武淑文，侯磊，洪子萌，范黎明，葉敏*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明650224）

阿特拉津是世界產(chǎn)量最大的除草劑，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有生物毒性、易溶于水[1]，是地表和地下水體中檢出率最高的除草劑之一[2]。水生植物對阿特拉津污染具有較高的敏感性，低濃度的阿特拉津即可對水生植物造成嚴(yán)重的毒性效應(yīng)[3]，引起植物抗氧化系統(tǒng)的改變。研究表明，阿特拉津會對水蔥[4]、千屈菜[5]、菖蒲[6-7]、美人蕉[8]、蘆葦[9]等挺水植物抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響，引起超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等酶活性及非酶系統(tǒng)谷胱甘肽（GSH）活性的變化，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物丙二醛（MDA）的積累。

人類活動帶來的氮、磷等營養(yǎng)鹽輸入劇增引起的水體富營養(yǎng)化，能夠?qū)е滤参锷L及生理生化的改變[10]。磷素不僅是調(diào)控水生植物生長發(fā)育的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，而且是引起水體富營養(yǎng)化的限制性成分[11]，水體磷濃度超過0.02 mg·L-1，就會明顯促進水體富營養(yǎng)化[12]。適宜濃度磷輸入能夠提高水生植物葉綠素a 含量[13-15]和過氧化氫酶（CAT）活性[14]，降低MDA 含量[15]，但過高的磷輸入會導(dǎo)致葉綠素含量減少，引起抗氧化酶保護系統(tǒng)的改變，造成過氧化毒害及葉片中MDA 積累量增多[13]。

阿特拉津和磷均能從農(nóng)業(yè)徑流進入地表水體，它們的時空共存具有普遍性[16]，并存在復(fù)雜的交互作用。外源磷的輸入能夠增加阿特拉津?qū)χ参锏亩拘?。Dantin 等[17]報道，美洲苦草在高含磷營養(yǎng)鹽水體中生長3 個月后，再暴露于阿特拉津環(huán)境，阿特拉津?qū)嗖荻拘栽鰪?。向大豆中施加阿特拉津和外源磷，促進了大豆對磷的吸收，提高了其對阿特拉津損傷的敏感性[18]。目前，關(guān)于水體中阿特拉津或磷的污染效應(yīng)，大多數(shù)研究側(cè)重于單一污染物對水生植物的影響，但從植物磷吸收及抗氧化酶系統(tǒng)角度探討阿特拉津和磷復(fù)合污染對濕地水生植物生理生化特征影響鮮見報道。本研究選用我國濕地中常見的挺水植物香蒲（Typha angustifolia L.）為對象，通過水培實驗，探究在阿特拉津脅迫條件下外源磷對香蒲地上部和地下部磷含量、葉綠素含量、葉片抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響，以期為探索水體中阿特拉津和富營養(yǎng)化復(fù)合污染條件下植物修復(fù)的生理生化過程與機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

實驗所用阿特拉津（純度≥97%）購于上海源葉生物科技有限公司。香蒲為一年生幼苗，購于昆明泛亞花卉公司。實驗前先清洗去除幼苗淤泥，再置于晾曬過的自來水中緩苗24 h 后，移于5%Hoagland 營養(yǎng)液（營養(yǎng)液中不添加阿特拉津及磷）預(yù)培養(yǎng)馴化適應(yīng)14 d。待長出新根后，挑選生長正常、長勢一致的香蒲幼苗（平均鮮質(zhì)量18.0±4.5 g）移于放置在塑料圓桶（直徑18 cm，高19 cm）上的定植籃內(nèi)，植物根部穿過籃底浸入培養(yǎng)液中，籃內(nèi)填充礫石固定植物，定植籃底部高于桶內(nèi)水面。桶外用黑色塑料袋包裹避光處理（防止阿特拉津光解），每個水培桶放置3株幼苗。

1.2 實驗設(shè)計

采用交互脅迫設(shè)計，研究阿特拉津與外源磷復(fù)合污染對香蒲磷吸收與抗氧化酶的影響。依據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838—2002）Ⅴ類水體總磷濃度≤0.4 mg·L-1、文獻[4，19]以及前期室內(nèi)水培實驗，以對植物有一定脅迫效應(yīng)為宜，分別設(shè)置3 個磷（NH4H2PO4）濃度梯度（0.5、4、10 mg·L-1）及阿特拉津濃度梯度（0.5、2、5 mg·L-1），并設(shè)置空白對照（不添加阿特拉津），共12 個處理。先用阿特拉津和丙酮配制1 g·L-1母液，然后移取母液，用5%Hoagland營養(yǎng)液配制的不同磷濃度溶液稀釋至相應(yīng)阿特拉津濃度，對照處理加與配制母液相同體積的丙酮，以消除誤差。每個處理3 個重復(fù)，每桶營養(yǎng)液體積1.6 L，所有處理均置于日光溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)期間溫室內(nèi)溫度為20～30 ℃，光強約為自然光強的60%。桶上標(biāo)記水位線，每日補充蒸餾水至水位線。培養(yǎng)時間10 d。實驗結(jié)束采集植物樣品，一部分用于測定植物葉綠素和抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)，另一部分烘干測定植物中磷含量。

1.3 指標(biāo)測定

水培10 d 后，將幼苗從培養(yǎng)液中取出，用蒸餾水沖洗后帶回實驗室，選擇香蒲從上往下第3 片或第4片新鮮葉片，測量葉綠素含量、抗氧化酶指標(biāo)。葉綠素a 和葉綠素b 含量測定采用無水乙醇浸泡提取法[20]。取植物葉片，洗凈、晾干，去除中脈后剪碎，稱取0.1 g，加入10 mL 95%乙醇于暗處浸提，并不時搖動，至葉子全白。以95%乙醇為空白對照，利用UV-2400 紫外可見分光光度計測定樣品提取液在665、649 波長下吸光度A 值。葉綠素a（Ca，mg·L-1）、葉綠素b（Cb，mg·L-1）濃度計算公式分別為公式（1）和（2）：

葉綠素含量（mg·g-1）=葉綠素濃度（mg·L-1）×提取液體積（L）/樣品鮮質(zhì)量（g）。

植物葉內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）等指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所開發(fā)的試劑盒進行分析測定。稱取0.1 g 新鮮植物葉片，加入0.9 mL 0.9%生理鹽水，冰浴研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃離心10 min（4 000 r·min-1），上清液即為酶提取液。提取液采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒處理，使用UV-2400紫外可見分光光度計測定。

植物采集后分割為地上（莖和葉）和地下部（根），于105 ℃殺青30 min，然后置于75 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，記錄干質(zhì)量。用粉碎機研磨，過40 目篩混勻。采用濃硫酸和高氯酸配制而成的混酸消煮，鉬銻抗分光光度法測定植物組織中磷含量[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 23.0進行相關(guān)性分析以及阿特拉津和磷濃度處理組間差異的顯著性檢驗，選用Duncan 模型，顯著性水平設(shè)置為P<0.05，利用Canoco 5進行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津脅迫下外源磷對香蒲磷吸收的影響

阿特拉津脅迫下不同外源磷濃度梯度對香蒲地上部、地下部磷含量影響如圖1 所示。單外源磷處理條件下，地上部與地下部磷含量隨著外源磷增加而提高。0.5 mg·L-1和2 mg·L-1阿特拉津處理下，隨著外源磷增加，香蒲地上和地下部磷含量顯著升高（P<0.05），最大值出現(xiàn)在10 mg·L-1外源磷處理，地上部和地下部磷含量分別是對照組的2.7～6.6 倍和2.2～3.1倍；5 mg·L-1阿特拉津處理下，地上部與地下部磷含量均高于對照組，但隨外源磷增加先升高再降低，地上部和地下部磷含量最大值出現(xiàn)在4 mg·L-1濃度外源磷處理，分別是對照組的10.1倍和5.6倍。因此，阿特拉津脅迫下，外源磷提高了香蒲地上部和地下部對磷的吸收。

2.2 阿特拉津脅迫下外源磷對香蒲抗氧化系統(tǒng)的影響

阿特拉津脅迫下外源磷對香蒲葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響如圖2 所示。單外源磷處理條件下，SOD 活性差異不顯著（P>0.05），CAT與GSH活性隨著外源磷水平增加而顯著上升（P<0.05）；0.5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷對SOD 活性影響不顯著（P>0.05），顯著提升了CAT 與GSH 活性（P<0.05）；2 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷對SOD 和CAT 活性影響不顯著（P>0.05），低濃度外源磷顯著提高了GSH 活性（P<0.05）；5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷顯著降低了SOD 與CAT 活性（P<0.05），對GSH 活性影響不明顯（P>0.05）。結(jié)果表明，高濃度阿特拉津脅迫下，外源磷顯著降低了香蒲葉片抗氧化酶活性。

2.3 阿特拉津脅迫下外源磷對香蒲葉綠素和MDA 的影響

由圖3 可見，單外源磷處理對香蒲葉綠素a 和葉綠素b 含量無明顯影響（P>0.05）。0.5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷顯著增加了葉綠素b 含量（P<0.05），對葉綠素a 含量影響不顯著（P>0.05）；2 mg·L-1阿特拉津處理下，高外源磷（10 mg·L-1）顯著提高了葉綠素a和葉綠素b含量（P<0.05）；5 mg·L-1阿特拉津處理下，葉綠素a 和葉綠素b 含量顯著低于其他處理組（P>0.05），外源磷降低了葉綠素a 和葉綠素b 含量。結(jié)果表明，中低濃度阿特拉津處理下，外源磷有助于提高葉綠素a和葉綠素b含量。

單外源磷處理條件下MDA 含量無明顯差異（P>0.05）。0.5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷對MDA含量影響不顯著（P>0.05）；2.0 mg·L-1阿特拉津處理下，低外源磷顯著增加了MDA 含量（P<0.05），高外源磷顯著降低了MDA 含量（P<0.05）；5 mg·L-1阿特拉津處理下，隨著外源磷水平的提高MDA含量顯著增加（P<0.05）。結(jié)果表明，中低濃度阿特拉津處理下，外源磷降低了MDA的積累。

2.4 外源磷、阿特拉津濃度與香蒲生理生化指標(biāo)間的相互關(guān)系

低濃度和高濃度阿特拉津脅迫下外源磷與香蒲生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析如表1 所示。在0.5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷與地下部、地上部磷含量、葉綠素a 和葉綠素b 含量在0.05 檢驗水平存在顯著正相關(guān)，與GSH 活性在0.01 檢驗水平存在極顯著正相關(guān)，即在低濃度阿特拉津脅迫下，外源磷的增加有助于香蒲體內(nèi)磷含量和葉綠素含量的提高，誘導(dǎo)GSH 活性升高。在5 mg·L-1阿特拉津處理下，外源磷與MDA 含量在0.01 檢驗水平存在顯著正相關(guān)，即在高濃度阿特拉津脅迫下，外源磷的增加提高了MDA積累，表明高濃度外源磷會加重香蒲細胞的膜脂過氧化程度。

利用Canoco 5進行香蒲生理生化指標(biāo)與外源磷、阿特拉津濃度間的RDA 分析，結(jié)果如圖4 所示。阿特拉津脅迫下外源磷與葉綠素a 和葉綠素b 含量、地下和地上部磷含量、CAT 和GSH 活性呈正相關(guān)關(guān)系，表明外源磷的輸入能夠促進植物積極地調(diào)動其防御系統(tǒng)抵御阿特拉津脅迫。阿特拉津濃度與地上和地下部磷含量、MDA 含量在同一區(qū)間，箭頭方向一致且夾角較小，表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，與GSH、SOD 活性箭頭方向相反，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明高濃度阿特拉津脅迫能夠降低抗氧化酶活性，導(dǎo)致MDA 含量升高。

3 討論

磷作為細胞質(zhì)和細胞核的主要構(gòu)成元素，能夠通過促進植物細胞分裂、光合作用、酶系統(tǒng)的激活及植物生長，進而提升植物的抗逆性和適應(yīng)性[22]。水生植物體內(nèi)磷含量往往隨水體中磷營養(yǎng)水平的增高而逐漸增加[23]，以提高自身的抵抗能力。本研究發(fā)現(xiàn)無論是在何種濃度的阿特拉津脅迫下，隨外源磷輸入，香蒲地上（0.052～0.711 mg·g-1）和地下部（0.043～0.394 mg·g-1）磷含量均高于對照組，說明阿特拉津脅迫下外源磷刺激了植物對水體中磷的吸收。這可能是由于植物在逆境脅迫條件下，通過增加體內(nèi)磷含量來提高代謝水平，增強抵抗能力[24]。然而，植物地上部與地下部對磷的吸收量受除草劑與外源磷交互作用的調(diào)控[25]。中低阿特拉津濃度（0.5 mg·L-1和2 mg·L-1）處理下，香蒲地上部和地下部磷含量均在高磷濃度（10 mg·L-1）時達到最大值；而高阿特拉津濃度（5 mg·L-1）脅迫下，地上部和地下部磷含量最大值出現(xiàn)在中濃度（4 mg·L-1）外源磷處。植物地上部與地下部對磷的吸收能力具有同步性，地下部含磷量高的，一般地上部含磷量也較高[26]。阿特拉津和外源磷復(fù)合脅迫下，香蒲地上部磷含量均高于地下部，這與其他研究報道的香蒲[27]、鳶尾、菖蒲[28]等濕地植物體內(nèi)磷含量分布規(guī)律相一致。這是由于葉是植物進行光合作用合成碳水化合物的重要場所，是積累磷的主要器官[28]，葉片的高磷含量提高了植物地上部磷含量。

植物受到環(huán)境脅迫，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），ROS 會攻擊細胞膜，從而引起細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細胞的損傷和破壞[29]。逆境脅迫下，適當(dāng)?shù)耐庠戳卓梢酝ㄟ^提高植物SOD、CAT 等抗氧化酶的活性而消除ROS 積累，使細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除維持在一個平衡狀態(tài)，從而提高水生植物的抗逆性[30]。本研究中低濃度（0.5 mg·L-1）阿特拉津處理下，外源磷顯著提高了CAT 活性，而SOD 活性無明顯變化，說明阿特拉津脅迫下，香蒲葉片中的CAT比SOD 對外源磷的增加更敏感[14]；而在高濃度（5 mg·L-1）處理下，不同濃度外源磷降低了SOD 和CAT 活性，這與皇竹草在高濃度阿特拉津（40 mg·L-1）脅迫下葉片SOD 和CAT 活性顯著降低研究結(jié)果一致[31]。植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基超過了SOD、CAT的清除能力，抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡被破壞。GSH是植物體內(nèi)一種重要的還原性物質(zhì)，是胞內(nèi)代謝過程和植物遭受氧化脅迫時所產(chǎn)生的過氧化物最有效的清除劑之一[32]。董靜[33]研究發(fā)現(xiàn)隨著阿特拉津脅迫的加強，美人蕉體內(nèi)GSH 活性先增后減，當(dāng)阿特拉津濃度超過1 mg·L-1，GSH 由于清除了大量活性氧自由基而導(dǎo)致其活性的降低。本實驗在低濃度（0.5 mg·L-1）阿特拉津處理下，高外源磷水平GSH 活性顯著高于低外源磷，說明在低濃度阿特拉津脅迫下，外源磷的增加能夠誘導(dǎo)GSH 活性的提高；在中等濃度（2 mg·L-1）阿特拉津處理下GSH活性的升高則出現(xiàn)在低濃度的外源磷處，說明低外源磷水平可以緩解阿特拉津脅迫造成的GSH 活性降低；但在高濃度（5 mg·L-1）阿特拉津處理下，外源磷卻未能對GSH 活性產(chǎn)生顯著變化，表示其可能會對香蒲的抗氧化酶系統(tǒng)造成破壞。

表1 不同阿特拉津濃度處理下外源磷與香蒲生理生化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficients among concentrations of exogenous phosphorus and atrazine and physiological and biochemical indicators of cattail

MDA 是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反映了植物細胞膜受傷害的程度[6]。而磷則對葉綠素含量及其合成起著重要作用，適宜的外源磷能夠提高植物體內(nèi)葉綠素a 和葉綠素b 含量、降低MDA 含量[13]。本實驗在中低濃度（0.5 mg·L-1和2 mg·L-1）阿特拉津處理下，外源磷提高了植物體內(nèi)磷含量以及葉綠素a和葉綠素b 含量，降低了MDA 含量，說明外源磷抑制了阿特拉津?qū)ο闫训纳砻{迫。這是由于在阿特拉津脅迫下，外源磷的輸入促進了植物對磷的吸收，有利于葉綠素a 和葉綠素b 合成，植物營養(yǎng)狀況得到改善，增強了其對逆境的適應(yīng)能力，并通過提高CAT、SOD和GSH等酶的活性抵御活性氧，降低MDA含量，避免細胞膜受到傷害。但高濃度脅迫下，葉綠體膜的氧化脅迫可對葉綠素的形成產(chǎn)生抑制，合成葉綠素所需酸受到破壞，導(dǎo)致葉綠素的含量降低[34]。研究報道阿特拉津脅迫濃度高于2 mg·L-1時，千屈菜[5]、水蔥[4]葉綠素a含量、黃花鳶尾[35]葉綠素a和葉綠素b含量以及蘆葦[9]葉綠素b 含量顯著下降，白菜幼苗[36]葉綠素生成受到抑制、MDA 含量增加。本研究結(jié)果也表明，高濃度（5 mg·L-1）阿特拉津脅迫處理下，不同外源磷水平引起MDA 含量的顯著升高，而葉綠素a 和葉綠素b 含量顯著降低。這是由于高濃度阿特拉津脅迫能夠造成SOD、CAT 和GSH 活性降低，產(chǎn)生過量活性氧自由基破壞了植物抗氧化酶的平衡系統(tǒng)，細胞膜質(zhì)過氧化對植物造成了損傷，這種傷害會隨著外源磷水平增加而增強[37]。

目前，富營養(yǎng)化水體磷的削減主要通過水生植物的吸收、富集及定期收割而去除[38]。因此，本研究探討不同濃度阿特拉津與外源磷交互作用下香蒲磷的吸收、葉綠素a和葉綠素b含量、抗氧化酶活性及膜質(zhì)過氧化物的變化特征及規(guī)律，有助于理解農(nóng)藥污染脅迫條件下植物削減水體外源磷的過程與機制，對于水體富營養(yǎng)化減緩及水體污染消減均具有一定指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

阿特拉津脅迫下，外源磷提高了香蒲地上和地下部磷含量。中低濃度（0.5 mg·L-1和2 mg·L-1）阿特拉津處理下，外源磷能夠促進香蒲葉綠素a 和葉綠素b 含量增加，激活葉片CAT、GSH 活性，緩解膜質(zhì)過氧化，減少MDA 積累。高濃度（5 mg·L-1）處理下外源磷加重了香蒲受到的阿特拉津傷害，表現(xiàn)為葉綠素含量以及SOD、CAT、GST 活性顯著降低，MDA 含量明顯提升。