.91 %的突變位于基因間區(qū)內(nèi)。

2.2 FSHβ和LHβ基因內(nèi)SNP位點(diǎn)驗證

結(jié)合參考基因組基因，本研究采用飛行質(zhì)譜檢測方法對林麝74個個體進(jìn)行基因分型。根據(jù)候選基因FSHβ和LHβ序列(GeneBank：JN164268，JN164267)的已知信息，選擇28個潛在SNP 位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析驗證，20個成功分型，具體位點(diǎn)信息如表2所示，質(zhì)譜分型結(jié)果如圖1所示。說明基于高通量測序篩選的SNP位點(diǎn)大部分是可驗證的。

表2 SNP位點(diǎn)位置信息

2.3 試驗群體遺傳學(xué)參數(shù)

對質(zhì)譜分型成功的20個SNP位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，在74個樣本中，SNP01和SNP03哈溫P值均小于0.05，基因型頻率分布顯著偏離哈代-溫伯格平衡，這些位點(diǎn)不作單倍型分析。其余位點(diǎn)均處于平衡狀態(tài)(P>0.05)，詳細(xì)結(jié)果見表 3。

表3 基因多態(tài)性分析

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 SNP與林麝產(chǎn)香性能的關(guān)聯(lián)分析

通過單個SNP位點(diǎn)與產(chǎn)香性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，位于LHβ基因的9個SNP位點(diǎn)中，SNP13與林麝產(chǎn)香量性能顯著相關(guān)(P<0.05)，TT為優(yōu)勢基因型。這些位點(diǎn)與體重的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平(P>0.05，表4)。

位于FSHβ基因的9個SNP中，有2個SNP位點(diǎn)SNP15、SNP20與林麝產(chǎn)香量顯著相關(guān)(P<0.05)，SNP15中AA為優(yōu)勢基因型，SNP20中TT為優(yōu)勢基因型。這些位點(diǎn)與體重的相關(guān)性也未達(dá)到顯著水平(P>0.05，表5)。

3 討 論

3.1 試驗材料的選擇

林麝為國家一級瀕危保護(hù)動物，實(shí)驗材料來源珍貴。本研究操作人員熟練了掌握林麝血液采集的方法，在盡量減少對林麝刺激的情況下，迅速采集林麝肢外周靜脈血，為試驗的開展提供了充足的研究原材料。

本研究材料來源地馬爾康養(yǎng)獐場，為全國最大的人工養(yǎng)麝馴養(yǎng)基地，現(xiàn)存林麝800余頭，有300多頭公麝可作為試驗對象，最大限度的反應(yīng)了選擇的研究樣本能代表整體和種群的特征，對分析林麝個體的基因型，估測不同基因型對泌香性狀的關(guān)聯(lián)分析產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。根據(jù)前期生產(chǎn)記錄，本研究能充分了解這些個體的遺傳特點(diǎn)，弄清他們之間的血緣關(guān)系，為雜種優(yōu)勢利用提供最佳配合力方面的信息，為今后更合理的開發(fā)利用這些公麝群體，提高泌香性能，選育高產(chǎn)群體奠定基礎(chǔ)。

表4 LHβ基因與產(chǎn)香性狀及體重的關(guān)聯(lián)分析

表5 FSHβ基因與產(chǎn)香性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2 林麝泌香候選基因的選擇

研究報道性腺軸激素與林麝的泌香有密切關(guān)系，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控泌香過程，具體林麝泌香的途徑如下：丘腦下部→LRH→垂體前葉→LH、FSH→睪丸間質(zhì)細(xì)胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香內(nèi)轉(zhuǎn)化→麝香。本研究選取了與泌香過程調(diào)控密切相關(guān)的2個候選基因(FSHβ、LHβ)進(jìn)行泌香機(jī)制研究。林麝與其他哺乳動物的FSH和LH基因是共同起源的[9]，在泌香過程中垂體前葉堿性細(xì)胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通過調(diào)節(jié)雄性激素的分泌進(jìn)而影響麝香的生成。汪建隆等[12]也證實(shí)FSH與LH影響麝香分泌。在分型過程中，本研究僅對上述基因的外顯子和啟動子區(qū)域進(jìn)行了研究，沒有對其內(nèi)含子進(jìn)行研究，研究不充分，還需進(jìn)一步完善。

3.3 高通量篩選SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性

本研究在林麝全基因組水平上一共篩選了8 259 941個SNP位點(diǎn)，這對于深入研究其生物機(jī)理具有重要的理論意義。對產(chǎn)香候選基因FSHβ和LHβ的28個SNP 進(jìn)行質(zhì)譜分型，其中5個SNP位點(diǎn)由于技術(shù)原因質(zhì)譜分型失敗，3個SNP位點(diǎn)檢測出來均無突變，其余20個SNP位點(diǎn)均成功分型，除去技術(shù)原因，分型成功率達(dá)87 %，因此本研究測得的SNP具有較高準(zhǔn)確性。

3.4 LHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)香性能的關(guān)聯(lián)分析

本研究選擇了LHβ基因的11個SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗證，并將其多態(tài)性與林麝產(chǎn)香性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。其中SNP01和SNP03的哈溫P值均小于0.05，基因型頻率分布顯著偏離哈代-溫伯格平衡。我們認(rèn)為原因可能是，群體中人工選育對這一基因座的選擇壓力不強(qiáng)，所以要提高選擇強(qiáng)度，進(jìn)一步加強(qiáng)選育工作。其余9個SNP位點(diǎn)，通過單個SNP位點(diǎn)與產(chǎn)香性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，編號為SNP13的位點(diǎn)突變，與林麝產(chǎn)香量性能高度相關(guān)(P<0.05)。SNP13距離基因啟動子3648 bp，位于基因下游1758 bp處，堿基C突變?yōu)榱薚。其中TT型個體相比于CC、CT型個體產(chǎn)香量存在極顯著差異(P<0.01)，是優(yōu)勢基因型。林麝體重與LHβ的SNP未達(dá)到顯著相關(guān)(P>0.05)，說明LHβ基因多態(tài)性對林麝的體重影響不大。

3.5 FSHβ基因多態(tài)性與產(chǎn)香性能的關(guān)聯(lián)分析

在FSHβ基因上下游驗證得到9個SNP位點(diǎn)，通過單個SNP位點(diǎn)與產(chǎn)香性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，分別位于基因上游1904 bp處的SNP15和1341 bp處的 SNP20與林麝產(chǎn)香量性顯著相關(guān)(P<0.05)，SNP15中的AA型與GG型個體存在極顯著差異(P<0.01)，是優(yōu)勢基因型。體重與FSHβ基因相關(guān)性也均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，說明FSHβ基因多態(tài)性對林麝的體重影響不大。

4 結(jié) 論

本研究通過高通量測序?qū)?00只圈養(yǎng)林麝進(jìn)行多態(tài)性檢測，在全基因組范圍得到了8 259 941個潛在SNP位點(diǎn)。利用質(zhì)譜分型，對100只林麝進(jìn)行質(zhì)譜分型，結(jié)合體重與產(chǎn)香數(shù)據(jù)，去除提取DNA質(zhì)量差的個體，發(fā)現(xiàn)只有74個樣品符合實(shí)驗要求。在FSHβ和LHβ基因中及上下游驗證得到20個SNP位點(diǎn)，其中14個SNP位于基因的非編碼區(qū)，并發(fā)現(xiàn)位于FSHβ基因上游的SNP15、SNP20和位于LHβ基因下游的SNP13與林麝泌香性能高度相關(guān)(P<0.05)。這些突變位點(diǎn)可作為分子標(biāo)記運(yùn)用于林麝的人工選育，并為高產(chǎn)香林麝群體培育選種提供輔助依據(jù)。