林再紅 傅增輝 金 艷 姜 巖 劉 晶 于繪麗 張廣萍

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，齊齊哈爾161002）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種炎癥性脫髓鞘性神經(jīng)疾?。╥nflammatory demyelinating diseases，IDD）。白細(xì)胞介素23A（interleukin-23A，IL-23A）通過與其受體IL-23R相互作用調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞活性，并在免疫炎癥疾病的致病機理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MS是一種自身免疫性疾病，該疾病的發(fā)生發(fā)展涉及IL-23和其受體。LI等［1］發(fā)現(xiàn)IL-23R基因中rs1884444位點與MS患者發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-23R基因rs11209032、rs11209026、rs11465804位點與強直性脊柱炎和潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫疾病的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)［2-3］。γδT細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞，可調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。已有研究報道，γδT細(xì)胞表達IL-23R，參與多種自身免疫性疾病的病理形成［4］。在實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）動物模型實驗中，EAE模型動物腦脊液中的γδT細(xì)胞比例增加，而CD4+CD25+Foxp3+Treg比例降低，γδT細(xì)胞通過抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制免疫功能［5］。本研究對132例漢族非急性加重期MS患者的IL-23R基因進行分析，評估IL-23R基因內(nèi)rs11209032、rs11209026、rs11465804位點，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細(xì)胞比例，ELI?SA檢測MS患者血清IL-23水平，發(fā)現(xiàn)MS患者外周血IL-23水平和γδT細(xì)胞比例高于健康人群，但CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例低于健康人群，同時MS患者IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型及A等位基因檢測率明顯高于健康人群，可能是MS發(fā)病的危險遺傳易感基因之一。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診和病房2015年1月至2018年12月確診的漢族MS患者作為研究對象。納入要求：符合《多發(fā)性硬化診斷和治療中國專家共識》診斷標(biāo)準(zhǔn)和McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)的非急性加重期MS患者［6-7］。需排除項目：①肝炎病毒感染；②濫用酒精；③合并其他免疫相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、腫瘤等患者。本研究共入選132例MS患者，所有MS患者進行擴展殘疾狀況評分量表（ex?panded disability status scale，EDSS）評分。另選本院體檢中心、實習(xí)學(xué)生等與病例組在性別、年齡相匹配的132例健康志愿者作為對照組。研究經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均符合赫爾辛基宣言［8］要求，所有研究對象知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 ELISA檢測試劑盒、全血DNA基因組試劑盒、PE標(biāo)記的γδ單抗、CD25單抗和APC標(biāo)記的Foxp3單抗、FITC-標(biāo)記的CD4單抗和CD3單抗、IgG1-FITC、IgG2-PE均購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有研究對象空腹采肘靜脈血，分別加入無抗凝劑干燥管和EDTA-K2抗凝管（5 ml/管），用于后續(xù)全血DNA提取、流式細(xì)胞術(shù)檢測及ELISA檢測。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 調(diào)節(jié)外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）濃度至1×106個/ml，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC。加入熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體于PBMC：PE標(biāo)記的γδ單抗、CD25單抗和APC標(biāo)記的Foxp3單抗，F(xiàn)ITC-標(biāo)記的CD4單抗和CD3單抗。以IgG1-FITC和IgG2-PE為對照。胞內(nèi)細(xì)胞因子的標(biāo)記以Fixation/perme?abilization溶液進行破膜固定后，再用Permeabiliza?tion緩沖液洗滌，加入APC標(biāo)記的Foxp3單抗行細(xì)胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細(xì)胞比例，采用CellQuest V3.2軟件分析。

1.2.3 IL-23檢測 ELISA法檢測IL-23水平，實驗步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.4 DNA提取 試劑盒提取全血DNA，嚴(yán)格按說明書操作。DNA提取后，電泳檢測其完整程度，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，達標(biāo)后用于后續(xù)檢測。

表1 IL-23R基因引物序列Tab.1 Primer sequences of IL-23R gene

1.2.5 基因多態(tài)性檢測 利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，具體見表1。采用PCR?RFLP及基因測序法檢測PBMC細(xì)胞的IL-23R基因SNP類型。PCR反應(yīng)體系的建立：總體積6.4μl，其中10μmol/L的上下游引物各0.2μl、PreMix TaqDNA聚合酶3μl、DNA模板1μl、去核酸酶水2μl。PCR反應(yīng)條件；95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)36次，72℃延伸5 min。取2μlHsp92Ⅱ限制性內(nèi)切酶加入5μl的PCR擴增產(chǎn)物，37℃下孵育6 h，將3%的瓊脂糖凝膠加入酶切后的PCR產(chǎn)物，Goldview染色后于250 V下電泳，Bio-Rad凝膠成像儀檢測結(jié)果，紫外燈下切膠，回收并檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，樣本遺傳平衡檢驗采用Hardy-Weinberg計算法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 對照組132例（男36例，女96例），平均年齡（39.17±12.01）歲；MS組132例（男35例，女97例），平均年齡（38.20±11.47）歲。對照組和MS組的年齡和性別分布如表2所示，年齡、性別相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 兩組IL-23R基因rs11209032位點多態(tài)性分布 對照組和MS組PBMC細(xì)胞IL-23R基因位點rs11209026、rs11465804和rs11209032位點實際基因型分布與Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下的理論分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.290，P＝0.223；χ2=1.941，P＝0.303；χ2=2.130，P＝0.401），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達到遺傳平衡，具有群體代表性。所有研究對象均基因分型成功。對照組和MS組rs11209026和rs11465804位點的基因型均為純合子，無法用于后續(xù)研究。這與HapMap數(shù)據(jù)庫的報道一致，僅rs11209032位點用于病例對照研究。PCR擴增片段可被限制性內(nèi)切酶切為2個小片段，其中出現(xiàn)1條帶的稱為AA型，2條帶的稱為GG型，3條帶的稱為A/G型。MS組與對照組基因型頻率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.3 兩組外周血中IL-23含量及CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細(xì)胞比例比較 MS組血清中IL-23含量為（365.12±43.45）pg/ml，明顯高于對照組的（150.14±30.23）pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.196，P=0.003）；MS組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為（3.93±0.55）%，明顯均低于對照組的（7.42±1.03）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.247，P=0.008）；MS組γδT細(xì)胞比例為（5.15±0.65）%，明顯均高于對照組的（3.12±0.45）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.540，P=0.009）。

表2 兩組一般資料的比較（±s）Tab.2 Comparison of general data between two groups（±s）

表2 兩組一般資料的比較（±s）Tab.2 Comparison of general data between two groups（±s）

Index Control MS χ2/t P n 132 132 Age（years）39.17±12.01 38.20±11.47 1.014 0.339 Male 36（27.27%）35（26.52%）0.019 0.889 Female 96（72.73%）97（73.48%）EDSSscore-3.60±1.78- -Onset Age（years）-32.46±9.35- -

表3 兩組IL-23R基因rs11209032多態(tài)性的分布Tab.3 Distribution of rs11209032 polymorphism of IL-23R gene in two groups

表4 MS組基因型外周血IL-23含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-23 content in MSgroup genotype peripheral blood（±s）

表4 MS組基因型外周血IL-23含量比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-23 content in MSgroup genotype peripheral blood（±s）

Note：Compared with A/A，1）P＜0.05.

Item IL-23（pg/ml）CD4+CD25+Foxp3+Treg cell（%）γδTcell（%）A/A 535.01±71.31 2.51±0.30 6.50±0.57 A/G 382.19±40.131）3.80±0.411）5.21±0.541）G/G 262.30±63.221）4.93±0.521）4.01±0.611）t 2.501 1.038 1.934 P 0.009 0.003 0.005

2.4 MS組基因型外周血中IL-23含量及CD4+CD25+Foxp3+Treg和γδT細(xì)胞比例比較 如表4所示，MS組IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型IL-23水平和γδT細(xì)胞比例顯著高于其他基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而MS組IL-23R基因位點rs11209032 AA基因型CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例顯著低于其他基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

目前為止，MS的病因尚不明確，可能與環(huán)境、免疫及遺傳因素等有關(guān)。迄今，已發(fā)現(xiàn)眾多與MS相關(guān)的SNP位點，IL-23R基因為其中之一［9］。IL-23R可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達，從而加劇神經(jīng)髓鞘的破壞［10］。IL-23由抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥疾病中扮演關(guān)鍵角色，同時在固有或先天免疫之間有橋梁作用［11］。另外，在初始的CD4＋T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞的過程中，IL-23也發(fā)揮關(guān)鍵作用，可增加Th17細(xì)胞的數(shù)量并維持其活性，導(dǎo)致致炎細(xì)胞因子IL-17產(chǎn)生，這種IL-23/Th17/IL-17軸在MS等自身免疫病中有關(guān)鍵作用［12］。IL-23R在CD4+T細(xì)胞分化成為Th17淋巴細(xì)胞亞群的過程中起重要作用，是細(xì)胞因子IL-23異二聚體受體的特異性構(gòu)成。在IL-23R基因敲除的C57BL/6小鼠模型中，分泌IL-17的Th17淋巴細(xì)胞亞群能導(dǎo)致骨、神經(jīng)及腸道等組織的破壞［13］。還有研究表明，IL-23R的變異使患者對多發(fā)性硬化等自免疫疾病的易感性增加，該基因是解釋這些疾病易感的因素［14-15］。本研究中，所有健康志愿者和MS患者PBMC細(xì)胞IL-23R基因rs11209026和rs11465804位點的基因型均為純合子，僅rs11209032位點的基因型頻率在健康志愿者和MS患者PBMC細(xì)胞間差異顯著。通過檢測研究對象血清IL-23水平，發(fā)現(xiàn)MS患者IL-23水平高于對照組，與課題組的前期研究相符［16］。

MS是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及功能異常在MS發(fā)病中起鎖鑰作用［17］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要包含數(shù)群具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，如CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1、Th3及CD8+CD28-Treg等，在維持機體免疫及自身免疫耐受穩(wěn)態(tài)中起紐帶作用，按其來源又可分為胸腺自然生發(fā)的nTreg及與外周血通過轉(zhuǎn)化生長因子β等誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg［18］。T細(xì)胞按其表面抗原識別受體（Tcell receptor，TCR）所含肽鏈的區(qū)別，分為αβT和γδT細(xì)胞，后者能迅速識別TCR信號和模式識別信號，被認(rèn)為是一種固有免疫細(xì)胞，是固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的紐帶［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞表面IL-23R與IL-23結(jié)合，進一步分泌IL-17等炎癥因子，IL-17可進一步通過與Naive CD4+T細(xì)胞表面IL-17R結(jié)合，促進其向分泌IL-17的Th17細(xì)胞分化，而IL-21可抑制Naive CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化［20-21］。那么在MS中，IL-23是否通過與γδT細(xì)胞表面的IL-23R結(jié)合，進而活化γδT細(xì)胞并引起Th17/Treg免疫失衡？本研究發(fā)現(xiàn)，MS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例較健康人降低，故CD4+CD2 5+Foxp3+Treg的異常與MS發(fā)病有關(guān)，這與MARINA等［22］的研究相似。T細(xì)胞中約有5%的γδT細(xì)胞，是一群表達T細(xì)胞抗原受體γδ鏈的T細(xì)胞亞群。在EAE小鼠模型中的研究中，表達IL-23受體的γδT細(xì)胞可通過IL-23依賴的機制抑制CD4+CD25+Foxp 3+Treg細(xì)胞功能，從而促進CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞增殖，促進EAE發(fā)?。?3］。本研究中，MS患者外周血中γδT細(xì)胞比例較健康人顯著升高，γδT細(xì)胞在促進MS的發(fā)病中具有重要作用。課題組前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-23與IL-17表達具有關(guān)聯(lián)性，推測MS中可能存在IL-23-Th17/IL-17軸的優(yōu)勢活化，IL-23水平升高可誘導(dǎo)Th17的增殖分化并分泌IL-17，最終導(dǎo)致Th17/Treg免疫失衡，促進MS的發(fā)生發(fā)展［16］。

MS患者外周血IL-23水平和γδT細(xì)胞、IL-23R基因位點rs11209032多態(tài)性具有一定關(guān)聯(lián)，IL-23R基因位點rs11209032可能是MS發(fā)病的危險遺傳易感基因之一。IL-23R基因位點rs11209032基因多態(tài)性、外周血IL-23水平和γδT細(xì)胞三者協(xié)同可能有利于MS患者的早期診斷。本研究存在一定的局限性，存在樣本量較少且單一的弊端，尚需對不同地區(qū)、不同人群因遺傳背景和生活環(huán)境因素的不同的人群進行研究；本研究入選的MS均為非急性加重期，尚需進一步研究與急性加重期患者相關(guān)指標(biāo)進行對比，進一步深入研究將有助于MS的發(fā)病機制的理解，并為MS的診斷、治療和預(yù)后判斷提供可能的標(biāo)志物。