杜文蔚 陳二虎 王康旭 宋 偉 唐培安

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs，UDP-glucuronosyl transferas)是一類廣泛分布于各種動(dòng)植物、細(xì)菌和病毒的多功能超家族酶類，這一類酶能夠?qū)⒒罨暮塑仗枪w上的糖基轉(zhuǎn)移到糖苷配基上，從而改變受體的性質(zhì)，包括生物活性、溶解性、跨膜運(yùn)輸?shù)忍匦訹1，2]。活化的核苷糖主要有UDP-葡糖醛酸、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖等，而受體分子既可以為內(nèi)源物，也可以是外源物，其中昆蟲體內(nèi)一般以UDP-葡萄糖為主要糖源[3]。Kaplanoglu等[4]通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)多條UGT基因在馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)吡蟲啉抗性品系中顯著上調(diào)表達(dá)，通過RNAi技術(shù)沉默UGT2基因后，馬鈴薯甲蟲對(duì)吡蟲啉的敏感性顯著提高，表明UGTs基因在馬鈴薯甲蟲的吡蟲啉抗性形成過程中發(fā)揮重要作用。李秀霞等[5]發(fā)現(xiàn)在小菜蛾(PlutellaXylostella)幼蟲抗性種群中，UGT33AA4的表達(dá)量均顯著高于敏感種群(30.7～77.4倍)，RNA干擾抑制UGT33AA4表達(dá)后，抗性和敏感小菜蛾幼蟲對(duì)氯蟲苯甲酰胺的死亡率分別增加27.3%和29.8%，證明UGT33AA4的過表達(dá)與小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性相關(guān)。

赤擬谷盜Triboliumcastaneum是一種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的世界性儲(chǔ)藏物害蟲，屬鞘翅目(Coleptera)，擬步甲科(Tenebrionidae)，擬谷盜屬(Tribolium)[6]。赤擬谷盜在世界范圍內(nèi)主要分布于熱帶與溫帶地區(qū)[7，8]，在我國(guó)至少23個(gè)省(區(qū))有分布[9]。此外，赤擬谷盜有臭腺分泌臭液，其分泌物含有致癌物，導(dǎo)致糧食品質(zhì)下降，尤其對(duì)糧食中的粉類物質(zhì)的危害最嚴(yán)重，所以當(dāng)赤擬谷盜大量發(fā)生時(shí)，面粉會(huì)被嚴(yán)重污染形成塊狀，產(chǎn)生腥臭味，顏色改變，使其無法食用，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[10-12]。PH3熏蒸是目前防治儲(chǔ)糧害蟲的主要方式[13]，然而由于長(zhǎng)期對(duì)PH3單一藥劑的過度依賴，導(dǎo)致赤擬谷盜對(duì)PH3產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性，對(duì)我國(guó)的儲(chǔ)糧安全構(gòu)成巨大威脅[14-17]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)表明，赤擬谷盜不同PH3抗性種群基因表達(dá)量存在明顯差異，其中包括2個(gè)尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因—UGT2B7和UGT2C1基因，二者在赤擬谷盜PH3抗性種群中顯著高表達(dá)[18]，然而其在PH3抗性形成過程中的功能尚屬未知。據(jù)此，本研究以赤擬谷盜為研究對(duì)象，分析UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜不同抗性水平以及PH3熏蒸前后的表達(dá)模式；進(jìn)而通過RNA干擾技術(shù)沉默靶標(biāo)基因，分析赤擬谷盜PH3敏感性變化情況，從而揭示UGT2B7和UGT2C1基因與赤擬谷盜PH3抗性形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx

赤擬谷盜的敏感和抗性種群分別于2016年采自云南西雙版納農(nóng)戶(YN)和廣東省深圳某糧庫(SZ)(抗性倍數(shù)分別為3.0、862.7倍[19])，并在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)至今。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以人工飼料(全麥粉∶酵母粉=19∶1)，在恒溫29～31 ℃、相對(duì)濕度為70%～80%、無光照的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

RNA easy、HiScript3?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、ChamQTMSYBR?qpcr Master Mix(Low Rox Premixed)、T7 RNAi Transciption Kit TR102、50×TAE、Loading Buffer、MiniBEST DNA Fragement Purification Kit Ver.4.0、DNA Marker 500、DNA Marker 2000、溴化乙錠溶液(EB)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PH3熏蒸

采用FAO[20]推薦的PH3發(fā)生裝置并加以改進(jìn)，PH3氣體由10%磷化鋅的硫酸反應(yīng)制備獲得，發(fā)生裝置見圖1。

在生物測(cè)定的基礎(chǔ)上，得到Y(jié)N、SZ種群的毒力回歸方程：Y=-10.565+7.465X、Y=-47.249+12.146X，選擇PH3的亞致死濃度LC30進(jìn)行藥劑處理，其中YN的LC30為23.44 μg/L；SZ的LC30為6 895 μg/L。具體操作如下：將羽化后1周齡成蟲放入熏蒸瓶(各種群分別選取50頭)，用高真空硅脂把熏蒸瓶與玻璃旋塞密封。使用相應(yīng)量程的氣密性注射器抽取PH3氣體，依次注入熏蒸瓶，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中密閉熏蒸。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)，分別為0、1、2、6、12、20 h，以無藥劑處理作為空白對(duì)照。各處理完成后，選取存活的試蟲立即放入液氮冷凍備用，實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

圖1 PH3氣體發(fā)生裝置

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

選取羽化后1周齡的赤擬谷盜成蟲以及PH3處理不同時(shí)間后仍存活的赤擬谷盜成蟲，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。按照試劑說明書用RNA easy提取上述樣本的總RNA，每個(gè)種群均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶情況，以便進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。以上述mRNA為模板，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書合成cDNA模板，置于-20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因序列(登錄號(hào)分別LOC100141953、LOC660846)信息，用在線設(shè)計(jì)軟件Primer-Blast設(shè)計(jì)定量PCR引物，選擇RPS18(登錄號(hào)：XM_968539)與RPL13(登錄號(hào)：XM_969211)作為定量PCR的內(nèi)參基因[21]。定量PCR引物和dsRNA引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其他詳細(xì)信息見表1。

表1 mRNA表達(dá)分析及dsRNA合成所用引物

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

采用ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix (Low Rox Premixed)試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行qPCR，每個(gè)種群均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qPCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。

1.2.5 dsRNA 的合成與注射

赤擬谷盜UGT2B7、UGT2C1以及和綠色熒光蛋白(GFP)的dsRNA特異性引物序列見表1。使用梯度PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10 μL Tap PCR Master Mix，0.5 μL 上游/下游引物，1 μL cDNA，加去離子水至20 μL，PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。產(chǎn)物用MiniBEST DNA Fragement Purification Kit Ver.4.0按照說明進(jìn)行回收，然后參照T7 RNAi Transciption Kit TR102試劑盒說明書體外合成dsRNA。

選取赤擬谷盜活力良好的五齡幼蟲為試蟲。使用微量注射器將200 ng dsRNA注射入幼蟲體內(nèi)，對(duì)照組注射相等劑量的dsGFP，每組均注射足量幼蟲。注射后置于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，48 h后分別收集生理狀況良好的赤擬谷盜并凍存于液氮中備用。采用qPCR方法測(cè)定注射靶標(biāo)基因的dsRNA后的沉默效果，反應(yīng)條件參見1.2.4。

1.2.6 赤擬谷盜PH3敏感性測(cè)定

選用赤擬谷盜一周齡成蟲進(jìn)行RNAi，靶標(biāo)基因沉默后采用熏蒸法檢測(cè)試蟲對(duì)PH3的敏感性，以LC30作為PH3處理濃度(YN：23.44 μg/L；SZ：6 895 μg/L)。處理不同時(shí)間后觀察試蟲死亡情況并統(tǒng)計(jì)死亡率，輕觸蟲體不動(dòng)為死亡。以注射dsGFP作對(duì)照組，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50頭試蟲。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

使用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(One-Way ANOV)中的Turkey式多重比較法，對(duì)赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因的相對(duì)表達(dá)量以及死亡率進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05表示顯著性差異，P>0.05表示無顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜敏感和抗性種群中的表達(dá)模式

赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因在抗性(SZ)種群中的表達(dá)量均高于敏感(YN)種群，二者在極高抗種群SZ中的表達(dá)量分別是敏感種群YN的2.70和5.90倍，并具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 PH3脅迫下赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因的表達(dá)模式

不同時(shí)間梯度下，PH3脅迫對(duì)赤擬谷盜UGT2B7基因表達(dá)量影響見圖2，PH3處理后UGT2B7的表達(dá)量在敏感(YN)和抗性種群(SZ)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，兩者的變化規(guī)律相似，且均在2 h達(dá)到峰值。PH3脅迫處理2 h時(shí)間段內(nèi)(即基因表達(dá)量達(dá)到峰值時(shí))，敏感種群基因表達(dá)量和抗性種群基因表達(dá)量分別是未處理組的2.47倍和1.76倍，并且均與其他脅迫時(shí)間點(diǎn)基因相對(duì)表達(dá)量形成顯著差異(P<0.05)。

注：柱形圖表示平均數(shù)±SD；不同字母之間表示顯著性差異(P<0.05)；以0 h為對(duì)照組。圖2 赤擬谷盜UGT2B7在PH3脅迫后的表達(dá)量變化

PH3脅迫后赤擬谷盜UGT2C1基因表達(dá)量變化見圖3，結(jié)果顯示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無藥劑處理組基因表達(dá)量與0 h無顯著性差異(P>0.05)，敏感種群經(jīng)PH3處理不同時(shí)間后，UGT2C1基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組平均下降了約5.37倍，具有顯著差異(P<0.05)；該基因在脅迫1 h后，其相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。抗性種群經(jīng)PH3處理不同時(shí)間后，UGT2C1基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)；處理20 h時(shí)的表達(dá)量相比未處理組高達(dá)8.75倍，存在顯著差異(P<0.05)。PH3脅迫后該基因在敏感和抗性種群中的表達(dá)模式不同。

注：柱形圖表示平均數(shù)±SD；不同字母之間表示顯著性差異(P<0.05)；以0 h為對(duì)照組。圖3 赤擬谷盜UGT2C1在PH3脅迫后的表達(dá)量

2.3 UGT2B7和UGT2C1基因沉默對(duì)赤擬谷盜PH3敏感性的影響

為進(jìn)一步解析赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因與PH3抗性形成的關(guān)系，利用RNA干擾技術(shù)分別沉默這兩個(gè)基因，并檢測(cè)其沉默效率，同時(shí)測(cè)定試蟲PH3敏感性變化情況。結(jié)果顯示，赤擬谷盜分別注射dsUGT2B7、dsUGT2C148 h后，與對(duì)照組相比，敏感種群和抗性種群的UGT2B7、UGT2C1mRNA表達(dá)水平顯著降低，沉默效率分別是49.4%、41.1%和51.7%、47.6%。

分別沉默UGT2B7、UGT2C1基因后，以PH3處理敏感和抗性種群，分析赤擬谷盜對(duì)PH3的敏感性變化情況，結(jié)果表明，RNA干擾UGT2B7后，以PH3LC30處理敏感和抗性種群，赤擬谷盜死亡率分別增加27%、22%；RNA干擾UGT2C1后，以PH3LC30處理敏感和抗性種群，赤擬谷盜死亡率分別增加38%、31%。注射dsGFP后，試蟲死亡率無顯著性變化(P>0.05)(圖4)。

注：柱形圖表示平均數(shù)±SD；柱上的字母表示顯著性差異(P<0.05)；以dsGFP為對(duì)照組。圖4 不同抗性種群赤擬谷盜UGT2B7、UGT2C1基因干擾后對(duì)PH3的敏感性檢測(cè)

3 討論

與一般化學(xué)農(nóng)藥抗性機(jī)理類似，PH3除通過呼吸作用進(jìn)入蟲體外，亦可通過擴(kuò)散作用穿透表皮直接進(jìn)入蟲體[22]。Chaudhry等[23]利用放射性同位素(32PH3)標(biāo)記的方法，通過提高昆蟲抗性品系的熏蒸濃度，使兩個(gè)品系達(dá)到相同的PH3攝入量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性品系的死亡率顯著低于敏感品系，說明昆蟲的解毒作用也參與了PH3抗性的形成。UGTs 是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的重要生物轉(zhuǎn)化酶，可以催化活化糖供體中的糖基加到受體分子的糖苷配基上，產(chǎn)生可被有效排泄的水溶性物質(zhì)，從而使毒物得到解毒和消除。本研究通過對(duì)UGT2B7和UGT2C1基因在不同PH3抗性種群赤擬谷盜中的定量分析，發(fā)現(xiàn)UGT2B7和UGT2C1基因在PH3抗性種群中表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，抗性種群表達(dá)量顯著高于敏感種群，暗示其與PH3抗性形成密切相關(guān)。Li等[24]發(fā)現(xiàn)，9個(gè)UGT基因在多抗小菜蛾品系中過量表達(dá)，且其中的UGT40V1、UGT45B1和UGT33AA4可以被5～7種殺蟲劑誘導(dǎo)表達(dá)。UGT40V1、UGT45B1、UGT33AA4和UGT2B7和UGT2C1屬于同一個(gè)基因家族，其功能可能相似，可能介導(dǎo)了昆蟲的抗藥性上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩條基因是否介導(dǎo)赤擬谷盜PH3抗藥性的形成，本研究對(duì)PH3敏感與抗性種群赤擬谷盜UGT2B7和UGT2C1基因在PH3脅迫前、后的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，UGT2B7基因在敏感和抗性種群中均出現(xiàn)先升后降的應(yīng)激反應(yīng)，且均在2 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，相比未脅迫組顯著上調(diào)，但是長(zhǎng)時(shí)間脅迫后表達(dá)量下降，可能是昆蟲產(chǎn)生了適應(yīng)性調(diào)節(jié)，從而維持體內(nèi)蛋白水平穩(wěn)定。而UGT2C1基因的表達(dá)量，在敏感種群試蟲中持續(xù)下調(diào)，抗性種群持續(xù)上調(diào)。在敏感種群中的持續(xù)下調(diào)這一趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)前的預(yù)測(cè)略有差異，對(duì)于這一問題會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)其做出進(jìn)一步檢測(cè)與分析；在抗性種群中表達(dá)量顯著上調(diào)，脅迫20 h后該基因的表達(dá)量是對(duì)照組的8.75倍。據(jù)此推測(cè)，抗性種群赤擬谷盜在受到PH3脅迫后可能產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)等適應(yīng)性變化，導(dǎo)致UGT2C1表達(dá)量在脅迫一定時(shí)間后迅速上升，以應(yīng)對(duì)外界的藥劑壓力使赤擬谷盜對(duì)PH3的敏感性迅速增強(qiáng)，同時(shí)也驗(yàn)證了在赤擬谷盜抗性種群中UGT2C1表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)這一結(jié)果。有報(bào)道表明茚蟲威處理后甜菜夜蛾(SpodopteraExigua)6個(gè)UGT基因表達(dá)水平顯著上調(diào)[25]，硫丹處理后的斜紋夜蛾(SpodopteraLitura)UGT酶活性于24 h后顯著升高[26]。Lee等[27]發(fā)現(xiàn)抗吡唑硫磷果蠅代謝速率明顯高于敏感品系，并且通過熒光同位素14C標(biāo)記法得出UGT只存在于微粒體酶液中，同時(shí)在抗性品系中UGT酶活性明顯高于敏感品系。Kojima等[28]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，除蟲菊酯可誘導(dǎo)UGT表達(dá)量顯著上升，同時(shí)經(jīng)吡蟲啉、啶蟲脒和除蟲脲篩選或者處理后，其體內(nèi)的UGT的表達(dá)量明顯提高，表明UGT與昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒代謝關(guān)系密切。綜上所述，根據(jù)定量結(jié)果，我們認(rèn)為UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜PH3抗性產(chǎn)生中扮演了重要角色，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜抗性種群在PH3脅迫時(shí)的表達(dá)模式也與相關(guān)研究結(jié)果相似。

為了進(jìn)一步明確赤擬谷盜PH3抗性產(chǎn)生機(jī)理，采用RNA干擾實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證UGT2B7和UGT2C1基因在PH3抗性產(chǎn)生中所發(fā)揮的作用及功能。目前對(duì)于UGT家族基因的功能研究最早是在煙芽夜蛾(HeliothisVirescens)中開展，發(fā)現(xiàn)UGTs能增強(qiáng)其對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑甲基對(duì)硫磷的抗性[29]。王夢(mèng)瑤[30]采用“葉碟吸收飼喂法 ”對(duì)朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)UGT201D3基因進(jìn)行RNA干擾，研究表明AbR品系在處理后對(duì)阿維菌素的的敏感性上升。Li等[31]利用RNA干擾對(duì)UGT2B17表達(dá)進(jìn)行沉默，研究其與小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺抗性的關(guān)系，結(jié)果表明，UGT2B17參與了氯蟲苯甲酰胺的解毒作用，該基因的過表達(dá)在小菜蛾的抗氯蟲苯甲酰胺中起著重要的作用。本研究對(duì)赤擬谷盜老熟幼蟲進(jìn)行RNA干擾，使UGT2B7和UGT2C1分別沉默，從而研究其與PH3抗性的關(guān)系，PH3敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UGT2B7和UGT2C1基因沉默后，敏感和抗性種群的赤擬谷盜死亡率都顯著增加，該結(jié)果證實(shí)UGT2B7和UGT2C1基因在赤擬谷盜PH3抗性形成過程中發(fā)揮作用，可能參與了赤擬谷盜對(duì)PH3的解毒代謝。

4 結(jié)論

UGT2B7和UGT2C1基因在抗性種群中的表達(dá)量均顯著高于敏感種群(P<0.05)。敏感和抗性種群赤擬谷盜的UGT2B7和UGT2C1基因的表達(dá)量均隨著PH3熏蒸時(shí)間的變化而變化，表明這兩個(gè)基因可能在赤擬谷盜對(duì)PH3產(chǎn)生抗性的過程中起著重要的作用。UGT2B7、UGT2C1基因沉默后，赤擬谷盜對(duì)PH3的敏感性顯著提高，進(jìn)一步表明UGT2B7、UGT2C1基因可能參與赤擬谷盜對(duì)PH3的抗藥性的形成。