陳 慶 李海虹 歐偉寧 張 幸

1.廣西壯族自治區(qū)玉林市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西玉林 537000；2.廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院質(zhì)控科，廣西玉林 537000；3.桂林醫(yī)學(xué)院廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541100

腎癌惡性程度較高，化療、放療效果不好，且近幾年國內(nèi)外發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。芒柄花黃素是一種異黃酮類植物雌激素，其能調(diào)節(jié)分子信號(hào)通路對(duì)腫瘤產(chǎn)生抑制作用[3-5]，但對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O 的作用及機(jī)制卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究芒柄花黃素對(duì)786-O 細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，為腎癌的治療尋找新的藥物及思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人腎癌細(xì)胞株786-O 購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；芒柄花黃素（貨號(hào)：47752-25MG-F）購于美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone 公司；CCK8 試劑盒（貨號(hào)：C0038）、Hoechst33258（貨號(hào)：C1018）、V-FITC 凋亡檢測試劑盒（貨號(hào)：C1062M）購于上海碧云天研究所；PI3K 抗體（貨號(hào)：PA5-86628）、P-PI3K 抗體（貨號(hào)：PA5-38905）購于美國Thermo Scientific 公司；AKT（貨號(hào)：sc-5298）、P-AKT抗體（貨號(hào)：sc-377556）購于美國Santa Cruz 公司；CFX96 熒光定量PCR 儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad 公司；FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀購于美國Becton Dickson 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 786-O 細(xì)胞于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組 根據(jù)加入到786-O 細(xì)胞中的芒柄花黃素劑量（0、20、40、80 μmol/L）分為對(duì)照組（A 組）、芒柄花黃素低劑量組（B 組）、芒柄花黃素中劑量組（C 組）、芒柄花黃素高劑量組（D 組）。

1.2.3 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長期的786-O 細(xì)胞接種于96 孔板，濃度為5×103個(gè)/孔，加藥分組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，加10 μL CCK8 溶液避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀測吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率=（1-藥物組平均OD 值/對(duì)照組平均OD 值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長期的786-O 細(xì)胞接種于6 孔板，孵育12 h，待細(xì)胞貼壁，去上清液，分別加入0、20、40、80 μmol/L 濃度的藥液，繼續(xù)孵育48 h，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS 清洗3 次，2000 r/min 離心5 min，離心半徑12 cm，棄上清液，加500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC及5 μL Propidium Iodide 混勻，在室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Hoechst 染色觀察細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長期的786-O 細(xì)胞接種于6 孔板，孵育12 h，待細(xì)胞貼壁，去上清液，分別加入0、20、40、80 μmol/L 濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后棄培養(yǎng)基，加入0.5 mL 的固定液，作用10 min 后棄固定液，PBS 清洗2 次，加Hoechst33258染色液觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 RT-PCR 檢測miR-155 的表達(dá)情況 Trizol 提取總RNA，按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄總RNA 為cDNA，以cDNA 為模板用RT-PCR 檢測miR-155 表達(dá)情況。miR-155 上游引物：5’-TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3’，下游引物：5’-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3’。U6 上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5 min；循環(huán)以下條件40 次：95℃30 s，60℃25 s，72℃15 s。以U6 RNA 為內(nèi)參，計(jì)算miR-155 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot 檢測P-PI3K 及P-AKT 蛋白表達(dá)情況 收集上述幾種濃度的藥液孵育48 h 后的786-O 細(xì)胞，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。每孔20 μL 上樣，電泳4 h，PVDF 膜半干轉(zhuǎn)1.5 h，用5%脫脂奶粉的PBS液室溫封閉60 min，之后分別加入稀釋度1∶1000 的PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT 抗體4℃過夜，次日TBS洗膜，HRP 標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)60 min，置暗室曝光條帶。凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：四組時(shí)間、組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示藥物對(duì)786-O 細(xì)胞具有抑制作用。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)72 h，B、C、D 組細(xì)胞增殖抑制率高于培養(yǎng)24、48 h；培養(yǎng)48 h，B、C、D 組細(xì)胞增殖抑制率高于培養(yǎng)24 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。組間比較發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)24、48、72 h，B、C、D 組細(xì)胞增殖抑制率高于A 組，C、D 組細(xì)胞增殖抑制率高于B 組，D 組細(xì)胞增殖抑制率高于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.05）。見表1。

表1 四組細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率比較（%，，n=3）

表1 四組細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率比較（%，，n=3）

注：與A 組同期比較，*P＜0.05；與B 組同期比較，▲P＜0.05；與C 組同期比較，■P＜0.05；與本組24 h 比較，◆P＜0.05；與本組48 h 比較，★P＜0.05

2.2 四組細(xì)胞凋亡率比較

四組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；B、C、D 組細(xì)胞凋亡率高于A 組，C、D 組細(xì)胞凋亡率高于B 組，D 組細(xì)胞凋亡率高于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.05）。見表2。Hoechst 染色結(jié)果顯示，B、C、D 組可見細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核致密濃染，且藥物劑量越高，細(xì)胞凋亡越明顯；A 組細(xì)胞核完整，形態(tài)飽滿。見圖1。

表2 四組細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

表2 四組細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，▲P＜0.05；與C 組比較，■P＜0.05

圖1 各組細(xì)胞熒光顯微照片（400×）

2.3 四組細(xì)胞miR-155 表達(dá)水平比較

B、C、D 組細(xì)胞miR-155 表達(dá)水平低于A 組，C、D 組細(xì)胞miR-155 表達(dá)水平低于B 組，D 組細(xì)胞miR-155 表達(dá)水平低于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.05）。見圖2。

圖2 四組細(xì)胞miR-155 表達(dá)水平比較（n=3）

2.4 四組細(xì)胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達(dá)水平比較

B、C、D 組細(xì)胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達(dá)水平低于A 組，C、D 組P-PI3K、P-AKT 蛋白表達(dá)水平低于B 組，D 組細(xì)胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達(dá)水平低于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.05）。見圖3。

圖3 四組細(xì)胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

3 討論

化療及靶向治療腎癌近年來逐漸發(fā)揮重要作用[6]，而傳統(tǒng)化療藥物易產(chǎn)生毒副作用，破壞人體免疫系統(tǒng)，反而使癌細(xì)胞更易擴(kuò)散[7-8]。有研究顯示[9-11]，芒柄花黃素能多靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，芒柄花黃素抑制786-O 細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 染色均顯示藥物劑量越高，786-O 細(xì)胞凋亡率越高，與CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。提示藥物可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制786-O 細(xì)胞增殖。

miRNA 是一類通過誘導(dǎo)靶基因降解或阻斷其翻譯過程沉默該基因的表達(dá)進(jìn)而對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移起重要作用的小分子非編碼RNA[12-14]。隨著對(duì)microRNA 研究的深入，microRNA 被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在重大聯(lián)系[15-18]。miR-155 在大多數(shù)腫瘤例如結(jié)腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌中表達(dá)較高[19-23]，提示miR-155 作為癌基因過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。PI3K 是一種原癌基因，經(jīng)活化后產(chǎn)生的PIP3 可使AKT 被激活產(chǎn)生磷酸化，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等進(jìn)程[24]，因此PI3K/AKT 信號(hào)通路異常激活能促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞的凋亡[25]。研究顯示[26]，miR-155 能通過PI3K/AKT 通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而下調(diào)miR-155 能抑制PI3K/AKT 通路的激活，明顯抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，芒柄花黃素能使miR-155 表達(dá)水平降低，P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 比值降低，即PI3K/AKt 通路激活被抑制。提示芒柄花黃素抑制786-O 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制可能與其下調(diào)miR-155 表達(dá)，抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路激活有關(guān)，本研究為腎癌的治療提供了新的思路和方法，具有重要研究價(jià)值。