許桐彤 徐振健 陳麗玲 陳秋菊 徐安平

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是一類具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的T 細(xì)胞亞群，因Tregs能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)而被應(yīng)用在眾多疾病的研究中，如自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤等。根據(jù)來(lái)源，Tregs 可分為自然調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（natural regulatory T cells，nTregs）和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（in?duced regulatory T cells，iTregs）。nTregs 主要來(lái)源于胸腺，iTregs 是由外周幼稚T 細(xì)胞在抗原的刺激下轉(zhuǎn)化而來(lái)，二者均通過(guò)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。在正常的情況下，nTregs 與輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，Th）協(xié)同維持機(jī)體正常的免疫反應(yīng)。然而，在免疫炎癥反應(yīng)情況下，這種平衡可能會(huì)被打破，出現(xiàn)Th 數(shù)量增多和功能增強(qiáng)，進(jìn)而可導(dǎo)致nTregs 的功能不穩(wěn)定［1，2］。另外，多項(xiàng)研究表明在免疫炎癥狀態(tài)下，nTregs 可能表達(dá)與輔助性T 細(xì)胞（Th17）分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt（retinoic acid?related orphan receptor?γt）［3，4］，即RORγt+nTregs。RORγt+ nTregs 被認(rèn)為是處于向促炎型Th17 分化的過(guò)渡階段。這提示我們nTregs 在免疫炎癥狀態(tài)下的功能可能不穩(wěn)定，甚至可能具有促炎作用。

許多疾病都存在缺氧的病理生理過(guò)程。病理性缺氧是引起免疫炎癥反應(yīng)的常見(jiàn)原因［5］。說(shuō)明缺氧與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。在本研究中，我們通過(guò)體外缺氧來(lái)模擬組織缺氧環(huán)境，進(jìn)而研究缺氧對(duì)nTregs 中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況以及對(duì)nTregs 功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實(shí)驗(yàn)所用C57BL/6 小鼠購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；分選nTregs 所用試劑購(gòu)于德國(guó)MiltenyiBiotec；流 式 抗 體FITC anti?mouse CD3e、perCP?cy5.5 anti?mouse CD4、PE anti?mouse CD25、BV421 anti?mouse FoxP3 以及流式細(xì)胞儀均購(gòu)買自美 國(guó)BD 公 司；westernblot 所 用STAT3 抗 體、p?STAT3 抗體、RORγt 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；CFSE 試劑購(gòu)于美國(guó)Biolengend 公司；缺氧模型所需培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；常氧培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）分選nTregs：取C57BL/6 小鼠的脾臟于細(xì)胞篩網(wǎng)中研磨后移至離心管，離心，棄上清，裂紅。根據(jù)MiltenyiBiotec 的試劑（130?091?041）說(shuō)明孵育CD4+CD25+ Regulatory T cell Biotin?Antibody Cocktail、Anti?BiotinMicroBeads 和CD25?PE antibody 后過(guò)LS 分選柱得到細(xì)胞懸液；在上述懸液中加適量Anti?PE MicroBeads 孵育，按說(shuō)明過(guò)MS 分選柱即得到nTregs；（2）建立體外缺氧條件：將得到的nTregs 種于96 孔板中，加入IL?2、TGF?β和anti?mouseCD3 抗體和anti?mouse CD28 抗體混勻后置于1%氧濃度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理，同時(shí)設(shè)立常氧環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)組作為對(duì)照（5%二氧化碳，95%空氣）；（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞：收集細(xì)胞于流式管中，加1 mL PBS 離心洗1 次，去掉上清，200 μL PBS 重懸，加細(xì)胞表面抗體4℃避光孵育15 分鐘，2 mL PBS 離心洗一次，使用transcrip?tion factor buffer set 固定后加胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子抗體4℃避光孵育30 分鐘后破膜，加200 μL PBS 重懸上機(jī)檢測(cè)；（4）蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot）：提取細(xì)胞總蛋白后，將20 μg 的蛋白樣品加到SDS?PAGE 膠中進(jìn)行電泳，完成后電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。用5% BSA 室溫封閉1 h，隨后加入相關(guān)一抗在4℃孵育過(guò)夜。一抗?jié)舛纫罁?jù)抗體說(shuō)明書(shū)使用；GAPDH 的一抗?jié)舛葹?∶5000。室溫孵育二抗1 h后，用G：BOX 智能顯像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene 公司）采集條帶圖片，應(yīng)用ImageJ 對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析；（5）Th 細(xì)胞增殖：小鼠脾臟研磨后置于尼龍毛柱中37℃孵育30 分鐘后除去柱中液體，將尼龍毛浸于PBS 中反復(fù)吹打，將懸液移至離心管后離心，棄上清，加絲裂霉素溶液孵育后得到APC 細(xì)胞，與上述柱中液體中得到的Th?CFSE 共培養(yǎng)3 天后流式細(xì)胞儀測(cè)Th 增殖。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用流式分析軟件Flow?Jo VX 對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有結(jié)果以（±s）表示，采用Student's t?test 進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)的比較，采用multiplet?test 進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)的比較，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧影響FoxP3 在nTregs 中的表達(dá) 當(dāng)體外缺氧處理15 分鐘后，nTregs 中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 在胞內(nèi)的表達(dá)開(kāi)始下降。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)選定CD3+CD4+的T 細(xì)胞亞群（圖1A），分析該細(xì)胞亞群中CD25 和FoxP3 的表達(dá)情況。圖1B和圖1C 中，基線組（baseline）為新鮮提取的nTregs，0 分鐘（0 min）指在常氧條件下培養(yǎng)1 天。與基線組和常氧組（0 min）相比，體外缺氧15 分鐘后，F(xiàn)oxP3 在nTregs 中的比例出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在體外缺氧6 小時(shí)和12 小時(shí)后，F(xiàn)oxP3 的表達(dá)仍然呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.01）。以上結(jié)果提示體外缺氧能夠持續(xù)抑制nTregs 中FoxP3 的 表 達(dá)。

2.2 缺 氧 誘 導(dǎo)nTregs 向RORγt+nTregs 轉(zhuǎn) 化因nTregs 中FoxP3 的表達(dá)在體外缺氧15 分鐘出現(xiàn)明顯下降，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（west?ern blot）檢測(cè)了體外缺氧15 分鐘后nTregs 中的轉(zhuǎn)錄因子RORγt，STAT3 以及磷酸化的STAT3（p?STAT3）的表達(dá)情況。圖2 中，當(dāng)nTregs 體外缺氧15 分鐘后，與常氧組相比，缺氧后轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的表達(dá)增多（P＜0.05），同時(shí)p?STAT3 比例增多（P＜0.01），但STAT3 表達(dá)無(wú)變化，與上述FoxP3 的變化相對(duì)應(yīng)。說(shuō)明體外缺氧可以誘導(dǎo)nTregs 轉(zhuǎn)化為RORγt+ nTregs，且p?STAT3 可能參與其中。

圖1 缺氧影響Foxp3 在nTregs 中的表達(dá)

圖2 缺氧后nTregs 可能向Th17 細(xì)胞轉(zhuǎn)化

2.3 缺氧影響nTregs 對(duì)Th 細(xì)胞的抑制作用 我們通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，在常氧的情況下，Th 細(xì)胞在體外增殖能力活躍，nTregs 通過(guò)抑制Th 細(xì)胞的增殖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能（圖3A，P＜0.0001）。當(dāng)對(duì)nTregs 進(jìn)行15 分鐘的體外缺氧處理后，與未缺氧nTregs 相比（baseline），nTregs 對(duì)Th 細(xì)胞的抑制作用明顯減弱（圖3B，P＜0.0001）。說(shuō)明體外缺氧能夠影響nTregs 的免疫抑制功能。

圖3 缺氧影響nTregs 對(duì)Th 細(xì)胞的抑制作用

3 討 論

在免疫炎癥狀態(tài)下，nTregs 通過(guò)FoxP3 的調(diào)控能直接或間接抑制靶細(xì)胞［6］。然而，nTregs 對(duì)一些免疫炎癥性疾病的抑制作用并不理想［7］。研究表明在炎癥性腸病小鼠的腸道中發(fā)現(xiàn)具有促炎作用的RORγt+nTregs［3］，提示nTregs 在免疫炎癥狀態(tài)下不穩(wěn)定。

病理性缺氧本質(zhì)上是誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)的病理生理過(guò)程。組織缺氧時(shí)，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到受損的部位，通過(guò)釋放IL?1、IL?6 和TNF 等細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，被激活的缺氧誘導(dǎo)因子HIF 通過(guò)促進(jìn)FoxP3 的降解、STAT3 和RORγT 的激活來(lái)調(diào)節(jié)Th17 和Tregs 之間的平衡［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)nTregs 在缺氧的環(huán)境中不能維持原有的免疫抑制功能，其機(jī)制可能與缺氧導(dǎo)致nTregs 中的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 失活和STAT3 激活有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)體外缺氧誘導(dǎo)nTregs 表達(dá)RORγt使nTregs 向Th17 方向轉(zhuǎn)化，為缺氧導(dǎo)致的免疫炎癥性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。