劉 楊 趙向絨 郭春艷 李 研 胡 軍

（陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，西安710068）

甲型流感病毒（influenza A virus）屬正黏病毒科，流感病毒屬，是引起急性呼吸道感染的主要病原體之一，抗原易變異，多次引起世界性大流行，給人類生命健康和經(jīng)濟發(fā)展造成極大危害。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展迅速，跨地區(qū)交流、合作、旅游等日益頻繁，大中型城市擴建及大部分地區(qū)城鎮(zhèn)化建設(shè)逐年增加，城鎮(zhèn)人口居住密集，為流感傳播提供了有利條件。因此，流感的快速檢測、治療、病毒變異及病毒致病機制研究具有重要意義。特異性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAbs）在流感病毒快速檢測、動物感染模型保護(hù)效果評價及病毒研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1-2］。本研究采用A/PR/8/34（H1N1）流感病毒顆粒免疫小鼠制備mAbs，并鑒定抗體特性，評價抗體在免疫熒光、細(xì)胞免疫化學(xué)染色和ELISA中的作用，為流感快速檢測及研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 A/PR/8/34（H1N1）甲型流感病毒為本實驗室保存毒株；MDCK細(xì)胞為陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒所惠贈；9日齡SPF雞胚購自北京實驗動物中心；普通雞胚購自西安華禽養(yǎng)殖場；6～8周齡BALB/c小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；CP90WX超速離心機購于自日本日立公司；熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS；辣根過氧化物酶（HRP）和牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；mAb亞型鑒定試劑盒、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自Southern biotech公司；BCA微量蛋白定量試劑盒、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自Thermo Fisher Scientific公司；TPCK-胰酶購自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋。

1.2 方法

1.2.1 病毒雞胚培養(yǎng)和純化 取A/PR/8/34（H1N1）毒種接種于9日齡雞胚尿囊腔，35℃培養(yǎng)72 h，收集尿囊液，4℃下甲醛滅活。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集上清，30 000 r/min（離心半徑9.21 cm）超速離心4 h，PBS（100 mmol/L，pH=7.2）重懸，鋪于預(yù)先制備的5%～60%蔗糖密度梯度液，水平轉(zhuǎn)頭（P40ST）20 000 r/min（離心半徑15.88 cm）離心6 h，收集病毒層，BCA微量蛋白定量試劑盒對純化產(chǎn)物進(jìn)行總蛋白濃度定量，按照試劑盒說明書進(jìn)行，收集病毒層置于-80℃保存［3］。

1.2.2 mAbs制備 BALB/c小鼠腹腔注射純化的A/PR/8/34（H1N1）病毒顆?？乖M(jìn)行免疫，0.05 mg/只，每隔2周加強免疫，融合前3 d追加免疫。無菌條件下取免疫小鼠脾臟研磨并與Sp2/0細(xì)胞混合，50%PEG4000溶液進(jìn)行細(xì)胞融合，加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選陽性孔按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，建立mAb細(xì)胞株。RP?MI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞一部分凍存作為細(xì)胞種子，一部分腹腔內(nèi)注射于BALB/c小鼠（腹腔內(nèi)注射0.2 ml石蠟油后10 d的小鼠），0.2 ml/只（1.25×104個），10 d左右收集腹水［4］。

1.2.3 mAbs反應(yīng)特性鑒定按照mAb亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行抗體類和亞類鑒定。采用建立的ELISA法檢測抗體效價，單抗腹水依次進(jìn)行倍比稀釋，進(jìn)行ELISA試驗，Sp2/0細(xì)胞腹水作為陰性對照。mAbs特異性和交叉反應(yīng)性鑒定：分別將A/PR/8/34（H1N1）、A/Shaaxi/01/2009（H1N1）抗原、A/Shaanxi/01/2014（H3N2）抗原、胎牛血清、正常雞胚尿囊液等不同抗原包被ELISA板，分別加入mAbs，檢測與抗原是否具有交叉反應(yīng)性。

1.2.4 中和試驗 無菌條件下收集小鼠腹水，56℃滅活30 min，4倍系列稀釋mAb，分別取50μl與等體積半數(shù)組織細(xì)胞感染量（50%tissue culture infec?tious dose，TCID50，）病毒液混合，37℃孵育2 h，加入含有MDCK細(xì)胞的96孔板中，37℃孵育5～7 d，以MDCK細(xì)胞未出現(xiàn)CPE的最大抗體稀釋度的蛋白濃度作為mAbs中和滴度。

1.2.5 血凝抑制（HI）試驗 測定流感病毒血凝滴度，流感病毒培養(yǎng)液2倍系列稀釋后加入“U”型孔中，取等量0.5%雞紅細(xì)胞懸液與其混合室溫靜置1 h，以出現(xiàn)紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)作為血凝滴度。2倍系列稀釋mAb后加入“U”型孔中，與4個紅細(xì)胞凝集單位的A/PR/8/34（H1N1）病毒混合，室溫靜置30 min。加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液后充分混勻，室溫靜置1 h，以不出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度對應(yīng)的抗體蛋白濃度作為HI效價。具體方法參照“WHOManual on Animal Influenza Diagnosis and Sur?veillance”。

1.2.6 免疫熒光試驗 DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層后移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)基（含0.002 mg/ml TPCK-胰酶）病毒培養(yǎng)液，接種流感病毒，未接種流感病毒的正常細(xì)胞作為對照，待接種病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）達(dá)到50%～75%時，分別收集病毒感染細(xì)胞和對照組正常細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBST洗6次，伊文氏藍(lán)襯染5 min后，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細(xì)胞免疫化學(xué)染色試驗 DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層后移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)基（含2μg/ml TPCK-胰酶）病毒培養(yǎng)液，接種流感病毒，并設(shè)立未接種流感病毒的正常細(xì)胞為對照，待接種病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）達(dá)50%～75%時，分別收集病毒感染細(xì)胞和對照組正常細(xì)胞，10%甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，PBST洗6次，蘇木素室溫染色10 min，分化、返藍(lán)后置顯微鏡下觀察。

1.2.8 雙抗體夾心ELISA法 0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）分別稀釋mAb PR8-24和PR8-25至濃度為0.005 mg/ml，0.1 ml/孔包被96孔板，4℃靜置過夜，PBST洗3次，5%BSA封閉液于37℃孵育1 h，2倍系列稀釋500 TCID50A/PR/8/34（H1N1）流感病毒液，0.1 ml/孔加入酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1 h，PBST洗6次，分別加入HRP標(biāo)記的mAb PR8-25和PR8-24，0.1 ml/孔，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入TMB顯色液37℃孵育10 min，加入2 mol/L H2SO4終止液，測定450 nm處吸光度（OD450）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行兩變量線性相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分泌抗A/PR/8流感病毒mAbs的雜交瘤細(xì)胞株建立 共獲得13株抗A/PR8/34（H1N1）mAb雜交瘤細(xì)胞株，效價均＞104，mAbs反應(yīng)特性見表1，PR8-15為IgG3，其他12株均為IgG1亞類。PR8-10、PR8-19、PR8-20、PR8-26、PR8-28和PR8-30單抗HI滴度均≤3μg/ml，血凝抑制活性較強。PR8-13和PR8-15無中和活性，其他11株均具有中和活性。具有中和活性的mAbs PR8-10、PR8-14、PR8-16、PR8-18、PR8-19、PR8-20、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30的HI與MN滴度相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HI與MN滴度呈正相關(guān)（Pearson相關(guān)性=0.952，P＜0.01，R2=0.906，圖1）。

2.2 mAbs特異性和交叉性鑒定 細(xì)胞免疫熒光試驗結(jié)果顯示，PR8-10、PR8-14、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30 mAbs可與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK細(xì)胞結(jié)合，不與正常MDCK細(xì)胞反應(yīng)（圖2）。細(xì)胞免疫熒光試驗分析單抗交叉反應(yīng)特性顯示，PR8-24可與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）結(jié)合，不與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）結(jié)合。PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30可與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反應(yīng)，不與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反應(yīng)（圖3）。

2.3 mAbs在細(xì)胞免疫化學(xué)試驗中的應(yīng)用 采用PR8-24、PR8-25、PR8-28、PR8-30 mAbs進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色試驗，均可特異性與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK細(xì)胞結(jié)合，特異性著色主要分布于細(xì)胞漿（圖4）。

表1 mAbs特性（μg/ml）Tab.1 Characteristics of mAbs（μg/ml）

圖1 HI滴度與MN滴度線性相關(guān)性分析Fig.1 Linear correlation analysis between HI titer and MN titer

2.4 雙抗體夾心ELISA法建立 根據(jù)抗體滴度、HI滴度、特異性、MI滴度和配對檢測A/PR/8/34（H1N1）病毒靈敏性，共篩選出2株用于雙抗體夾心ELISA法構(gòu)建的mAbs，分別為PR8-24和PR8-25。雙抗體夾心ELISA法檢測結(jié)果顯示，包被PR8-24和HRP標(biāo)記PR8-25配對時，病毒培養(yǎng)液線性范圍為15.6～500 TCID50，R2=0.996 5。包被PR8-25和HRP標(biāo)記PR8-24配對時，病毒培養(yǎng)液線性范圍為15.6～500 TCID50，R2=0.997 9。以PR8-24作為包被抗體和以PR8-25作為酶標(biāo)抗體配對雙抗體夾心ELISA的檢測最低限為15.6 TCID50/0.1 ml，以PR8-25作為包被抗體和以PR8-24作為酶標(biāo)抗體配對雙抗體夾心ELISA的檢測最低限為62.5TCID50/0.1 ml（圖5）。

圖2 IFA鑒定mAbs與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染MDCK細(xì)胞的反應(yīng)特性Fig.2 Identification of response characteristics of mAbs to MDCK cells infected with A/PR/8/34（H1N1）influenza virus by IFA

圖3 IFA試驗鑒定流感病毒感染MDCK細(xì)胞Fig.3 IFA test for identification of MDCK cell infection by influenza virus

圖4 流感病毒感染MDCK細(xì)胞細(xì)胞免疫組化試驗Fig.4 Cell-based immunohistochemistry test of MDCK cells infected with influenza virus

圖5 ELISA測定A/PR/8/34/（H1N1）流感病毒培養(yǎng)上清的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of A/PR/8/34（H1N1）influenza virus culture supernatant detection by ELISA

3 討論

H1N1流感病毒是導(dǎo)致流感流行的主要甲型流感病毒，由于H1N1流感病毒抗原漂移和抗原變異頻率較高，針對H1N1的流感疫苗需要不斷變化以維持保護(hù)作用。甲型流感病毒有2個重要的表面糖蛋白，分別為血凝素和神經(jīng)氨酸酶，其中血凝素蛋白在病毒黏附和進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，同時也是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要病毒結(jié)構(gòu)蛋白［5-6］。根據(jù)血凝素蛋白功能，其蛋白可分為3個結(jié)構(gòu)域，分別為受體結(jié)合域、位于血凝素頭部下面的退化酯酶結(jié)構(gòu)域和鄰近病毒包膜的莖部區(qū)域，莖部區(qū)域是低pH觸發(fā)膜融合激活結(jié)構(gòu)域。血凝素抗體可識別并結(jié)合血凝素頭部或莖部，中和抗體與血凝素頭部結(jié)合后可抑制病毒黏附，而抗體與血凝素莖部結(jié)合后可抑制病毒與宿主細(xì)胞膜融合，抑制血凝素HA0被蛋白酶水解為HA1/HA2。

甲型流感病毒的抗原表位，尤其是中和表位主要位于病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶上，而血凝素和神經(jīng)氨酸酶為病毒包膜上的糖蛋白。KUENSTLING等［7］利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組低聚HA1蛋白，重組低聚HA1蛋白純化過程中經(jīng)過適當(dāng)折疊可使免疫小鼠產(chǎn)生中和抗體，但基因工程技術(shù)表達(dá)的血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白可能與自然病毒的血凝素或神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)不同，尤其是空間構(gòu)象表位不同，血凝素糖基化修飾數(shù)量和質(zhì)量及糖基化修飾位置對其抗原性及抗體交叉反應(yīng)性具有重要作用，決定抗原與抗體間的親和能力和中和活性［8］。流感病毒也可通過血凝素糖基化逃避中和抗體結(jié)合，導(dǎo)致免疫逃避［9］。因此，課題組以純化的H1N1流感病毒作為免疫抗原，盡可能保證病毒抗原表位與天然結(jié)構(gòu)一致，常規(guī)免疫BALB/c小鼠制備mAbs，盡可能制備及篩選出特異性抗甲型流感病毒mAbs，為后續(xù)研究提供依據(jù)。本研究共制備13株穩(wěn)定分泌抗A/PR8/34（H1N1）mAbs的雜交瘤細(xì)胞株，均具有HI活性，其中6株HI滴度≤3μg/ml。PR8-13和PR8-15無中和活性，其他11株均具有中和活性，mAb HI滴度與MN滴度呈正相關(guān)，mAb HI滴度與各MN滴度變化趨勢一致，mAb HI活性較高時，相應(yīng)mAbs MN活性也較高，而HI試驗較MN試驗操作簡單、實驗周期短、結(jié)果判定客觀，因此，血凝素抗體可用HI活性在一定條件下間接反映MN活性。此次制備的PR8-13和PR8-15 mAbs具有HI活性，無MN活性，表明具有HI活性的抗體不一定具有MN活性，而其他11株mAbs既有MN活性又具有HI活性，表明具有MN活性的血凝素抗體大多具有HI活性，主要與抗體結(jié)合的抗原表位有關(guān)，MN抗體可識別并結(jié)合血凝素頭部或莖部，與血凝素頭部結(jié)合后可抑制病毒黏附和血凝素介導(dǎo)的膜融合［10-12］。而與血凝素莖部結(jié)合后可通過阻斷pH誘導(dǎo)的血凝素構(gòu)象改變抑制病毒與宿主細(xì)胞膜融合［13］，也可抑制血凝素HA0被蛋白酶水解為HA1/HA2，血凝抑制活性的抗體主要識別并結(jié)合于血凝素頭部，因此，推測PR8-13和PR8-15 mAbs可能只結(jié)合于血凝素頭部。另外，MN抗體也可通過Fc段介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性效應(yīng)和補體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)［12］。

PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30不僅可與A/PR/8/34（H1N1）反應(yīng)，也可與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反 應(yīng)，其 中PR8-24可 與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反應(yīng)，推測A/PR/8/1934（H1N1）血凝素蛋白與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）或A/Shaanxi/02/2014（H1N1）具有相似抗原表位，尤其是A/Shaanxi/01/2014（H3N2）。與此同時，PR8-24、PR8-25、PR8-28和PR8-30既可用于IFA試驗也可用于細(xì)胞免疫化學(xué)染色，在流感病毒感染細(xì)胞或動物模型中，可依據(jù)抗體工具進(jìn)行免疫組化或IFA試驗分析病毒感染水平，也可根據(jù)血凝素表位進(jìn)行病毒亞型鑒定［14-15］。mAbs不僅可用于病毒感染研究，YEO等［16］利用2株配對的抗H7亞型流感病毒單抗建立了銪納米顆粒熒光免疫層析檢測H7流感病毒法，該方法比膠體金免疫層析檢測敏感性高25倍，免疫層析技術(shù)的最大優(yōu)點在于實現(xiàn)病毒快速定性檢測，但不能用于定量分析，因此，本研究采用上述13株mAbs隨機配對設(shè)計雙抗體夾心ELISA法檢測A/PR/8/34（H1N1），篩選出PR8-24與PR8-25可用于雙抗體夾心ELISA檢測，并以PR8-24作為包被抗體和以PR8-25作為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體建立雙抗體夾心ELISA時斜率最大，效果最好，ELISA的相對定量線性檢測范圍為15.6～500 TCID50，可為H1N1流感病毒快速定量方法的建立提供基礎(chǔ)，以及用于病毒血凝素蛋白定量或疫苗抗原定量分析［17］。TCID50測定病毒滴度周期較長，一般需要5～7 d，并以觀察細(xì)胞病變效應(yīng)或以血凝活性判斷結(jié)果，結(jié)果判斷主觀性強，而采用預(yù)先建立的雙體抗夾心ELISA法可快速檢測病毒相對含量，且結(jié)果數(shù)據(jù)為吸光度值，結(jié)果較為客觀。RAJENDRA等［18］巧妙設(shè)計出可以檢測HA莖部正確折疊與否的捕獲ELISA法，以抗血凝素頭部線性表位為包被抗體，以抗血凝素莖部空間構(gòu)象表位的抗體為檢測抗體，既可定量分析病毒血凝素含量，也可檢測血凝素莖部保守區(qū)空間構(gòu)象是否正確折疊，為流感病毒研究、疫苗含量測定、抗原表位及空間構(gòu)象分析提供支持。

甲型流感病毒是目前秋冬季節(jié)呼吸道感染的主要病原體，對甲型流感病毒的致病性、病毒毒力、疫苗、抗原保護(hù)位點及治療藥物研究顯得尤為重要，而此次制備的抗甲型流感病毒H1N1 mAbs為流感病毒的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，也為后續(xù)病毒快速定量檢測提供技術(shù)支撐。由于本實驗室甲型流感病毒各種亞型代表株不全，不能與其他亞型的甲型流感病毒進(jìn)行交叉分析，需進(jìn)一步詳細(xì)鑒定mAbs反應(yīng)特性，依據(jù)抗體特性分析其抗原表位及應(yīng)用。