陰育紅 金 鑫 王國(guó)輝（佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，佳木斯154002）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢(shì)反射障礙為主［1］。目前較多的研究證明PD的發(fā)病與免疫有關(guān)，表現(xiàn)為黑質(zhì)中大量組織相容性糖蛋白小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)［2-3］。而PD患者外周血中細(xì)胞免疫和體液免疫也存在異常，目前，PD中的免疫異常究竟是原發(fā)還是繼發(fā)尚不明確。細(xì)胞免疫中存在細(xì)胞毒類(lèi)T細(xì)胞、B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，在既往研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)輔助性T細(xì)胞亞群在PD外周血中水平異常，且與炎癥反應(yīng)有關(guān)［4-5］。濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）是一種新型輔助性T細(xì)胞亞群，在B細(xì)胞的增殖、分化中具有重要作用，而Tfh水平與自身免疫性疾病和免疫異常疾病有關(guān)。有研究報(bào)道在自身免疫性疾病中Tfh扮演重要的推手作用，尤其是強(qiáng)直型脊柱炎活動(dòng)期存在高水平的Tfh［6-7］。本研究以PD免疫失調(diào)為根據(jù)，主要研究在PD患者外周血中Tfh的水平與相關(guān)的激動(dòng)B細(xì)胞、細(xì)胞因子的表達(dá)水平，探究Tfh在PD發(fā)病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇2016年1月至2017年12月于我院神經(jīng)內(nèi)科就診并確診為PD的患者73例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016版中國(guó)PD診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；②患者未患有感染性疾病，外周血生物指標(biāo)檢查未見(jiàn)炎性指標(biāo)異常；③患者自愿入組，依從性良好；④無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者具有腦卒中、腦外傷、腦膜炎病史；②患者入院時(shí)具有感染性疾病，外周血生物指標(biāo)檢查中炎性指標(biāo)異常；③患者有癡呆伴記憶力、語(yǔ)言、行為障礙；④無(wú)法配合檢查和治療。在最終入組的73例中，包括男性45例，女性28例。年齡55～82歲，平均年齡（65.3±5.3）歲，病程1～8年。按照Hoehn-Yahr分期法分為Ⅰ期22例、Ⅱ期24例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例，Ⅴ期0例。選擇同期的健康志愿者20例（control組），其中男性12例，女性8例，年齡45～75歲，平均年齡（58.3±6.3）歲，身體情況良好。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 主要試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物高科有限公司）；FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS、PE-CD19、FITC-CD83流式抗體（美國(guó)eBio-Science公司）；BCA試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；ELISA試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；TRIzol試劑（BioTeKe公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Sinobio公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周單個(gè)核細(xì)胞的提取所有受試患者及健康志愿者均禁食12 h后抽取肘靜脈外周血5 ml，置于EDTA抗凝管，1 h內(nèi)提取單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。具體方法為：無(wú)菌條件下以1 500 r/min離心外周血15 min，棄去上層血清，在血細(xì)胞沉淀中加入生理鹽水15 ml，均勻吹打后加入10 ml人淋巴細(xì)胞分離液，300 r/min離心30 min，小心吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至干凈無(wú)菌管，1 500 r/min離心10 min，PBS清洗2次后備用，待檢測(cè)。

1.2.2 單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Tfh和激活B細(xì)胞比例的檢測(cè) 將得到的單個(gè)核細(xì)胞隨機(jī)分為2份，其中1份進(jìn)行CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞檢測(cè)，在PBMC加入FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS的 流 式 抗體 各10μl，充分混合后，避光孵育20 min，加入流式洗滌液2 ml混勻后，PBS清洗2次后上機(jī)檢測(cè)；另1份PBMC檢測(cè)CD83+CD19+激活B細(xì)胞，加入PE-CD19、FITC-CD83的流式抗體避光孵育20 min后，加入裂解液混勻后避光15 min，PBS清洗2次后上機(jī)檢測(cè)。標(biāo)本同時(shí)使用同型對(duì)照。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清IL-21的表達(dá) 收集提取的單個(gè)核細(xì)胞血清，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，調(diào)整濃度后，參照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 收集PBMC細(xì)胞，PBS清洗2～3次后加入1 ml TRIzol試劑裂解15 min，加入三氯甲烷1 ml，低溫下12 000 r/min離心15 min，加入等體積異丙醇混合后，靜置10 min，低溫下12 000 r/min離心15 min后取沉淀，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度（吸光度0.8～1.0），按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC中Tfh和激活B細(xì)胞水平的檢測(cè)結(jié)果PD患者外周血中Tfh細(xì)胞比例［（3.20±0.41）%］和B細(xì)胞比例［（3.69±0.58）%］顯著高于健康人外周血［（1.02±0.18）%、（1.17±0.21）%，P=0.000，0.000，t=8.124，6.547 2］，且Tfh和B細(xì)胞比例具有相關(guān)性（r=0.638，P=0.000）。而PD患者Ⅰ期～Ⅳ期外 周 血 中Tfh的 比 例 為（1.35±0.52）%、（2.65±0.33）%、（4.52±0.62）%和（5.95±0.68）%，與健康人相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=4.125、6.854、10.334、13.142）；B細(xì)胞比例為（2.08±0.55）%、（3.18±0.23）%、（4.96±0.58）%和（6.03±0.66）%，與健康人相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=5.982、8.214、10.224、15.214）。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

圖1 外周血PBMC中Tfh和激活B細(xì)胞Fig.1 Tfh and activated B cells in PBMC of peripheralblood

圖2 Tfh細(xì)胞和激活B細(xì)胞在PD分期中的水平Fig.2 Levels of Tfh cells and activated B cells in staging of PD

2.2 PD患者外周血中IL-21的表達(dá)水平 Control組外周血中IL-21水平為（12.52±2.11）pg/ml，PD組外周血中IL-21水平為（19.31±2.87）pg/ml，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，t=9.362）。而在PD分期中，IL-21的水平隨分期增高而增高，相比control組差 異 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=6.542、8.241、11.346、15.213）。見(jiàn)圖3。

2.3 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 Control組外周血中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平分別為（0.18±0.03）、（0.23±0.05）、（0.20±0.04），低于PD患 者 外 周 血 的（0.36±0.06）、（0.48±0.05）、（0.51±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000、0.000、0.000、t=8.357、9.134、12.521）。且隨著分期增高，Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平顯著增高。見(jiàn)圖4。

圖3 外周血中IL-21的表達(dá)水平Fig.3 Expression of IL-21 in peripheral blood

圖4 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平Fig.4 mRNA levels of Bcl-6，IL-21 and IL-4 in PBMC

3 討論

PD是一種中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine in substantia nigra，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、缺失、死亡的疾?。?］。目前氧化應(yīng)激損害、鈣離子細(xì)胞毒性作用及興奮性氨基酸毒性是DA能神經(jīng)元凋亡的主要學(xué)說(shuō)，也是導(dǎo)致PD的主要原因［10］。但這些學(xué)說(shuō)還無(wú)法完全揭示DA能神經(jīng)元的損害，可能還有其他因素參與，因此近年來(lái)PD與免疫的關(guān)系逐漸被揭示。T淋巴細(xì)胞是主要的細(xì)胞免疫功能細(xì)胞，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PD患者外周血中存在T淋巴細(xì)胞亞群的改變，其中CD4+CD25+T細(xì)胞比例下降，而記憶T細(xì)胞比例增高，且γδ+T細(xì)胞顯著增高。由于CD4+CD25+T細(xì)胞和γδ+T細(xì)胞對(duì)于免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要作用，二者的比例失調(diào)可導(dǎo)致免疫功能的失調(diào)［11-12］。Tfh是一種負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群，可以特異性表達(dá)CD40、誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子（ICOS）、CXCR5、BCl-6，分泌IL-21，在刺激B細(xì)胞增殖、分化及免疫球蛋白的轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13-15］。有研究表明，IL-21的缺失可導(dǎo)致Tfh水平下調(diào)，IL-21是Tfh產(chǎn)生和功能執(zhí)行的關(guān)鍵因子，通過(guò)直接作用Tfh或間接作用Bcl-6等調(diào)節(jié)Tfh的分化，IL-21還可通過(guò)上調(diào)CXCR5表達(dá)促進(jìn)Tfh向B淋巴濾泡遷移，促進(jìn)B細(xì)胞的激活和增殖［16］。根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，Tfh和自身免疫疾病密切相關(guān)。對(duì)AIRE的研究中發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血中CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例顯著增高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，ICOS介導(dǎo)淋巴細(xì)胞共刺激對(duì)誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生AchR和發(fā)生EAMG非常重要［17］。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究中發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞的活化依賴(lài)于Tfh的介導(dǎo)，其中ICOS途徑可增強(qiáng)Tfh的細(xì)胞功能，CXCL3和IL-21可作為促炎因子提高機(jī)體炎癥水平，尤其是活動(dòng)期系統(tǒng)性紅斑狼瘡，其IL-21的水平顯著高于靜止期［18］。在炎癥性腸病的發(fā)病中發(fā)現(xiàn)，Tfh異?；罨蓪?dǎo)致大量的IL-21分泌，同時(shí)IL-21與受體結(jié)合可誘導(dǎo)外周血及黏膜固有淋巴層中大量促炎因子的釋放，IL-21還可通過(guò)Th1細(xì)胞反應(yīng)調(diào)節(jié)腸黏膜組織單個(gè)淋巴細(xì)胞增殖，分泌高水平的炎癥因子［19］?，F(xiàn)有的研究表明，Tfh在免疫性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)制與B細(xì)胞的激活及IL-21的分泌有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，PD患者外周血中Tfh比例增高，且與正常人相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tfh的比例隨PD分期增高而增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-21作為T(mén)fh分化及功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子，同樣在PD中高表達(dá)，且與H-Y分期相關(guān)。Tfh介導(dǎo)的炎癥作用與B細(xì)胞的激活有關(guān)，從結(jié)果看，PD患者中激活B細(xì)胞的比例顯著高于健康人，而激活B細(xì)胞比例隨分期增高顯著增高，說(shuō)明在PD患者中存在Tfh的過(guò)度增殖和B細(xì)胞的過(guò)度激活，IL-21在Tfh和B細(xì)胞的相互作用中起重要作用。