王 娟 程 龍 李文靜 胡育龍 曾 瑾 李 敏 高蔚豐 李 勇

（寧夏大學(xué)西部生物資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，銀川750021）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種慢性、消耗性人獸共患傳染病，由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）單一傳染性病原體感染引起［1］。目前TB已成為全球十大死因之一，死亡率高于包括HIV在內(nèi)的單一傳染?。?］。我國每年TB新發(fā)病例約為90萬，是全球第三大TB高負(fù)擔(dān)國家［3］。根據(jù)疾病預(yù)防控制局發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，2018年我國現(xiàn)有肺結(jié)核患者82.33萬例，死亡病例3 149例，報告發(fā)病率和報告死亡率均位居乙類傳染病第二。對于細(xì)菌感染性TB臨床常采用抗生素治療，但常伴有MTB耐藥問題［4］。目前臨床治療肺結(jié)核主要采用抗生素組合療法，但多種抗生素長期使用導(dǎo)致機(jī)體免疫相關(guān)細(xì)胞相互作用，進(jìn)而影響機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)［5］。

MTB是典型的胞內(nèi)寄生菌，肺泡巨噬細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，在感染過程中通過吞噬、抗原提呈和分泌多種細(xì)胞因子等功能調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)［6］。由于感染巨噬細(xì)胞的能力對細(xì)菌在宿主體內(nèi)的傳播和擴(kuò)散至關(guān)重要，既往抗結(jié)核免疫機(jī)理研究中，結(jié)核菌與肺泡巨噬細(xì)胞的相互作用一直是研究重點和熱點［7］。但近年研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial typeⅡcells，AECⅡ）與巨噬細(xì)胞類似，也是MTB感染的主要靶細(xì)胞，是由呼吸道吸入TB病原菌最先感染的細(xì)胞［8］。AECⅡ細(xì)胞不僅可通過Toll樣受體家族（TLRs）、表面活性蛋白（SPs）和Dectin-1等調(diào)控宿主先天免疫反應(yīng)，抵御外源病原菌，并可產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子和細(xì)胞因子等激活獲得性免疫反應(yīng)，募集和活化吞噬細(xì)胞至感染部位清除病原菌，是阻止結(jié)核菌入侵宿主的第一道細(xì)胞防線，在抗MTB感染免疫調(diào)節(jié)中的作用備受關(guān)注［9-10］。

目前臨床常用抗結(jié)核藥物主要有一線抗結(jié)核藥物、二線抗結(jié)核藥物、新型抗結(jié)核藥物及固定劑量復(fù)方制劑［11］。一線抗結(jié)核藥物主要包括異煙肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampin，RFP）等，抗菌活性強(qiáng)、副作用少［12］；二線類藥物包括喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、對氨基水楊酸（para-aminosalicylic acid，PAS）類等，用于治療一線類藥物不耐受及耐藥性TB患者［11］。近年體內(nèi)和體外試驗證實，部分抗結(jié)核藥物不僅具有殺菌作用，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，如大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化和提高免疫細(xì)胞功能增強(qiáng)機(jī)體防御能力［13］；INH可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶活性及吞噬能力［14］；RFP在體外可強(qiáng)烈抑制由有絲分裂原和特異性抗原誘導(dǎo)的致敏和非致敏小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且與濃度及時間呈正相關(guān)［15］。但抗結(jié)核藥物應(yīng)用過程中會出現(xiàn)過敏反應(yīng)、血液系統(tǒng)毒性等不良反應(yīng)，是否會對機(jī)體免疫相關(guān)細(xì)胞的免疫功能，尤其是抗結(jié)核先天免疫調(diào)控功能產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究［16］。因此，本研究采用不同濃度的一線抗結(jié)核藥RFP、INH和二線抗結(jié)核藥硫酸阿米卡星（amikacin sulfate，AMK）、PAS處理AECⅡA549細(xì)胞，分析不同抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞中TLRs信號通路信號分子和炎癥因子表達(dá)的影響，探討抗結(jié)核藥物對AECⅡ抗結(jié)核先天免疫功能的影響，為臨床TB治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用重點實驗室保存提供；RFP注射液購自沈陽雙鼎制藥有限公司；INH注射液購自天津金耀藥業(yè)有限公司；AMK注射液購自蘇州第壹制藥有限公司；PAS粉針劑購自貴州光正制藥有限責(zé)任公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自南京凱基生物；一抗TLR2（CST#12276）、NF-κB p50（CST#135 86）和MyD88（CST#4283）購自Cell signal technology公司；一抗β-actin（TA-09）和二抗羊抗兔IgG-HRP（ZB-2301）購自北京中杉金橋；Plus-ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國PerkinElmer；人IL-8和IL-12 p70購自美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞接種于含10%FBS和青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 給藥方式及分組 A549細(xì)胞以4×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至細(xì)胞密度達(dá)到60%時，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。參考各抗生素說明中的血藥代謝濃度分組：Control組（只加等量溶劑）、不同濃度RFP組（1.00、5.00、10.54μg/ml），不同濃度INH組（1.00、5.00、10.00μg/ml），不同濃度AMK組（2.00、16.00、33.38μg/ml），不同濃度PAS組（10.00、100.00、213.00μg/ml）。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取和cDNA合成 胰蛋白酶消化處理24 h的各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入TRIzol，按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系20μl：總RNA 5μg，Oligo（dT）181.0μl，2×TSReaction Mix 10μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1.0μl，gDNA Remover 1.0μl，添 加RNase-free Water至20μl，42℃15min，85℃5s終止反應(yīng)。

1.2.4 qRT-PCR 檢測根據(jù)人TLR2、TLR4、NFκB、MyD88、IL-6、IL-8、IL-12A基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參并設(shè)計引物，引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系20μl：cDNA 1.0μl，上下游引物（10μmol/L）1.0μl，2×Tip Green qPCRSuperMix 10μl，H2O 7μl。Quant Studio 5熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60.8℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)，2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 Western blot 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)不同蛋白相對分子質(zhì)量大小配制不同濃度SDS-PAGE凝膠，取相同量蛋白樣品進(jìn)行電泳（恒壓80 V），轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，恒流300 mA）；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h，加入一抗4℃孵育過夜，次日洗膜，加入二抗孵育，洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光并采用化學(xué)發(fā)光檢測儀成像。

1.2.6 IL-8及IL-12 ELISA檢測 收集各組培養(yǎng)細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，Graph Pad Prism7.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取 A549細(xì)胞為貼壁生長的上皮細(xì)胞，為多角形，形態(tài)隨密度變化略有差異。本實驗選取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗（圖1）。提取各實驗組處理24 h后的A549細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2，各組28 S rRNA、18 S rRNA和5 S rRNA條帶完整，且RNA純度（A260/A280）為1.9～2.1，符合后續(xù)實驗要求。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

2.2 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞TLRs信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響 RFP各濃度組TLR2和TLR4受體mRNA表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），且均隨濃度增加而升高。各組下游接頭分子MyD88表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)錄因子NF-κBmRNA表達(dá)僅在RFP濃度為10.54μg/ml時顯著降低（P＜0.05），其余濃度RFP對NF-κB表達(dá)影響無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A），提示RFP雖誘導(dǎo)較高水平的TLR2、TLR4表達(dá)，但MyD88、NF-κB表達(dá)并未被激活，反而受到抑制，總體表現(xiàn)為對TLRs信號通路的抑制作用。INH各劑量組TLR2、TLR4表達(dá)與對照組差異顯著（P＜0.01），TLR2表達(dá)與濃度呈負(fù)相關(guān)；MyD88、NF-κB表達(dá)變化與TLR2類似，與濃度呈負(fù)相關(guān)，其中INH濃度為10.00μg/ml時，MyD88表達(dá)明顯降低，NF-κB表達(dá)在INH濃度為1.00μg/ml時顯著升高（P＜0.05，圖3B），提示INH可抑制A549細(xì)胞TLR2信號通路。AMK各組A549細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)顯著升高（P＜0.05），2.00μg/ml升高最為顯著，且NF-κBmRNA表達(dá)僅在AMK濃度為2.00μg/ml時顯著提高（P＜0.05），但AMK處理對MyD88表達(dá)無顯著影響（圖3C），表明隨濃度增加，AMK對TLR2、TLR4信號通路的活化作用逐漸減弱。PAS可顯著提高TLR2、TLR4表達(dá)，且呈一定的濃度依賴性；MyD88和NF-κB表達(dá)僅在PAS濃度為100.00μg/ml時顯著降低（P＜0.05，圖3D）。

圖1 A549細(xì)胞生長狀態(tài)（×100）Fig.1 Growth status of A549 cells（×100）

圖2 提取的A549細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Gel electrophoresis of total RNA extracted from A549 cell

2.3 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞TLRs信號通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響 TLR2、MyD88和NF-κB p50蛋白表達(dá)在RFP濃度為1.00μg/ml、5.00μg/ml時均有一定增加，其中5.00μg/ml RFP組TLR2表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)RFP濃度達(dá)到10.54μg/ml時，3種蛋白表達(dá)水平基本與對照組相同，NF-κBp50表達(dá)有所下調(diào)，說明高濃度RFP處理對A549細(xì)胞中TLR2信號通路有抑制作用（圖4）。INH對A549細(xì)胞中TLR2和MyD88表達(dá)的影響具有一致性，但對NF-κB p50表達(dá)的影響卻與前兩者正好相反（圖4B），表明INH可能通過其他途徑實現(xiàn)對NF-κBp50的活化。2.00μg/ml AMK處理顯著降低TLR2、MyD88表達(dá)（P＜0.05），但隨著AMK濃度增加，兩種蛋白表達(dá)均有所提高；各濃度組NF-κB p50表達(dá)與對照組相比都有一定上調(diào)（圖4C），提示AMK可激活A(yù)549細(xì)胞中TLR2信號通路。TLR2、MyD88表達(dá)在PAS各濃度組均高于對照組，NF-κB p50表達(dá)隨PAS濃度增加而升高，說明PAS可活化A549細(xì)胞中TLR2信號通路（圖4D）。

圖3 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞TLRs信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of anti-tuberculosis drugs on mRNA expression of signal molecules in TLRs signaling pathway in A549 cells

2.4 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞IL-8、IL-12amRNA表達(dá)的影響 隨RFP處理濃度增加，IL-8表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義，IL-12amRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），3個濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A）。INH各濃度組IL-8、IL-12a表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），5.00μg/ml時變化最為顯著（圖5B）。AMK處理對IL-8表達(dá)無顯著影響，但各實驗組IL-8表達(dá)與濃度呈負(fù)相關(guān)，僅2.00μg/ml AMK處理對IL-12amRNA表達(dá)有顯著上調(diào)作用（P＜0.05），其余2組IL-12a表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義。AMK各濃度組IL-12a表達(dá)同樣與濃度呈負(fù)相關(guān)（圖5C），僅100.00μg/ml PAS組A549細(xì)胞IL-8、IL-12amRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖5D），表明4種抗結(jié)核藥物作用于A549細(xì)胞后，僅RFP對炎癥因子IL-12a表達(dá)有抑制作用，其余各抗結(jié)核藥物對炎癥因子IL-8和IL-12amRNA表達(dá)影響無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 ELISA法測定IL-8、IL-12含量 隨RFP濃度增加，IL-8含量下降；與對照組相比，1.00μg/ml RFP組IL-12含量顯著升高（P＜0.05），而5.00μg/ml RFP組IL-12含量卻顯著降低（P＜0.05），10.54μg/ml RFP組IL-12含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義（圖6A），表明RFP在一定程度上抑制A549細(xì)胞中IL-8、IL-12產(chǎn)生。INH可不同程度提高IL-8及IL-12含量，5.00μg/ml時作用最強(qiáng)（P＜0.05，圖6B）。AMK處理A549細(xì)胞，IL-8含量在2.00μg/ml、16.00μg/ml時顯著增加（P＜0.01），33.38μg/ml AMK組IL-8含量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)AMK濃度為2.00μg/ml時，IL-12含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義，AMK濃度為16.00μg/ml、33.38μg/ml時，IL-12含量顯著降低（P＜0.01，圖6C），提示AMK對A549細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制作用具有劑量依賴性。與對照組相比，PAS各濃度組A549細(xì)胞IL-8、IL-12含量明顯上升（P＜0.01），IL-12含量與劑量呈負(fù)相關(guān)（圖6D）。

圖4 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞中TLRs信號通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of anti-tuberculosis drugs on protein expressions of signal molecules in TLRs signaling pathway in A549 cells

圖5 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞IL-8、IL-12a mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of anti-tuberculosis drugs on expressions of IL-8 and IL-12a mRNA of A549 cells

圖6 抗結(jié)核藥物對A549細(xì)胞IL-8、IL-12分泌的影響Fig.6 Effect of anti-tuberculosis drugs on IL-8 and IL-12 production in A549 cells

3 討論

近年耐藥尤其是耐多藥TB流行呈逐年上升趨勢，而結(jié)核藥物研發(fā)相對較慢，導(dǎo)致TB治療形勢日趨嚴(yán)峻。隨著研究深入，除對現(xiàn)有抗結(jié)核藥物的抗菌機(jī)制有了更全面透徹地認(rèn)識外，還發(fā)現(xiàn)部分抗結(jié)核藥物具有免疫調(diào)節(jié)作用?？菇Y(jié)核藥物的免疫調(diào)節(jié)作用呈雙向性，部分藥物可改善宿主免疫功能，協(xié)同抗菌作用，但部分藥物卻表現(xiàn)出免疫抑制效應(yīng)［17］。因此，深入了解抗結(jié)核藥物的免疫調(diào)節(jié)作用，與抗菌活性相結(jié)合，將為TB臨床治療提供理論參考。課題組研究了具有代表性的一線抗結(jié)核藥物RFP、INH及二線抗結(jié)核藥物AMK、PAS對A549細(xì)胞TLRs通路相關(guān)信號分子和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，其中，RFP是利福霉素衍生物，是最有效的抗結(jié)核抗生素之一［15］；INH抗菌活性較強(qiáng)，可有效殺滅細(xì)胞內(nèi)外MTB，是目前TB治療的首選藥物［12］；AMK常與INH、RFP等聯(lián)用，是肺結(jié)核治療的二線注射首選藥物［18］；PAS是繼鏈霉素之后發(fā)現(xiàn)的第二種TB治療藥物。

TLRs是由先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白，與機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，在機(jī)體抵抗病原微生物免疫反應(yīng)中扮演重要角色［19-21］。機(jī)體感染MTB后會激活TLRs信號通路，TLR2、TLR4和TLR9是機(jī)體抗MTB的主要炎癥受體［21］?；罨腡LRs可促進(jìn)炎癥因子、趨化因子、黏附分子及其受體等多種靶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)［22］。既往研究表明，AECⅡ通過TLR2/TLR4二聚體識別MTB［23］。本試驗qRT-PCR結(jié)果也顯示TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)變化趨勢基本一致。本研究采用RFP處理AECⅡ，當(dāng)濃度達(dá)為10.54μg/ml時，可抑制A549細(xì)胞TLRs受體信號通路活化。INH干預(yù)雖對A549細(xì)胞TLR2和MyD88表達(dá)的影響一致，但對NF-κB表達(dá)的影響與前兩者相反，即TLR2和MyD88表達(dá)降低的同時NF-κB表達(dá)升高，表明INH抑制TLR2信號通路的同時，可經(jīng)TLR4通過MyD88非依賴性通路活化NF-κB。MyD88非依賴通路可調(diào)控樹突狀細(xì)胞成熟及免疫調(diào)節(jié)因子（如MHC、CD4+等）表達(dá)調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)［21］。因此，INH可能具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，與既往研究結(jié)論一致。INH可通過提高大鼠外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值有效增強(qiáng)免疫功能［24］。毛澤善等［14］發(fā)現(xiàn)INH可增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能。兩種二線抗結(jié)核藥物AMK、PAS均可上調(diào)TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB表達(dá)，表明AMK、PAS可激活A(yù)549細(xì)胞TLR2、TLR4信號通路。

炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平可反映局部炎癥損傷程度。適量細(xì)胞因子分泌有利于機(jī)體清除病原體，但過度分泌可能導(dǎo)致炎癥失控及加重局部組織損傷［25］。IL-8是趨化性細(xì)胞因子，其主要功能是趨化中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞至感染部位吞噬、殺傷病原菌，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，引發(fā)呼吸爆發(fā)等；此外，炎癥反應(yīng)早期始發(fā)因子通過激活其他炎癥細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)［26］。IL-8參與慢性支氣管炎、胃潰瘍、胰腺炎等炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程中，在感染控制及病理損傷形成中起重要作用。IL-12作為一種多功能細(xì)胞因子，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一，在機(jī)體抗MTB感染過程中，可誘導(dǎo)Th0向Th1分化，并維持Th1效應(yīng)功能，刺激NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增殖并提高其靶細(xì)胞殺傷活性，此外還是IFN-γ分泌的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，是天然免疫和獲得免疫的調(diào)節(jié)因子［27-33］。從炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和分泌情況來看，隨RFP濃度增加，IL-8、IL-12表達(dá)、分泌均有一定程度的降低，對IL-12的影響最為顯著。表明RFP可通過抑制TLRs信號通路降低炎癥因子表達(dá)，具有免疫抑制功能，與RFP可有效降低復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者機(jī)體TNF-α、CRP、IL-6、IL-10等炎癥因子水平、促進(jìn)機(jī)體免疫功能恢復(fù)的研究結(jié)論一致［34］。因此，RFP在減輕局部炎癥反應(yīng)強(qiáng)度、減輕組織損傷方面起重要作用。INH可不同程度提高IL-8及IL-12表達(dá)與分泌，5.00μg/ml時效果最強(qiáng)，說明INH具有免疫激活作用。感染引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，適當(dāng)調(diào)節(jié)可協(xié)助機(jī)體殺滅MTB，調(diào)節(jié)不當(dāng)則會導(dǎo)致機(jī)體組織損傷［33］。因此，采用INH治療TB時，為減輕炎癥反應(yīng)，可與具有抑制炎癥因子表達(dá)作用的抗結(jié)核藥物聯(lián)用，也從免疫調(diào)節(jié)作用的角度，解釋了為何INH與RFP聯(lián)用是目前公認(rèn)的最佳治療方法。隨AMK濃度增加，IL-8、IL-12 mRNA表達(dá)及分泌先升高后降低，說明AMK在激活TLRs信號通路促進(jìn)IL-8、IL-12產(chǎn)生的同時，還通過其他途徑調(diào)控炎癥因子表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，即AMK存在免疫激活和免疫抑制兩方面作用。AMK為第三代氨基糖苷類抗生素，關(guān)于氨基糖苷類抗生素免疫調(diào)節(jié)作用的報道存在免疫激活和免疫抑制兩方面，如慶大霉素既可抑制CD3+、CD56+、CD8+等免疫細(xì)胞數(shù)量，起免疫抑制作用，又可通過抑制中性粒細(xì)胞的凋亡提高機(jī)體免疫功能［35-36］。蔡少華等［37］研究證實AMK具有免疫抑制作用，但AMK通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制炎癥因子合成有待進(jìn)一步研究。PAS可促進(jìn)IL-8和IL-12表達(dá)與分泌，具有免疫激活功能，但隨濃度增加，免疫激活作用減弱，IL-12含量降低，提示PAS的免疫調(diào)節(jié)作用可能具有多重性。PAS為磺胺類抗菌藥物及其增效劑，磺胺類藥物屬于抑制免疫功能的抗菌藥物，但多呈現(xiàn)出對中性粒細(xì)胞吞噬作用的抑制作用，如在炎癥性腸病研究中發(fā)現(xiàn)PAS對黏膜IL-1β合成與釋放無影響［38］。本研究中PAS呈現(xiàn)免疫激活作用。目前對PAS的研究較少，其對機(jī)體免疫功能的影響及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，4種抗結(jié)核藥物對AECⅡA549細(xì)胞的免疫功能具有一定影響。RFP通過抑制TLRs信號通路降低炎癥因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)；INH可通過激活MyD88非依賴性通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)及增強(qiáng)免疫功能；AMK在激活TLRs通路的同時，又通過其他通路抑制炎癥因子表達(dá)，呈現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)功能的多重性；PAS可激活TLRs信號通路促進(jìn)IL-8、IL-12表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞免疫應(yīng)答，為TB臨床治療提供了理論參考。