閆亞娟，黃 猛，張 丹，劉慧琳，倫立民△

1.青島大學醫(yī)學部，山東青島266000；2.青島大學附屬醫(yī)院檢驗科，山東青島266000

尿液兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的檢測對嗜鉻細胞瘤的診斷具有重要意義[1-2]。近年來，國內(nèi)外已建立了多種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)用于定量檢測尿液中的兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物[3-6]。這些方法大多留取患者24 h的尿液進行檢測，存在諸多不足之處，如標本用量多、檢測耗時長、標本前處理操作復雜等，限制了兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物檢測的臨床應用。因此，本研究旨在建立一種快速且可同時檢測尿液兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，采用簡單、特異的微量尿樣固相萃取，一次進樣同時檢測尿液中多種兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物，并建立健康成年人群尿液兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的參考區(qū)間，為臨床嗜鉻細胞瘤的診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇青島大學附屬醫(yī)院體檢健康者100例為研究對象，其中男51例，年齡19～65歲；女49例，年齡22～52歲。納入研究對象均同時滿足以下條件：(1)2020年1—7月來青島大學附屬醫(yī)院健康體檢的18～65歲成人；(2)經(jīng)體格檢查未見異常；(3)血常規(guī)、尿常規(guī)、血清生化檢測均未見異常；(4)影像學檢查腎上腺未見異常。納入研究對象排除具有以下任意一項條件者：(1)有嚴重心、肺、肝、腎等器質(zhì)性疾病，身體狀況差；(2)不愿意參與本研究，拒絕簽署知情同意書；(3)既往或目前患有或疑似患有腎上腺疾病。本研究獲得青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有研究對象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Agilent Technologies 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(安捷倫，美國)；QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX，美國)；色譜柱(Agilent Pursuit PFP 2×150 mm)；PWCX 96孔固相萃取板。試劑：標準品腎上腺素(E)鹽酸鹽、去甲腎上腺素(NE)鹽酸鹽、多巴胺(DA)鹽酸鹽、甲氧基腎上腺素(MN)鹽酸鹽、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)鹽酸鹽、3-甲氧酪胺(3-MT)鹽酸鹽、高香草酸(HVA)、香草扁桃酸(VMA)及其對應的同位素內(nèi)標E-d3、NE-d6、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4、HVA-d3、VMA-d3(Sigma，美國)，醋酸銨(北京化工，中國)，乙腈(色譜級，anaqua，美國)，甲醇(色譜級，anaqua，美國)，實驗用水為超純水(18．2 MΩ·cm，25 ℃)，由BureWATER超純水儀制備。尿肌酐檢測采用日立7180全自動生化分析儀，試劑盒購自北京利得曼生化股份有限公司。

1.3方法

1.3.1工作液制備及質(zhì)控品 采用0.2 mol/L的鹽酸溶液配制10 μg/mL的兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的儲備液，并配制成不同濃度的標準品，濃度范圍為0.5～1 000.0 ng/mL。

1.3.2標本采集 囑所有研究對象在研究過程中不食用或飲用任何富含兒茶酚胺的食物及飲料，不服用任何藥物，不進行劇烈運動，并保持日常生活方式，囑其體檢前一天晚上8點后禁食、禁飲，體檢當天清晨6：00采集晨尿，并選擇其中20例志愿者采集24 h尿液，采用6 mmol/L鹽酸防腐，標本于—80 ℃冰箱保存。

1.3.3標本前處理 將標準品、質(zhì)控品及尿液標本取出放置至室溫，并混勻，將96孔固相萃取板預先用甲醇和水各1 mL進行活化和平衡。(1)患者標本：采用0.22 μm尼龍濾膜過濾得到尿濾液，取480 μL，加入20 μL內(nèi)標工作液和1 mL 0.5 mol/L的乙酸銨溶液，渦旋5 s。(2)標準品及質(zhì)控品：取20 μL不同濃度的標準品和質(zhì)控品，加入 460 μL超純水，混勻后分別加入20 μL混合內(nèi)標工作液和1 mL 0.5 mol/L的乙酸銨溶液，渦旋5 s。將尿液標本、標準品及質(zhì)控品分別加入96孔固相萃取板中，之后分別用1 mL 20 mmoL/L的乙酸銨溶液和1 mL甲醇進行洗脫，最后用500 μL的乙腈水溶液進行洗脫，收集洗脫液70 μL至96孔固相萃取板內(nèi)，上機檢測。

1.3.4色譜分析條件 色譜柱柱溫為40 ℃，流速為600 μL/min，流動相A為水(0.1%甲酸)，流動相B為乙腈(0.1%甲酸)，梯度洗脫程序為0 min，5%B；2.5 min，50%B；3.0 min，95%B；3.5 min，5%B；5.0 min，5%B。

1.3.5質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子 MRM 掃描分析，使用氣體為高純氮氣，離子源電壓為5 500 V，脫溶劑氣溫度為500 ℃，氣簾氣為25 psi，霧化氣(GS1)為60 psi，輔助加熱氣(GS2)為55 psi，碰撞氣(CAD)為medium，取上清液上機檢測，每次進樣量15 μL，其他部分質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

1.4方法驗證

1.4.1檢出限(LOD)及定量下限(LOQ) 用標準曲線的最低濃度連續(xù)重復檢測10次，可計算出LOD和LOQ，公式如下，LOD=3×SD/Slope,LOQ=10×SD/Slope。其中SD為這10次最低濃度的響應標準差，Slope為校準曲線的斜率。

1.4.2線性評估和標準曲線的建立 使用不同濃度的標準品，每個濃度重復檢測3次，對6種分析物分別建立多元回歸方程進行線性評估，分別記錄6種分析物的線性方程和相關系數(shù)。

表1 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

1.4.3精密度 取5例體檢健康者的尿液標本分成3等份，分別加入高、中、低3個濃度的標準品，每個濃度每天重復檢測5次，連續(xù)檢測3 d，用重復檢測的變異系數(shù)(CV)表示精密度。

1.4.4準確度 用回收實驗進行評估，取5例體檢健康者的尿液標本分成3等份，檢測目的分析物濃度后，分別加入高、中、低3個濃度的標準品，檢測加入標準品后的濃度。檢測值應在理論值的±15%以內(nèi)，低濃度點在理論值的±20%以內(nèi)。準確度=尿液標本加入標準品后測定的濃度/樣品中內(nèi)源性分析物與加入標準品濃度之和。

1.4.5基質(zhì)效應 尿樣和空白溶劑用相同的固相萃取程序處理，取5例體檢健康者的尿液標本分成3等份，檢測目的分析物濃度后，分別加入高、中、低3個濃度的標準品，檢測加入標準品后的濃度，比值應為0.85～1.15。基質(zhì)效應=(本底加入標準品后的目的分析物濃度—本底中目的分析濃度)/溶劑中目的分析物濃度。

1.4.6穩(wěn)定性 取10例體檢健康者的尿液標本，分成5等份，1份立即檢測，1份室溫下放置24 h后檢測，1份于4 ℃冰箱中保存24 h后檢測，1份于4 ℃冰箱中保存48 h后檢測，1份于—80 ℃冰箱中保存7 d后檢測。分別分析標本在室溫及4 ℃冰箱的短期穩(wěn)定性及—80 ℃長期保存的穩(wěn)定性。一般認為濃度變化<15%時分析物是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性(%)=(放置后檢測的濃度—立即檢測的濃度)/立即檢測的濃度。

1.5臨床應用

1.5.1晨尿檢測兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的有效性 分析晨尿與24 h尿液收集這兩種不同采樣方法之間檢測結(jié)果的相關性，選擇20例研究對象，收集其晨尿及24 h尿液，根據(jù)肌酐輸出值對稀釋差異進行歸一化，表示為分析物與肌酐的比值(μg/g Cr)。

1.5.2參考區(qū)間 采用建立的方法檢測100例研究對象晨尿中各種兒茶酚胺及代謝產(chǎn)物，每種分析物的尿排泄量以其濃度與肌酐濃度的比值表示，單位為μg/g Cr。

1.6統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)處理和量化均采用AB-SCIEX公司的Analyst 1.6.1軟件包進行，使用SPSS26.0進行其他統(tǒng)計分析。采用K-S正態(tài)性檢驗對檢測結(jié)果進行正態(tài)性檢驗，由于6種目的分析物均呈非正態(tài)分布，因此參考區(qū)間采用P2.5和P97.5分別作為下限值、上限值，采用Pearson相關和Logistic線性回歸分析評價晨尿與24 h尿分析物的相關性。

2 結(jié) 果

2.1LOD、LOQ和線性評估 LC-MS/MS檢測各種兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的LOD和LOQ，在相應的濃度范圍內(nèi)，比較各種分析物濃度及其響應的線性和二次多項式回歸，經(jīng)1/x加權擬合的二次多項式回歸顯示，線性評估決定系數(shù)(r2)均>0.99，且標準偏差均較小，因此所有6種分析物均采用1/x加權的二次多項式回歸。每種分析物的LOD、LOQ和線性參數(shù)見表2。

表2 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的LOD、LOQ和線性參數(shù)

2.2精密度 LC-MS/MS 檢測6種分析物在3種濃度下的重復性均較好，批內(nèi)精密度和總精密度為1.1%～8.5%，均能滿足臨床檢測要求，見表3。

表3 LC-MS/MS檢測兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的精密度

2.3準確度和基質(zhì)效應 6種兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的準確度為97.2%～108.5%，s均在10%以內(nèi)，均符合檢測值應該在靶值的±15%以內(nèi)的標準，見表4。6種分析物的基質(zhì)效應為93.7%～108.5%，基質(zhì)效應的CV為3.4%～7.3%，符合基質(zhì)效應的CV應小于15%的標準，見表4。

表4 LC-MS/MS檢測兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的準確度和基質(zhì)效應

2.4穩(wěn)定性 不同情況下尿液標本中兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性，見表5。穩(wěn)定性均較好，所有目的分析物濃度變化均≤6.2%。

表5 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性(%)

2.5臨床應用

2.5.1晨尿檢測兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的有效性 晨尿與24 h尿液收集這兩種采樣方法之間所有的分析物檢測結(jié)果呈正相關(n=20，P<0.000 1，r：0.93～0.97，斜率：0.52～1.05)。晨尿與24 h尿兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的相關性結(jié)果如下：NE線性回歸分析斜率為0.683，r=0.952，P<0.000 1；E線性回歸分析斜率為0.522，r=0.905，P<0.000 1；DA線性回歸分析斜率為0.941，r=0.964，P<0.000 1；3-MT線性回歸分析斜率為0.980，r=0.963，P<0.000 1；NMN線性回歸分析斜率為0.622，r=0.937，P<0.000 1；MN線性回歸分析斜率為1.050；r=0.969，P<0.000 1。

2.5.2參考區(qū)間 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果箱形圖見圖1，取P2.5和P97.5建立參考區(qū)間，參考區(qū)間NE為2.6～140.4 μg/g Cr，E為0.3～37.2 μg/g Cr，DA為43.4～561.8 μg/g Cr，3-MT為18.0～165.7 μg/g Cr，NMN為15.1～241.5 μg/g Cr，MN為6.8～192.0 μg/g Cr。

圖1 100例健康體檢者兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果箱式圖

3 討 論

嗜鉻細胞瘤是一種罕見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，起源于腎上腺髓質(zhì)細胞，發(fā)病率約為0.05%[7]。嗜鉻細胞瘤可大量釋放兒茶酚胺，因此患者可出現(xiàn)各種嚴重的并發(fā)癥，如果不能盡早診斷和治療，會導致致命的后果[8-10]。兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的聯(lián)合檢測可提高對嗜鉻細胞瘤診斷的敏感性和選擇性，可輔助診斷僅分泌DA的特殊類型嗜鉻細胞瘤，對不同生化表型嗜鉻細胞瘤的鑒別也發(fā)揮著重要作用[11-12]。臨床通常通過檢測尿液或血漿中的兒茶酚胺對疑似嗜鉻細胞瘤患者進行篩查。然而，由于兒茶酚胺在體液中水平極低、極性高，使其準確檢測十分困難[13]。另一方面，血漿兒茶酚胺水平很低，受試者采集標本時的姿勢對檢測結(jié)果影響很大，準確檢測采集條件要求高，如不能充分滿足采集條件則不能達到臨床檢測性能要求[14]。24 h尿液采集繁瑣，收集過程非常耗時且容易出錯，與其相比，晨尿的留取更加方便，并且利用了與夜間臥床休息時交感腎上腺系統(tǒng)活性降低的優(yōu)勢，避免了較多原因造成的交感腎上腺系統(tǒng)的激活，可以提高診斷性能[15-16]。

目前，用于兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物檢測的常用方法有酶免疫檢測法、液相色譜電化學分析法、LC-MS/MS。LC-MS/MS較前兩者具有諸多優(yōu)勢，與酶免疫檢測法相比，LC-MS/MS的靈敏度和特異度更高，前處理時間更短，并且能夠準確檢測前者無法檢測的3-MT；與液相色譜電化學分析法相比，LC-MS/MS采樣更便捷，標本前處理更簡單，并且能夠避免前者在分析時無法避免的干擾。本研究建立了檢測晨尿兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的UPLC-MS/MS，該方法具有簡單、快速、靈敏度高、選擇性高的優(yōu)點，用晨尿標本代替24 h尿液收集進行檢測，使標本采集更加簡單方便，簡化了pH值調(diào)節(jié)過程，并獲得了更高的萃取效率，優(yōu)化了梯度洗脫程序，在較短的運行時間內(nèi)將潛在的干擾降至最低，并能獲得較好的分離效果。

本研究建立了一種簡單、快速，同時檢測尿兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的UPLS-MS/MS,并且進行了方法評價。這種方法采用晨尿標本替代24 h尿液收集，標本采集更加簡單、方便。良好的驗證數(shù)據(jù)和對實際尿樣檢測的成功應用表明，該方法靈敏、特異、可靠，可用于兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物排泄量的監(jiān)測和嗜鉻細胞瘤的鑒別及輔助診斷。