李朝暉 許僑 蔡京偉 王澤宇 李加偉 熊亞南

摘要：煙草甲[Lasioderrma serricorne （Fabricius）]作為世界范圍內(nèi)最重要的煙草倉儲害蟲之一，一直是煙草倉儲領(lǐng)域的研究熱點，因其食性廣、抗藥性強和繁殖能力強等特點在防治方面有很多的問題，現(xiàn)行的防治方法較為單一，無法應(yīng)對復(fù)雜多樣的倉儲實際情況，綜述國內(nèi)外報道的煙草甲的物理、化學(xué)和生物防治方法，并對使用范圍廣、使用效果好和防治潛力大的一些防治方法進行重點介紹;近10年來分子生物學(xué)的迅速發(fā)展使煙草甲的研究方法日新月異，分子生物學(xué)成為煙草甲防治研究的重要手段，綜述近10年分子生物學(xué)與煙草甲研究這2個交叉領(lǐng)域中的主要成果，并對現(xiàn)行煙草甲研究中使用的分子生物學(xué)工具進行了評價。

關(guān)鍵詞：煙草甲;化學(xué)防治;物理防治;生物防治;分子生物學(xué);煙草倉儲害蟲

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0033-11

收稿日期：2020-07-14

基金項目：江蘇中煙淮陰卷煙廠青年創(chuàng)新項目。

作者簡介：李朝暉（1994—），男，江蘇淮安人，碩士，助理工程師，主要從事植物保護研究。E-mail：490980921@qq.com。

煙草甲[Lasioderrma serricorne （Fabricius）]屬鞘翅目竊蠢科，是世界煙草倉儲行業(yè)的重要倉儲害蟲，約3 000年前在圖坦卡蒙的墳?zāi)怪惺状伟l(fā)現(xiàn)，F(xiàn)abricius在1792年首次用科學(xué)的分類學(xué)方法描述了煙草甲[1]，在卷煙行業(yè)興起的19世紀中期就有關(guān)于其危害煙草的報道[1-2]。隨著世界范圍內(nèi)卷煙行業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大，卷煙最主要的原材料——煙葉的倉儲規(guī)模也隨之擴大，且由于新煙草工藝的出現(xiàn)，煙葉一般須要在倉庫內(nèi)醇化2～3年方可使用，這都導(dǎo)致煙草甲危害范圍和規(guī)模的擴大。在我國，每年因蛀煙害蟲所引起的煙葉質(zhì)量損失約占總倉儲煙葉數(shù)量的1.64%，因煙草甲所造成的損失占總損失的98%以上[3]。凌成興曾在2016年的全國煙葉工作大會對全國的煙葉庫存進行公示，截至2016年6月，全國煙葉在儲煙倉庫總庫存量約 7 934 萬擔（1擔=50 kg），以此數(shù)據(jù)推論每年因煙草甲所引起的質(zhì)量損失的煙葉約130萬擔，以收購價100元/kg計算，每年約有65億人民幣的經(jīng)濟損失;從國外報道來看，因煙草甲造成的質(zhì)量損失的煙葉占總倉儲煙葉數(shù)量的1%～5%，有個別地區(qū)蟲害發(fā)生嚴重的，損失可達50%;世界范圍內(nèi)每年因煙草甲造成的煙葉經(jīng)濟損失超過3億美元[4]。煙草甲不僅通過進食直接降低煙葉質(zhì)量，而且煙草甲進食后產(chǎn)生的蟲糞及其死亡后的蟲尸還會對成品卷煙質(zhì)量造成影響，有蟲尸和蟲糞的卷煙點燃后出現(xiàn)煙氣不純、惡臭氣味等現(xiàn)象，引發(fā)消費者投訴。自2003年我國加入世界貿(mào)易組織（World Trade Organization，簡稱WTO）以來，卷煙市場的競爭從單純的國有品牌競爭到現(xiàn)在的國際品牌競爭，且日益激烈，不合格的卷煙產(chǎn)品極不利于塑造卷煙品牌。因此，卷煙工業(yè)公司對煙葉倉儲的要求也不斷提高，但現(xiàn)行煙葉倉儲防治煙草甲的方法卻較為單一，且無法保證煙葉在煙草甲威脅下的質(zhì)量[5]。本文綜合國內(nèi)外煙草甲的防治方法，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 物理防治

1.1 溫控防治

1.1.1 高溫殺蟲 煙葉是卷煙的主要原料，卷煙企業(yè)采購的煙葉通常情況下需要1～3年的醇化期，使煙葉醇化至最佳口感。在田間采回—復(fù)烤加工—倉庫存儲—交付卷煙廠使用這一煙葉傳遞鏈上，復(fù)烤加工階段的高溫可以有效殺死田間采回?zé)熑~上可能存在的成蟲和蟲卵，在復(fù)烤加工的煙葉真空回潮時可有效殺死煙草甲。奚家勤等的研究結(jié)果表明，當真空回潮溫度高于60 ℃持續(xù)3 min、70 ℃保持2 min或55 ℃保持4 min，能殺死所有蟲態(tài)煙草甲[6]。

除了在復(fù)烤加工階段殺蟲，還有其他的借助高溫殺蟲的方法[7-8]。Makhijani曾報道利用灌注高溫空氣殺死倉儲害蟲的方法，通過灌注高溫空氣將倉庫升溫至50～60 ℃并保持24～36 h，可殺死煙草甲等害蟲，這項技術(shù)自2005年美國禁用甲基溴后得到了廣泛的使用[9];事實上，大部分煙草甲在高溫環(huán)境中只需幾個小時便會死亡，Yu等報道在50 ℃條件下保持166 min或在54 ℃條件下保持38 min就可以滅殺99%各蟲態(tài)煙草甲[10]。而對少部分未在短時間內(nèi)死去的煙草甲，這可能是煙草甲應(yīng)對高溫脅迫的機制起到了作用，Li等研究表明，煙草甲可以快速適應(yīng)高溫，36～42 ℃的高溫會提升煙草甲的耐熱性，經(jīng)過高溫馴化的煙草甲在42 ℃處理時表現(xiàn)出亞致死性，但隨著溫度處理時間的延長和處理溫度的提高，煙草甲仍會死亡[11]。

1.1.2 恒溫控制 煙草甲幼蟲發(fā)育起點溫度為17.66 ℃，當倉庫溫度控制在18 ℃時，煙草甲完成幼蟲階段發(fā)育需要802 d[12-13]。巴西地區(qū)煙草倉庫溫度常年維持在18 ℃，取得良好的控制效果[14];我國長沙卷煙廠于20世紀90年代在瀏陽地區(qū)常年保持17～20 ℃的巖洞內(nèi)儲存煙葉，在儲存期間基本無煙草甲危害發(fā)生;上海和廈門等地?zé)熑~存儲倉庫加裝了空調(diào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，恒溫恒濕，煙葉醇化效果好且無煙草甲發(fā)生。通過恒溫控制，不僅可以降低煙草甲的危害，還可以更好地控制煙葉醇化進程[15]。

1.1.3 低溫殺蟲 煙草甲生物學(xué)研究表明，在 -20～5 ℃區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的升高，各蟲態(tài)均致死的時間為-20 ℃，1 h;-15 ℃，5 h;-10 ℃，18 h;-5 ℃，7 d;0 ℃，13 d;5 ℃，28 d[16]。基于這一研究成果，許多儲煙倉庫使用低溫滅殺煙草甲。延吉卷煙廠和鄭州卷煙廠在冬季開倉利用低溫殺蟲，延吉卷煙廠開倉48 h后所有供試煙草甲全部死亡;鄭州卷煙廠經(jīng)過冬季低溫開倉后，供試煙草甲也全部死亡;在國外也有利用低溫殺死煙草甲的報道[17-19]。煙草甲的卵因在各蟲態(tài)下對化學(xué)藥劑處理表現(xiàn)低敏感性成為煙葉存儲倉庫防治的難題，已有多項研究表明，煙草甲的卵在低溫處理時表現(xiàn)出高敏感性[16，20]，易被低溫殺死，因此低溫殺蟲是未來煙草甲防治研究中的一個重要方向。

1.2 氣調(diào)防治

煙草甲必須有足夠O2才能完成生命周期，長期在低氧環(huán)境中，煙草甲會很快死亡。據(jù)報道，在0.5%～0.8% O2條件下，煙草甲LD99為6.9 d[21]。早在1918年，美國Bailey等就提出了通過脫氧氣調(diào)殺蟲的方法提高倉儲質(zhì)量的建議。但受制于倉儲條件和生產(chǎn)力水平，化學(xué)防治因其經(jīng)濟性仍是防治倉儲害蟲的主要方法。但隨著化學(xué)試劑的濫用，人畜中毒和環(huán)境污染問題屢見報端，人們逐漸意識到化學(xué)藥劑對環(huán)境的破壞和對人身安全的威脅，1980年，美國通過了關(guān)于利用氣體倉儲食品的法案，氣調(diào)防治也逐漸成為倉儲領(lǐng)域的研究熱門。

1.2.1 充N2法 N2是地球大氣中的重要組成部分，自然空氣中約含78%的N2。研究表明，在儲煙倉庫充N2 6 d后，煙草甲各蟲態(tài)致死率達100%，與化學(xué)防治方法相比，防治時間大大縮短，低氧濃度（1.5%～2.0%O2）環(huán)境下對3種蟲態(tài)煙草甲綜合致死效果較好，在煙葉養(yǎng)護過程中能夠有效殺滅煙草甲[22-23];李燦對N2殺蟲機制進行了闡述，高壓沖N2后，煙草甲體內(nèi)氧化作用循環(huán)被打破，在煙草甲體內(nèi)現(xiàn)存糖無氧分解完之后，煙草甲死亡率大幅提升，且在低氧條件下，煙草甲體內(nèi)呼吸作用不得不分解體內(nèi)H2O，導(dǎo)致煙草甲脫水死亡[24]。江蘇中煙工業(yè)有限公司、廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司部分煙葉倉儲庫區(qū)使用沖N2殺蟲法，取得了很好的防治效果。

1.2.2 充CO2法 CO2是大氣的重要組成，自然空氣中約含0.04%CO2，因其制造簡單也常被用于煙草甲的氣調(diào)防治。Gerard以高壓二氧化碳處理煙草甲，發(fā)現(xiàn)在4 000 kPa條件下30 min或3 000 kPa條件下 50 min，可殺死煙草甲[1];Navarro研究了不同溫度和氣壓下CO2處理后煙草甲的致死作用，結(jié)果表明以30 ℃、3 333 Pa處理煙草甲成蟲，成蟲LT99為 15 h[25];Gunasekaran研究了不同CO2濃度對煙草甲的致死作用，結(jié)果表明以70%、40%的CO2分別處理48、96 h后，煙草甲死亡率達100%，且蛹的耐氣能力比卵、幼蟲、成蟲的強，Gunasekaran還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CO2處理后幸存的煙草甲成蟲，其繁殖潛力大幅下降，幾乎不能產(chǎn)生后代[26]。

1.2.3 充混合氣體法 在充N2和充CO2防控?zé)煵菁讜r，人們發(fā)現(xiàn)將N2、CO2和O2這3種氣體混合后滅殺煙草甲的效果更好。Childs研究表明，以 65 ∶8 ∶27 的體積比混合CO2∶O2∶N2滅殺煙草甲，處理1 h后，部分煙草甲的卵失活;3 d后卵失活率為99.9%，2 d后99.9%的成蟲死亡，4 d后998%的幼蟲死亡，7 d后99.2%的蛹死亡[27]。充混合氣體法相比充單一氣體法而言，在更短時間內(nèi)有更好的殺蟲效果，且這種方法允許更高的氧氣含量，這意味著對倉儲設(shè)施的密閉性要求稍微降低，能夠更廣泛的應(yīng)用。

1.2.4 氣氛調(diào)控劑 氣氛調(diào)控劑是一種新型綠色倉貯養(yǎng)護技術(shù)，該產(chǎn)品能有效降低煙葉貯存環(huán)境內(nèi)O2濃度，提升CO2濃度。當環(huán)境內(nèi)CO2濃度上升至70%并保持28.58 h后，可至99%的各蟲態(tài)煙草甲死亡;48 h后，可至100%的煙草甲死亡[28]。使用氣氛調(diào)控劑時，先將氣氛調(diào)控劑放在煙垛上部，然后用塑料帷幕封閉煙垛，使用氣氛調(diào)控劑后，帷幕內(nèi)CO2濃度很快上升至90%以上，滅殺所有煙草甲。使用氣氛調(diào)控劑不僅可以保證封閉煙垛內(nèi)無煙草甲危害，還可以提高煙葉醇化效果，且氣氛調(diào)控劑具有安全性高、經(jīng)濟實惠和不燃不爆等特點，對倉儲條件的要求也較低，已在全國多個省市使用[29]。

1.3 物理隔離防治

1.3.1 硅藻土 硅藻土（diatomite1，簡稱DE）是一種生物成因的硅質(zhì)沉積巖，其化學(xué)組成以SiO2為主，礦物成分主要是蛋白石。我國硅藻土儲量為32億t，遠景儲量達20多億t，是一種較為廉價，已規(guī)模開發(fā)且用途廣泛的產(chǎn)品，在農(nóng)業(yè)中，硅藻土通常被用作殺蟲劑和土壤改良劑[30]。巴西儲煙倉庫曾用硅藻土防治煙草甲，施用硅藻土24 h后，89%的煙草甲種群衰退，在使用后前3個月，煙草甲種群增長得到顯著抑制[14]。

1.3.2 電網(wǎng) Matsuda提出了一種雙功能電場屏蔽器，以隔絕煙草甲進入倉庫[31]。屏蔽層由平行排列的絕緣鐵絲（ICW）和位于ICW兩側(cè)的2個接地導(dǎo)體網(wǎng)組成。使用電壓發(fā)生器將負電荷（0.1～8.0 kV）施加到絕緣電線上，使用于覆蓋電線的絕緣子套管極化，使絕緣子的外表面負電，正向在電線的內(nèi)導(dǎo)體表面正電。ICW的負表面電荷在接地網(wǎng)中引起靜電感應(yīng)，而在面對ICW的網(wǎng)表面上產(chǎn)生相反的電荷。在ICW和接地網(wǎng)之間的空間中形成了一個電場，場強與施加到ICW上的電壓增加成正比。到達接地網(wǎng)外表面的煙草甲被阻止進入網(wǎng)內(nèi)。當電網(wǎng)的電壓越大，電網(wǎng)的阻止能力越強。當ICW的負電荷超過4.1 kV時，未發(fā)現(xiàn)有煙草甲進入電網(wǎng)。

1.4 輻射防治

自20世紀初，研究者就已經(jīng)開始研究用輻射防治害蟲，大體分為3個方向，分別是輻射誘變、輻射不育和輻射殺蟲，其中輻射殺蟲以其時效性強的特點研究最多，應(yīng)用最廣[32-34]?，F(xiàn)有的對輻射殺蟲的研究報道集中在γ射線上。γ射線對煙草甲有顯著的滅殺作用，殺蟲效果與輻射劑量及輻射劑量率呈正相關(guān)，當劑量水平在1.0～1.5 kGy之間時，可以直接滅殺煙草甲成蟲;當劑量水平低于1.0 kGy時，依然能夠有效殺傷害蟲[35-36]。輻射技術(shù)不僅能夠滅殺害蟲，還能提升煙草品質(zhì)、防止煙草霉變且無生物毒性[37-40]，目前我國尚未開放煙草行業(yè)輻射準許，但倉儲糧食已有開放輻射準許并出臺相關(guān)標準，輻射技術(shù)在煙葉倉儲領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用值得期待。

2 化學(xué)防治

2.1 磷化鋁

磷化鋁是全球煙草倉儲防治煙草甲最主要、最廣泛的化學(xué)藥劑，1975年被國際煙草企業(yè)選用作為儲煙倉庫煙草甲的熏蒸劑[41]。在過去的近50年中，磷化鋁也取得了很好的防治效果[42-44]。但磷化鋁產(chǎn)生的PH3是劇毒氣體，國家“十三五”規(guī)劃中將其列為高毒農(nóng)藥，且許多企業(yè)為追求高防效長期過量使用，而連續(xù)、單一的使用也帶來了許多問題，這其中最嚴重的就是煙草甲對磷化鋁抗藥性的增強。Rajendran報道在印度發(fā)生了世界上第1例PH3熏蒸失敗的案例[45];Zettler等在美國北卡州的部分煙草倉庫中用PH3熏蒸煙草甲，發(fā)現(xiàn)超過1/2儲煙倉庫中的煙草甲對PH3具有不同程度的抗藥性，當?shù)責(zé)煵菁追N群中有部分表現(xiàn)出高度抗性[46];Savvidou等從25個國家收集了31個種群的煙草甲，測試了它們的磷耐受性，結(jié)果表明，來自12個國家的17個煙草甲種群表現(xiàn)出抗藥性，有1個種群表現(xiàn)出5倍于正常種群的抗藥性[47]。我國尚未有PH3熏蒸失敗的報道，但郭超等研究表明，PH3在250 mL/m3劑量下維持132 h方可完全殺死煙草甲，且該劑量并不能杜絕煙草甲的危害[48]。這可能表明煙草甲已經(jīng)對PH3產(chǎn)生高抗性。且以實際應(yīng)用來看，我國GB/T 23220—2008《煙葉儲存保管方法》規(guī)定，儲煙倉庫每年均需熏蒸2次，但即使每年熏蒸2次PH3，我國每年仍有大量煙草因煙草甲而遭受質(zhì)量損失，這從側(cè)面說明單一熏蒸對煙草甲防治效果比較有限。因此，高效低毒且對非靶標生物安全、不產(chǎn)生或產(chǎn)生抗藥性較慢的新藥劑或新方法成為許多研究者的目標。但新藥劑的研發(fā)周期長，且防效難以探明，因此一些研究者轉(zhuǎn)向?qū)H3的施藥方式和施藥工具進行了改進，并取得了不錯的效果。彭濤等在PH3中混合CO2，以1.5 g/m3使用量封閉96 h，對煙草甲各蟲態(tài)都有很好的滅殺效果[49];丁碧軍將6 g/m3的藥劑量平均分成2次使用，中間間隔 10 d，滅殺作用與一次性施藥時的滅殺作用無顯著差異[50];李謀智等采用干凈便宜的新式PH3發(fā)生器，提高了安全性，且減少了磷化鋁的用藥量[51-52];日本學(xué)者Haradah等的研究結(jié)果表明，如果溫度≥25 ℃，熏蒸時間96 h以上，即使是較低濃度的PH3也能殺死全部蟲態(tài)的煙草甲[53]。

2.2 保護劑

除了磷化鋁熏蒸以外，目前還有一些化學(xué)藥劑能夠防治煙草甲，效果較好的有菊酯類、甲基嘧啶磷類、敵百蟲和敵敵畏等一些藥劑，但這些藥劑均存在一些共同的問題，例如穿透能力弱，無法穿透煙箱滅殺煙草甲;毒性強，對人體危害大;短期內(nèi)過量使用后藥效迅速下降，煙草甲對其產(chǎn)生抗藥性;對煙草甲蛹期不敏感;再猖獗等諸多問題。因此化學(xué)藥劑只能作為煙草甲防治的補充手段。當監(jiān)測到蟲情并且蟲情未達到熏蒸標準時，這些藥劑可以限制煙草甲種群數(shù)量和生存空間，起到一定的防控作用。

綜合近期報道，現(xiàn)行使用防護劑綜合防效好的是菊酯類藥劑，例如除蟲菊酯、溴氫菊酯和高效氯氟氫菊酯等。以10 mg/kg高效氯氟氫菊酯處理煙草甲，4 d后蟲口衰減率為85.7%，6 d后煙草甲幼蟲校正死亡率為80.2%，對煙草甲3齡幼蟲的種群抑制率為85.1%，溴氫菊酯防效稍弱于高效氯氟氫菊酯，使用6 d后幼蟲的校正死亡率為71.4%，對3齡幼蟲的種群抑制率為71.3%[54];以4 mg/m3施用除蟲菊酯24 h后，空間防效高達90%[55]。

2.3 植物提取物

植物在與昆蟲長期的協(xié)同進化中，為應(yīng)對昆蟲的脅迫產(chǎn)生了許多對昆蟲具有防御能力的次生代謝物質(zhì)，這些次生物質(zhì)種類超過40萬種[56]。我國有豐富的植物資源，已報道對煙草甲具有防治效果的植物至少有14科23種[57]。從這些植物中提取出的殺蟲有效成分根據(jù)構(gòu)成其化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架不同可分為檸檬素、倍半萜和二萜、生物堿和植物精油。

2.3.1 植物精油 植物精油是目前研究最廣的植物類防護劑，按作用類型分為熏蒸、觸殺、胃毒、驅(qū)避和抑制生長發(fā)育等，其中熏蒸為主要使用方式[58]。Samuel等從小豆蔻、胡椒和郁金香中分別提取精油并噴回，發(fā)現(xiàn)這3種精油均可有效阻止煙草甲侵染，并阻止煙草甲化蛹，且在高濃度時（0.1 mg/10 g），3種精油對煙草甲各蟲態(tài)致死率達100%[59];Chan等從肉桂、薺菜和辣根等5種植物中提取精油，并測定了其殺蟲活性，結(jié)果表明肉桂精油熏蒸殺蟲效果與其他4種植物精油存在顯著性差異，殺蟲效果最佳[60];國內(nèi)也有相似的報道，已有許多研究者投身于這方面的研究，他們從多種香料及花卉中提取植物精油，發(fā)現(xiàn)提取物對煙草甲有熏蒸、驅(qū)避和觸殺等眾多作用，結(jié)果表明植物精油是開發(fā)利用前景很好的植物性殺蟲劑（保護劑）[61-72]。

2.3.2 生物堿 生物堿的定義是含負氧化態(tài)的存在于生物有機體中的環(huán)狀化合物。植物體內(nèi)存在一些具有殺蟲活性的生物堿，它們具有胃毒、化學(xué)不育、驅(qū)避和觸殺等作用。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李建洪課題組與鄭州煙草研究院合作提取了20余種植物的80多種植物提取物，其中對煙草甲表現(xiàn)出高毒性的生物堿有SJA和TFG的丙酮、石油醚、乙酸乙酯以及乙醇提取物，濃度為0.1 g/mL施藥3 d后，供試煙草甲的校正死亡率均達100%;AKI的石油醚提取物以0.05 g/mL濃度施藥3 d后，供試煙草甲校正死亡率也達到100%[69];趙海剛對AGS的殺蟲活性進行了分析，其研究結(jié)果表明，α-細辛醚是AGS的主要殺蟲活性[72]。

2.3.3 倍半萜和二萜 倍半萜和二萜是由異戊二烯單位構(gòu)成的環(huán)、鏈狀聚合體。4分子異戊二烯是二萜，3分子異戊二烯是倍半萜。趙海剛分析了CTM的丙酮、石油醚、乙酸乙酯以及乙醇提取物對煙草甲成蟲的生物活性，發(fā)現(xiàn)以驅(qū)避和觸殺毒性為主，且以0.05 g/mL濃度施藥1 d后，供試煙草甲成蟲校正死亡率達100%[72]。

2.3.4 檸檬素 在蕓香科、苦木科和楝科等植物中存在一些三萜類化合物，這些化合物也被稱為檸檬素類化合物[73]。檸檬素類化合物中，最負盛名的是從楝科印楝中提取出的印楝素。印楝素具有多種殺蟲活性，最顯著的是拒食作用和抑制生長發(fā)育。Hans將保幼激素與印楝提取物相比，發(fā)現(xiàn)印楝提取物對煙草甲幼蟲的防控效果更佳[74];程新勝等將甲基嘧啶磷與印楝提取物的觸殺毒性相比，發(fā)現(xiàn)印楝素對煙草甲觸殺毒性較低，但具有明顯的后效作用[75]。

2.4 黑光燈

黑光燈是一種氣體放電燈，它能發(fā)射人眼觀察不到的330～400 nm的紫外線光波，可與誘捕裝置配合使用。多項研究表明，煙草甲成蟲具有趨光性[76-77]。利用昆蟲的趨光性誘捕煙草甲，可以作為蟲情預(yù)報的一種手段。Papadopoulou等將食物誘捕器、性誘劑和黑光燈誘捕器在相同條件下進行實倉試驗，結(jié)果表明黑光燈誘捕器在這3種誘捕器中的誘捕效果最佳[78];在國內(nèi)還尚未有實倉使用黑光燈誘捕煙草甲的報道。

3 生物防治

隨著生活水平的提高和經(jīng)濟的發(fā)展，更多的人開始重視食品安全問題。同時，隨著前幾年國家“雙減”指導(dǎo)思想的提出，表明我國將大力發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，維護生態(tài)安全。因此，除了化學(xué)藥劑防治以外，許多研究者開始探尋高效簡易的煙草甲防治新方法。綜合國內(nèi)外煙草甲的生物防治的研究報道，大體分為3個大方向：昆蟲激素、微生物和自然天敵。

3.1 昆蟲激素

對煙草甲的昆蟲激素研究主要集中在性信息素和保幼激素2個領(lǐng)域。

對煙草甲的性信息素的研究始于1980年。20世紀80年代，日本Chuman等首先從雌性煙草甲體內(nèi)分離出了（6S，7S）4，6-二甲基-7-羥基-壬烷-酮-3（serricomine），并很快商品化，目前仍在日本儲煙倉庫中使用。在此基礎(chǔ)上，德國的Vonwitlko等在1982年發(fā)現(xiàn)并合成了環(huán)化-serricomineo，1983年德國的Heermann等合成了脫水-serricomine[79]。國內(nèi)學(xué)者對煙草甲性信息素的研究起步較國外晚，但也涌現(xiàn)了一批成果。在國內(nèi)，毛若云等首次成功合成了2種煙草甲蟲雌性信息素：2，6-二乙基-3，5-二甲基-2，3-二氫毗喃和4，6-二甲基-7-羥基-壬烷-酮-3[80];吳江等以（S）-脯氨酸及丙炔醇為原料，合成了煙草甲性信息素，亦有很好的引誘作用[81]。目前煙草甲雌性信息素共有6種，serricorole和serricorone的性刺激效果較強，但性誘效果較弱，serricorole作為產(chǎn)卵抑制物能阻止雌煙草甲在已著卵的物體上產(chǎn)卵;性信息素4S，6S，7S-serricomin吸引力最強，其中6-二甲基-3-壬酮，（4S，6S，7S）-7-羥基-4對雄性煙草甲成蟲有很強的性刺激性和引誘性[82]。煙草甲性誘劑已成為儲煙倉庫必不可少的防控措施，在監(jiān)測煙草甲方面有不可替代的作用。

保幼激素別稱返幼激素，Ryan用帶有保幼激素的煙葉飼喂煙草甲后，煙草甲不能正常發(fā)育，幼蟲無法化蛹完成生命周期[1]。根據(jù)這一特性，國外有學(xué)者研究并發(fā)明了煙草保護劑Kabat，在復(fù)烤加工階段以5.0×10-6～1.0×10-5 mg/m3使用煙草保護劑Kabat噴在煙葉上，可保護煙葉2～4年不受損傷[83];國內(nèi)也有使用保幼激素類藥劑防治煙草甲的報道，楊長舉等使用小麥中蒙515濃度為10-5 mg/m3時可防治煙草甲達2年之久[57];洪深求等使用雙氧威以10～20 mg/kg的濃度處理煙葉10個月后，供試煙草甲死亡率達100%[84]。

3.2 微生物

對煙草甲的微生物研究主要集中在蘇云金芽孢桿菌（Bt）和白僵菌上。

白僵菌是一種子囊菌類的蟲生真菌，只有少部分白僵菌對煙草甲有較強的毒力，因此想要用白僵菌防治煙草甲就需要研究者們先篩選出一些毒力較強的樣本。已報道篩選出的高毒力白僵菌有球孢白僵菌[Beauveria bassiana（Balsamo）]、布氏白僵菌[B. brongniartii（Sacc.）]和白僵菌菌株Bb050722，均對煙草甲有一定的致死作用[85-86];白僵菌菌株Bb050722以1.46×108個孢子/mL濃度處理供試煙草甲，18、21、25、28 ℃時煙草甲2齡幼蟲半數(shù)致死時間（LT50）分別為6.3、3.9、3.6、4.1 d，結(jié)果表明，白僵菌對煙草甲有不錯的防控效果[86];劉愛英等測定白僵菌粉對煙草甲的毒力，發(fā)現(xiàn)施藥21 d后煙草甲死亡率為84.4%，且證明了煙草甲可以帶菌遷飛[87];羅力等對煙草甲帶菌遷飛現(xiàn)象進行了進一步研究，其研究結(jié)果表明煙草甲可以帶菌遷飛40 m以上，實倉使用時集中釋放白僵菌比分散釋放效果好[88];張曉敏等針對醇化倉庫高溫低濕環(huán)境篩選能夠耐受 -0.8 MPa 的較低水勢和35 ℃環(huán)境條件，且生長穩(wěn)定的突變菌株，能在醇化倉庫惡劣的環(huán)境脅迫下長期生存[89]。

Bt是微生物研究領(lǐng)域的熱門之一，Bt在形成孢子時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類芽孢體內(nèi)物質(zhì)對廣譜昆蟲有高致死性，如今已有防治水稻二化螟、大螟等害蟲的成熟商品[90]。一些學(xué)者進行了Bt對煙草甲防治效果的研究。Kaelin等從煙末中分離出3種Bt菌株，用這3種Bt菌株處理煙草甲7 d后，供試煙草甲幼蟲致死率最高可達80%[91];Tsuchiya等從 2 000 多種分離物中篩選出了28種分離物，這28種分離物對幼蟲有強致死作用，并證明β外毒素是煙草甲生物活性的關(guān)鍵[92]。高家合從10多個地區(qū)共采集到801個煙葉樣品，并從中分離得到736株Bt菌株，對這些菌株的生物毒力進行測定，結(jié)果表明所得菌株中有9個菌株接種12 d后，供試煙草甲校正死亡率超過95%[93];齊緒峰等通過在東南沿海地區(qū)、東北、華東、華中和西南地區(qū)的7家卷煙廠的煙葉倉庫中采集到各種類型的樣品共521份，從中分離出Bt菌株952株并對其進行毒力鑒定，結(jié)果表明，有18株對煙草甲的殺蟲活性較高，施藥后3 d，有13株菌株對煙草甲的校正死亡率超過70%;施藥后9 d，有12株菌株對煙草甲的校正死亡率超過80%，有3株菌株對煙草甲的殺蟲活性最高，校正死亡率達90%以上[94];世界頂級煙草公司——菲利普·莫里斯公司在歐洲的實驗室從倉儲煙草中分離的Bt菌株毒力測定結(jié)果顯示，施藥后煙草甲校正死亡率為83%。Bt制劑在防控?zé)煵菁追矫嬗泻艽蟮臐摿晒┩诰?，有很好的?yīng)用前景[95]。

3.3 自然天敵

煙草甲已知的自然天敵較少，何榕賓等分別對福建省和貴州省煙草甲天敵資源進行了調(diào)查，估計煙草甲的天敵有5目8科13種[96-97];郭軍等在貴陽地區(qū)進行了煙草甲天敵資源調(diào)查，發(fā)現(xiàn)象蟲金小蜂[Anisopteromalus calandrae （Howard）]是貴陽地區(qū)煙草甲的優(yōu)勢種寄生蜂，研究了其生物學(xué)特性并對其防控?zé)煵菁椎臐摿ψ隽嗽u估，結(jié)果表明，1只象蟲金小蜂在24 h內(nèi)可以寄生14.14頭煙草甲老熟幼蟲，519只煙草甲蛹，具有一定防控?zé)煵菁椎臐摿98];國外報道的煙草甲天敵資源有腐食酪螨[Tyrophagus putrescentiae（Schrank）]、米象金小蜂[Lariophagus distinguensis（Ferster）]、象蟲金小蜂[A. calandrae（Howard）]和伍異金小蜂[Anisopteromalus quinarius][99-103]，但均未見進一步在生物防治應(yīng)用方面的研究報道。

4 煙草甲的分子生物學(xué)研究進展

分子生物學(xué)是從分子水平闡明生命現(xiàn)象和本質(zhì)的科學(xué)，隨著近10年來分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，一些研究者希望從分子層面尋找到防治煙草甲的辦法，目前對煙草甲分子生物學(xué)的研究主要集中在Cry基因、系統(tǒng)發(fā)育、熱激蛋白和蛋白酶基因等方面，研究內(nèi)容集中在基因克隆、基因功能鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等方面，較為片面，未構(gòu)成較為整體的研究體系;從基因組學(xué)角度宏觀地闡釋煙草甲各基因組的結(jié)構(gòu)、進化、定位、編輯和功能的研究較少，且現(xiàn)有研究手段大多停留在轉(zhuǎn)錄組測序后的基因克隆表達驗證階段，深入至蛋白表達差異分析研究較少，已較為普遍使用的一些蛋白層次的研究手段，如蛋白純化和蛋白質(zhì)印跡法等基本未見在煙草甲的研究中使用?？偠灾诖嘈碌姆肿由飳W(xué)的研究方法被用于煙草甲的研究之中。

4.1 Cry基因

Cry基因是從蘇云金芽孢桿菌中提取的具有單獨殺蟲活性的晶體蛋白，也是國內(nèi)外應(yīng)用開發(fā)最多的抗蟲基因，世界范圍內(nèi)已有500多種Cry基因被報道[104]。傳統(tǒng)的Cry基因命名系統(tǒng)將Cry基因分為5個大類，分別是CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryV[105]，如今的Cry基因命名系統(tǒng)用簡化了羅馬數(shù)字表達，換用阿拉伯數(shù)字命名，并分4個級別對Cry基因進行每一位的命名，已報道的500多種Cry基因按新的命名方法可以分為60多大類。而國內(nèi)外已報道的從各國家和地區(qū)的加工廠和煙倉的煙草殘渣、成品煙葉及死亡的煙草甲中提取出來的對煙草甲有一定毒殺效果的Cry基因?qū)兕愝^多。例如，高家合等從云南省煙草科學(xué)研究所分離的752株Bt菌株中分離得到27株含Cry基因的Bt菌株，20株分屬Cry4，7株分屬Cry1[106];胡逸超等對蘇云金芽孢桿菌菌株GXZY032的Cry基因類型做了鑒定，該菌株上有CryI、CryII和Cry10這3種類型Cry殺蟲基因[107]，Michel從15個國家的加工廠和煙倉中收集煙草甲死亡尸體、加工碎片和煙葉樣品共126個，檢測分離出的107株Bt菌株分屬Cry1（18%）、Cry2（23%）和Cry3（59%）[108];Hfte等對3株Bt菌株進行了測序比對，發(fā)現(xiàn)其Cry基因均為CryIII A殺蟲基因[109]。研究者們從大量Bt菌株中篩選出一些對煙草甲毒力較強的菌株并對其毒性做了測定，測定的結(jié)果顯示，毒力最高的Bt菌株對煙草甲幼蟲的99%致死濃度（LC99）為9 d，且基本所有篩選出的Bt菌株在施用9 d后都能達到80%以上的防效，這表明開發(fā)Bt試劑防治煙草甲是可行的。但對目前已報道的這些Cry基因的分類分析發(fā)現(xiàn)，Cry3類的Cry基因數(shù)量占所有基因數(shù)量的百分比比預(yù)想的要小。Cry3基因是被公認的對鞘翅目昆蟲毒力最強一類的Cry基因[110]，煙草甲屬鞘翅目竊蠢科，Cry3基因?qū)煵菁追乐蔚男Ч麘?yīng)當更好，因此建議在以后的取樣中，應(yīng)當從協(xié)同進化的角度考慮，著重收集煙草甲樣本，以尋找到對煙草甲專性更強的菌株。

4.2 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)是重建地球生命進化史的科學(xué)，傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)僅僅依靠形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進行分類，但物種的種下分化往往產(chǎn)生極相似的亞種，且傳統(tǒng)分類學(xué)的較高專業(yè)知識儲備要求嚴重阻礙了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究。隨著交叉學(xué)科的發(fā)展，分子生物學(xué)引入后系統(tǒng)發(fā)育學(xué)有了新的研究手段。許多研究者開始嘗試使用分子學(xué)方法研究煙草甲的系統(tǒng)發(fā)育。Coelho-Bortolo等在巴西儲煙倉庫收集了11個煙草甲種群，并用20多個隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）引物對所收集到的種群進行測序，對得到的350多條基因序列做了系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，研究結(jié)果表明，不同地區(qū)煙草甲種群內(nèi)有高度遺傳變異性，且這種遺傳的變異性會隨著被侵染的煙葉的交流而增強[110];Blanc等從15個國家收集了16個煙草甲種群，用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）方法得到了16個煙草甲種群的基因序列，并建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，但Blanc的研究結(jié)果表明，不同地區(qū)的煙草甲種群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹種遺傳差異不大，并將這一結(jié)果同樣歸結(jié)于煙葉在全球范圍內(nèi)的流動[111]。隨著經(jīng)濟全球化進程的加速，煙葉作為世界最重要的經(jīng)濟作物之一，必然在全球范圍內(nèi)加速流動，煙葉在世界范圍的流動究竟對煙草甲種群的遺傳分化有什么樣的影響，還須要研究者們更進一步的研究，相應(yīng)的研究成果對協(xié)同進化等一些大生物的基本問題也有很重要的意義。

分子生物學(xué)研究方法除了被用于煙草甲種群的遺傳分化性研究上，還被研究者用于煙草甲的重要共生菌YSL上。Noda等用電泳對煙草甲的重要共生菌YSL的染色體DNA進行分離，結(jié)果表明其染色體數(shù)為11條，基因組大小為20.9 Mbp，并對YSL進行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明YSL來源于早期的真子囊菌綱的絲狀真菌，后期發(fā)展為甲蟲類的專有共生菌[112]。

4.3 熱激蛋白

昆蟲是變溫動物，對于昆蟲的生命活動，溫度是最重要的影響因素，昆蟲的溫度耐受性機制是決定其種群在特定生態(tài)環(huán)境下能否得以存活的一個重要條件。已有研究結(jié)果表明，昆蟲對溫度脅迫的耐受能力除了與其種群遺傳特效有關(guān)之外，不同的昆蟲還會采用不同的生化及生理策略來抵御溫度脅迫。這其中，昆蟲面對溫度脅迫時的熱激蛋白的誘導(dǎo)表達是目前研究最多、也是被認為與昆蟲的溫度耐受性關(guān)系最密切的因素之一[113]。但最新的研究成果表明，熱激蛋白不僅參與昆蟲應(yīng)對溫度脅迫的調(diào)節(jié)，還可能參與了其他外界脅迫的調(diào)節(jié)。Yang等研究了4個小分子量熱激蛋白基因LsHsp19.4、LsHsp20.2、LsHsp20.3、LsHsp22.2等在煙草甲各時期的表達水平以及面對CO2氣調(diào)脅迫時的表達水平，結(jié)果表明，LsHsp20.2和LsHsp22.2在成蟲時表達量最高，LsHsp19.4和LsHsp20.3在蛹期表達量最高，在面對CO2氣調(diào)脅迫時，LsHsp20.2和LsHsp20.3表達量有顯著的上調(diào)，但LsHsp19.4的表達量卻下調(diào)了，這表明部分熱激蛋白基因也參與了煙草甲應(yīng)對外界脅迫的應(yīng)激響應(yīng)[13]。

4.4 一些重要的酶基因克隆及功能驗證

酶是由活細胞產(chǎn)生的，對其底物具有高度催化效能和高度特異性的RNA或蛋白質(zhì)，是一類極為重要的生物催化劑，如果缺少酶，生命體將無法正常完成發(fā)育周期[114]。許多學(xué)者針對煙草甲的一些重要的酶基因進行了相應(yīng)的研究。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是各種親電子化合物與催化還原型谷胱甘肽進行親核加成反應(yīng)的酶，是昆蟲體內(nèi)的重要代謝解毒酶。嚴毅等從轉(zhuǎn)錄組中篩選出了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因LsGSTe1，并用甲酸乙酯對供試煙草甲進行脅迫，結(jié)果表明，30%致死濃度（LC30）（10 μL/L）和LC50（20 μL/L）的甲酸乙酯對煙草甲5齡幼蟲熏蒸脅迫后，幼蟲體內(nèi)LsGSTe1的表達水平顯著升高，與對照組相比分別是對照組的2.96、5.80倍。RNA干擾（RNAi）72 h后，ds LsGSTe1注射組與對照（ds GFP組）相比，LC50濃度的甲酸乙酯處理5齡幼蟲的死亡率明顯提高了324%，這表明LsGSTe1可能參與了煙草甲對甲酸乙酯的代謝和解毒過程[115];許抗抗等從轉(zhuǎn)錄組中篩選出了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因LsGSTt1、LsGSTd1和LsGSTs1，并對其在CO2脅迫下的表達量進行了研究，結(jié)果表明，用LC50、LC30、10%致死濃度（LC10）這3個CO2濃度處理煙草甲低齡幼蟲6 h后，煙草甲中LsGSTd1表達量與對照組無顯著性差異，而LsGSTt1和LsGSTs1表達量與對照組相比有顯著性差異，表達量上調(diào)，這表明LsGSTt1和LsGSTs1參與了煙草甲對CO2氣調(diào)脅迫的應(yīng)激響應(yīng)[116];李燦等也進行了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對CO2氣調(diào)脅迫下的反應(yīng)機制研究，結(jié)果表明煙草甲在受到CO2氣調(diào)脅迫3、6、9 h 后，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性被激活[117]。

絲氨酸蛋白酶是一個蛋白酶家族，它們的作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)，對昆蟲的先天免疫反應(yīng)機制有重要作用。陳春旭從轉(zhuǎn)錄組中篩選出了4個具有clip結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶基因LsCLIP、LsCLIP2、LsCLIP3、LsCLIP4，通過RT-PCR克隆得到了其全長序列，并用qPCR解析了所得到的LsCLIPs基因的時空表達模式和20-羥基蛻皮激素（20E）的誘導(dǎo)表達模式，并在此基礎(chǔ)上用RNAi技術(shù)對LsCLIPs基因在煙草甲的先天免疫和生長發(fā)育中的功能進行了驗證，結(jié)果表明，20E可以誘導(dǎo)LsCLIPs基因的高表達，4個LsCLIPs基因在煙草甲生命周期各階段皆有表達，用20E注射煙草甲高齡幼蟲后LsCLIPs基因表達量有顯著上調(diào)，這些結(jié)果表明LsCLIPs基因參與了煙草甲對免疫脅迫的應(yīng)激響應(yīng)和生長發(fā)育[118]。

幾丁質(zhì)是僅次于纖維素的自然界中含量第二多的多糖，也是煙草甲的外殼的重要組成元素。楊文佳等對煙草甲控制幾丁質(zhì)的重要基因——幾丁質(zhì)脫乙酰酶1基因進行了研究，從送測的煙草甲轉(zhuǎn)錄組中篩選后通過RT-PCR克隆得到幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因LsCDA1，對煙草甲4齡幼蟲注射20-羥基蛻皮酮誘導(dǎo)后LsCDA1基因的表達量顯著上調(diào)，這表明LsCDA1參與了煙草甲體內(nèi)激素調(diào)節(jié)，同時楊文佳等對該結(jié)果通過RNAi技術(shù)進行了驗證，結(jié)果表明注射該基因雙鏈核糖核酸（dsRNA）后，LsCDA1表達量下調(diào)87%，供試煙草甲不能蛻皮、腹部皺縮死亡或蛻皮時間推遲，不能正常完成生命周期[119];Chen等研究了煙草甲幾丁質(zhì)降解的重要基因——N-乙酰谷氨酸合成酶基因LsNAG1，結(jié)果表明，LsNAG1在幼蟲后期和蛹期后期表達水平最高，LsNAG1經(jīng)20-羥基蛻皮酮誘導(dǎo)后表達量顯著上調(diào)，煙草甲4齡幼蟲和煙草甲的蛹注入該基因dsRNA后，這2個階段的LsNAG1表達量顯著下調(diào)，供試煙草甲出現(xiàn)嚴重的蛻皮和高死亡率現(xiàn)象，與注入ds GFP的對照組相比，注入LsNAG1的煙草甲蛹和煙草甲4齡幼蟲的死亡率分別高了83%、48%，這表明LsNAG1在煙草甲幼蟲至蛹和蛹至成蟲期有很重要的作用，并且可以作為新殺蟲劑的靶標[120]。

羥酸酯酶是昆蟲體內(nèi)最重要的解毒酶之一，在對殺蟲劑的抗性形成和對外源化合物的解毒代謝中起著重要作用。朱曉曄等從轉(zhuǎn)錄組中篩選后，通過RT-PCR克隆得到的LsCarEB1和LsCarEB2表達量在供試煙草甲經(jīng)過CO2脅迫后與對照組相比明顯上調(diào)，且這2個基因在煙草甲高齡幼蟲期表達量顯著高于煙草甲其他生命周期的表達量，這表明LsCarEB1和LsCarEB2是響應(yīng)CO2脅迫的重要機制之一，而且在煙草甲的生命周期中有重要作用[121]。

4.5 抗生素基因

在日本，煙草甲還被作為醫(yī)學(xué)昆蟲。Watanabe等在14個不同地區(qū)日本牙科診所中收集煙草甲種群，并對這些煙草甲抗藥基因MecA、VanA、VanB、BlaIMP、BlaVIM等做了研究，結(jié)果表明，供試煙草甲飼喂抗生素類藥品后，這幾種基因表達量沒有明顯上調(diào)或下調(diào)，煙草甲對抗生素類藥品無抗藥性，對煙草甲抗藥基因的研究，可能為解決人類抗生素抗藥性問題提供一定的思路[122]。

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