耿 碩

(頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司，河北 承德 067400)

橘紅以廣東省化州市所產(chǎn)最為道地，稱為化州橘紅。因其藥性辛、苦、溫，主要用于散寒、燥濕、利氣消痰，多用于止咳化痰立咽?；偌t配方顆粒(也稱單方顆粒)是使用傳統(tǒng)科學(xué)的中藥炮制方法炮制的化橘紅飲片為原料，采用先進科學(xué)的中藥精選、提取、濃縮、干燥、制粒等加工技術(shù)精制而成的單方顆粒產(chǎn)品，該產(chǎn)品保留了原飲片的在配方顆粒劑中的主要功效與作用，方便醫(yī)生在治療過程中根據(jù)病情酌情加減，隨癥施治，它既保留了原藥材的藥性、藥效，又不需要煎煮，服用方便，服用量少，吸收快，而它成分與原藥材基本一致，療效確切，安全衛(wèi)生，攜帶保存方便，易于調(diào)配更主要的是適合工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點，深得醫(yī)患認可。因橘紅同類品種不同產(chǎn)地的較多，作用略有不同，為了篩選道地藥材，控制化橘紅配方顆粒的質(zhì)量，我們選定柚皮苷為化橘紅中藥配方顆粒的特定成分，對配方顆粒中的柚皮苷做了含量測定研究，下面是是實驗過程，試驗結(jié)果顯示，該方法簡便，快速，準(zhǔn)確，可作為化橘紅配方顆粒含量的特定檢測方法。

1 儀器試劑與對照品樣品

高效液相色譜儀：儀器型號：Lab Alliance；檢測器：Lab Alliance泵：Lab Alliance；色譜工作站：ANASTAR；Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6×250mm)，具塞錐形瓶，容量瓶，萬分之一天平等，試劑：甲醇為色譜純試劑，水為超純水；其它試劑均為色譜純；對照品：柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所批號110826-201912)；樣品：藥品零售企業(yè)購買的華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的化橘紅配方顆粒。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1色譜柱

色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，本實驗采用Bonshell C18Plus 4.6mm*50mm ，2.7μm色譜柱。

2.1.2流動相的選擇

參照《中國藥典》2020年版一部第74頁，“化橘紅”含量測定項下的測定方法，以甲醇-醋酸-水(35:4:61)為流動相為流動相進行條件摸索，柚皮苷的分離度大于1.5，色譜峰對稱性良好，故選用該流動相為本標(biāo)準(zhǔn)的流動相。

2.1.3柱溫

30℃可以保證柱壓較低，分離效果穩(wěn)定，保留時間變化小。溫度的變化，對柚皮苷出峰時間有影響，但對峰面積的影響較小。

2.1.4檢測波長的選擇

柚皮苷在283處有吸收峰，《中國藥典》2020年版一部第74頁，“化橘紅”含量測定項下的測定方法，選用283nm處作為檢測波長。

3)中速暖機結(jié)束，檢查脹差、振動、汽缸溫度等各參數(shù)無異常，高壓內(nèi)缸內(nèi)壁溫度大于200 ℃，汽缸熱膨脹大于5 mm。選擇升速率100 r/min2，機組過臨界升速率自動變化為400 r/min2，升速至2000 r/min，高速暖機60 min。

2.1.5理論板數(shù)的確定

從對三批數(shù)據(jù)的測定結(jié)果可見，柚皮苷峰理論板數(shù)在1000以上，即能達到較好的分離效果,故規(guī)定理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于1000。

2.1.6對照品溶液的制備

精密秤取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1ml 含60μg的溶液，即得對照品溶液。

2.1.7供試品溶液的制備

取化橘紅配方顆粒適量，充分混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試液。

2.2 專屬性考察

陰性對照試驗；按正文[含量測定]項下的方法同法制備供試品溶液和對照品溶液。另取按相同工藝方法制備的不含化橘紅藥材的陰性對照樣品，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜條件下,分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10μl，分別注入高效液相色譜儀進行測定。

圖1 HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

取柚皮苷對照品，精密稱定12.0mg，置100ml量瓶，加甲醇制成每1m含0.10mg的溶液，作為對照品儲備液。按照下表1進行稀釋并稀準(zhǔn)確釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；分別精密吸取上述對照品溶液10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，峰面積對進樣量進行回歸分析，結(jié)果柚皮苷在20～120μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=17929709.52x+ 13207.21，r=1.00。見表2、圖2。

表1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

圖2 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 精密度試驗

取化橘紅配方顆粒適量，混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，稱定重量，使用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度并搖勻，得供試液。連續(xù)進樣6針，測定柚皮苷的含量，結(jié)果見表4。

表4 供試品溶液的精密度試驗結(jié)果

結(jié)果表明，符合《中國藥典》2020年版四部 通則0512中規(guī)定的RSD值遠遠小于2.0%的要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗

對照品溶液的制備：取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取化橘紅配方顆粒，混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試液。取對照品溶液、供試品溶液分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h進行測定。結(jié)果見表5。

表5 不同時間測定對照品及供試品中柚皮苷的峰面積值

從表5中數(shù)據(jù)可以看出，柚皮苷在24小時內(nèi)峰面積積分值基本恒定不變。能夠滿足測定所需要時間內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批號化橘紅配方顆粒供試品6份，各約0.10g，精密稱定，分別按前述[含量測定]項下方法操作，測定每份供試品的含量，結(jié)果見表6。

表6 供試品中柚皮苷含量重復(fù)性試驗結(jié)果

結(jié)果表明，供試品在相同的細度、相同的提取溶劑和色譜條件下，重復(fù)性較好。

2.7 加樣回收試驗

取已知含量 (批號：20201034-1，含量為131mg/g)的化橘紅配方顆粒分成6份，混勻研細，取樣品約0.02g，對照品約13.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，各取續(xù)濾液10μl進樣，分別按正文[含量測定]項下的色譜條件測定每份的含量，計算回收率，結(jié)果見表7。

表7 柚皮苷回收試驗結(jié)果

結(jié)果：本方法的平均回收率為96.60 %，符合《中國藥典》2020年版四部 9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則”中“表2 樣品中待測定成分含量和回收率限度”的要求。

2.8 樣品含量測定

取3批化橘紅配方顆粒樣品(批號：20201034-1,20201034-2 ,20201034-3)分別秤取約0.10g，各兩份，精密稱定，按前述[含量測定]項下的方法處理并測定，所得含量測定結(jié)果見表8。

表8 樣品中柚皮苷的含量測定結(jié)果

從表8中的三批樣品含量測定的數(shù)據(jù)可見，化橘紅配方顆粒中含柚皮苷最低含量在130mg/g以上?？紤]不同批次藥材質(zhì)量受各種因素影響含量會有差異，因此我們將化橘紅配方顆粒中的柚皮苷含量下浮30%做參考含量，含量限度為130g×70%=91.0(mg/g)。通過以上試驗論證，我們將化橘紅配方顆粒中柚皮苷含量擬定為每1g化橘紅配方顆粒中含柚皮苷(C27H32O14)不得少于91.0mg。

3 討論

選取甲醇為溶媒，以柚皮苷提取量為考察指標(biāo)，考察方法為： 取化橘紅配方顆粒，混勻，研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

根據(jù)以上試驗結(jié)果，樣品中柚皮苷含量轉(zhuǎn)移率為96.0%(大于95%),基本提取完全，因此本品的提取溶劑和提取方法是可以使用的。