姚幫本，閆 超，姚 麗，陳趙然*，陳 偉*

(1.安徽省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗研究院 安徽 合肥 230051；2.合肥工業(yè)大學 食品科學與生物工程學院 安徽 合肥 230009)

“民以食為天，食以安為先”，食品安全關乎著人們“舌尖上的安全”，直接影響人民群眾的身體健康和生命安全。食品安全問題是指生物和化學性等因素從原材料到成品各個環(huán)節(jié)對食品所帶來的潛在影響和對人類健康造成的危害。影響因素主要包括食源性致病微生物、農(nóng)獸藥濫用、重金屬、真菌毒素污染、非法添加、摻雜使假以及食品接觸材料中的危害成分遷移等。食源性致病菌污染是導致食源性疾病的主要原因，美國每年都有約4 800萬例食源性疾病患者(相當于六分之一的美國人)，約12.8萬人住院和3 000人死亡[1]。目前常見的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、致病性弧菌、彎曲桿菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和阪崎腸桿菌等[2]。常規(guī)的檢測方法主要有平板分離法、化學分析法和免疫分析法等。但這些方法都或多或少存在不足，如步驟繁瑣、檢測周期長、成本高、對操作人員的專業(yè)水平要求高。因此，開發(fā)簡單、靈敏、快速和低成本的檢測復雜食品樣品中致病菌的方法成為迫切需求。

本文綜述了以免疫分析、分子生物學、生物傳感器、代謝學、核酸適配體為基礎的快速檢測食源性致病菌的方法，闡述了各方法的原理、優(yōu)缺點和應用現(xiàn)狀等，并討論了現(xiàn)有快速檢測方法存在的問題和未來的發(fā)展方向，以期為食源性致病菌快速檢測技術的發(fā)展提供參考，對各學科研究和食品安全監(jiān)管具有一定意義。

1 食源性致病菌快速檢測方法

1.1 免疫學檢測技術

1.1.1 酶聯(lián)免疫吸附測定技術酶聯(lián)免疫吸附測定[2-3](Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術是將抗原與抗體反應和酶化學反應結合到一起的測定技術，具有靈敏度高、快速、特異性強的特點，所需儀器化程度低，樣本前處理相對簡單，特別適于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

Zhai等[4]采用雜交瘤細胞技術制備了7株阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體，用其中一株建立的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法對阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度可達106CFU/mL。Feng等[5]利用雙抗夾心ELISA法對大腸埃希氏菌O157∶H7進行了檢測(示意圖見圖1)，結果表明，該方法在105～108CFU/mL范圍內具有良好的線性關系，靈敏度達1×104CFU/mL。此外，經(jīng)過8 h的增菌，該方法對人工污染的綠茶樣品中大腸埃希氏菌O157∶H7的檢測靈敏度達到0.4 CFU/g。

圖1 雙抗夾心ELISA法原理示意圖Fig.1 Sandwich ELISA principle diagram

1.1.2 免疫層析技術免疫層析(Immuno chromatography，IC)技術的檢測原理是將目標物的特異性抗體固定在硝酸纖維素膜上，然后目標物在毛細管層析的作用下從樣品區(qū)向硝酸纖維素膜遷移，在經(jīng)過固定有特異性抗體的區(qū)域時，抗原抗體發(fā)生特異性免疫識別反應，使目標物被固定在特定的區(qū)域，最后再通過肉眼、紫外或紅外光激發(fā)、酶促反應顯色等方法判定檢測結果。該項技術操作方便，讀取結果的時間最短的只需3～5 min，最長不超過30 min。高度特異的抗原抗體反應可保證該檢測結果保持很高的特異性和靈敏度。一般只需不到100 μL樣本即可得到檢測結果。產(chǎn)品只需室溫保存，有效期長，適用范圍廣，移植能力強，且非專業(yè)人員也可以操作。

Hassan等[6]首次使用單克隆抗體熒光橫向流動免疫分析法檢測了牛肉中的大腸桿菌O157∶H7，這種新方法的靈敏度是傳統(tǒng)橫向流動分析方法的數(shù)千倍，在牛肉中的檢出限為178 CFU/g。此外，該方法的檢測成本比傳統(tǒng)方法低60%，且結果可采用智能手機讀取。Liu等[7]建立了一種檢測水產(chǎn)品和腹瀉患者糞便中副溶血性弧菌的免疫層析方法，該方法對副溶血性弧菌有很高的特異性和敏感性，檢出限為1.2×103CFU/mL，對32株目標菌、13個白蝦和146個腹瀉患者糞便樣本的敏感性和特異性檢測率均為100 %。Qi等[8]將免疫磁性納米顆粒與免疫層析技術相結合，建立了一種快速、高靈敏檢測大腸埃希氏菌O157∶H7的方法，靈敏度從105CFU/mL提高到103CFU/mL。吳穎等[9]開發(fā)了一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析試紙條方法，將一種金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的單克隆抗體連接膠體金，通過另一株SPA的單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，制備雙抗夾心法膠體金免疫層析試紙條，靈敏度達1×106CFU/mL。Chen等[10]使用末端功能化的引物對目標基因進行擴增，開發(fā)了一種基于量子點的快速、高敏檢測金黃色葡萄球菌的免疫層析試紙條方法，在奶粉和肉類樣本中的檢測限分別為3×100CFU/mL和3×101CFU/g。Noguera等[11]用碳納米粒子標記中性抗生物素蛋白，利用雙修飾的特異性引物進行擴增，建立了一種可以針對大腸桿菌不同基因的免疫層析試紙條檢測方法，靈敏度達104～105CFU/mL。

1.1.3 免疫熒光技術免疫熒光技術(Immunofluorescence technique，IFT)通過將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上，使之在與其相應的抗原(或抗體)結合后，于熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應。目前普遍使用的熒光色素是免疫熒光微球和量子點。使用熒光色素標記的抗體作為特異性免疫熒光探針，通過與致病菌結合復合物的熒光強度變化可實現(xiàn)致病菌的定量檢測[12]。

免疫熒光技術具有發(fā)射波長可控、光穩(wěn)定性好、快速、靈敏度高等特點，還可與其他技術相結合進行食源性致病菌的檢測。Xue等[13]將免疫磁性納米粒子和免疫量子點相結合，對大腸桿菌O157∶H7進行定量檢測，2 h內即能檢測到低至14 CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7。Mitchell等[14]應用量子點標記技術檢測大腸桿菌O157∶H7，檢測限為49×10-15mol/L。Hu等[15]采用量子點進行熒光標記檢測金黃色葡萄球菌，檢出限為103CFU/mL，該方法的樣品不需進行預處理與增菌，可直接進行檢測，整個檢測時間約為3 h。此外，法國梅里埃公司的全自動免疫分析儀(VIDAS)的原理即是基于酶聯(lián)熒光免疫分析技術：包被了固相抗體的固相吸附器捕獲樣品中目標菌的特異性抗原，隨后堿性磷酸酶標記的二抗再與目標菌的特異性抗原結合，二抗連續(xù)的堿性磷酸酶將底物水解，產(chǎn)生的磷酸-4-甲基傘形酮在370 nm下能夠產(chǎn)生熒光，將測定的熒光強度與設定閾值的大小進行比較，若高于閾值則判斷結果為陽性，低于閾值則判斷為陰性。王似錦等[16]采用全自動免疫分析儀對保健食品中沙門氏菌進行檢測，檢驗時間可以縮短至48 h。

1.1.4 免疫磁分離技術免疫磁分離技術(Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)作為食品樣品有效的預濃縮技術，能夠快速地從復雜食品基質中選擇性分離和濃縮靶細菌。其主要原理是超順磁性顆粒表面經(jīng)化學修飾后，與靶細菌特異性的活性蛋白質結合制成免疫磁珠(Immunomagnetic beads，IMBs)，然后IMBs上的抗體將會特異性識別與捕獲待檢樣品中的目標菌,形成IMBs-目標菌復合物。最后依靠磁場的作用力快速地使復合物與樣品中其他雜質分離，從而達到高效、精準濃縮目標微生物的目的。

免疫磁分離技術具有特異性強、靈敏度高、分離速度快的特點[17-18]，可與多種其他技術相結合達到快速檢測食源性致病菌的效果。Chen等[19]采用免疫磁分離技術和PCR相結合的方法檢測嬰幼兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌，檢出限達52 CFU/mL，檢測方法靈敏、快速。Zeng等[20]建立了一種免疫磁分離-環(huán)介導等溫擴增(IMS-LAMP)技術檢測牡蠣中副溶血性弧菌的快速方法，該方法特異性良好，經(jīng)8 h前增菌后，最低檢測限達到0.19 CFU/g，檢測時間縮至24 h。寇曉晶等[21]將免疫磁分離技術和ATP發(fā)光技術聯(lián)合用于沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測，與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法有良好的線性相關性，檢測限低至102CFU/mL。Huang等[22]將免疫磁分離技術與熒光納米針橫向流動相結合檢測生乳中的大腸桿菌O157∶H7。使用免疫磁分離技術后，熒光納米針橫向流動試紙條的熒光信號值增強，說明免疫磁分離技術可富集大腸桿菌O157∶H7并減少食品基質的干擾。

免疫學檢測技術是以酶標記的抗體(或抗原)為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物反應的高效性和專一性相結合的一種免疫方法，對標記用酶具有特定要求，如活性高、純度高等;對相應的標記物也有特定要求，如熒光標記物需熒光效率高，與蛋白質結合穩(wěn)定，易于保存等。免疫技術受靈敏度和精確度的限制，一般用來對大量樣本進行初篩，最終精準定量需要借助儀器確認。

1.2 分子生物學檢測技術

分子生物學是從分子水平研究生物大分子的結構與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質的科學，其發(fā)展始于Crick和Watson[23]在1953年提出的雙螺旋結構，標志著現(xiàn)代分子生物學的興起。分子生物學技術具有高靈敏度和特異性，被廣泛用于食源性致病菌的檢測。常用的分子生物學檢測方法有聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR(mPCR)、實時定量熒光PCR(qPCR)、數(shù)字PCR和基因芯片等。

1.2.1 PCR技術PCR技術是最早發(fā)展起來的分子生物學檢測技術，是以變性、退火、延伸為周期循環(huán)進行的體外DNA擴增的過程，可在短時間內使目標基因成倍增加，擴大檢測對象的數(shù)量，從而提高檢測靈敏度。

Rahn 等[24]在1992年第一次設計了一對沙門氏菌invA基因的引物來檢測沙門氏菌，采用此方法檢測了100多個血清型的630株沙門氏菌，對照組由21屬細菌的142個非沙門氏菌菌株組成。結果僅有4株未檢出，檢出率為99.4 %。Pinto等[25]將PCR技術和ELISA技術相結合，對貝類中副溶血性弧菌的一個特異性基因進行擴增，使用生物素標記的寡核苷酸探針捕獲地高辛(DIG)標記的PCR產(chǎn)物，用ELISA方法進行檢測，靈敏度較普通PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳提高了100倍。PCR技術靈敏度高、特異性強，但易受污染，且無法對檢測過程中出現(xiàn)的死亡菌株進行識別，因而可能出現(xiàn)假陽性條帶。

PCR技術也是食源性致病菌快速檢測的常用方法。但該方法的擴增結果不能肉眼直接識別，需要借助凝膠電泳等方法進行表征，在定量豐度低的不可培養(yǎng)微生物時的準確性不強。

1.2.2 多重PCR技術多重聚合酶鏈式反應(Multiplex polymerase chain reaction，mPCR)，是在傳統(tǒng)PCR的基礎上，在同一個PCR反應體系中加入多對特異性引物和模板(引物與相對應的模板特異性結合)同時擴增出多個不同序列的DNA片段。在同一反應體系中擴增多個DNA片段，可同時檢測多種食源性致病菌，減少實驗操作次數(shù)、縮短檢測時間、節(jié)省試劑。

楊國興等[26]選取金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌SipB基因、志賀氏菌ipaH基因和單增李斯特菌inlA基因作為目標基因，設計了4對PCR引物，建立并優(yōu)化了多重PCR反應體系，評價了該體系的特異性和靈敏度，并對人工污染的熟肉樣品進行檢測。結果顯示構建的多重PCR方法特異性強、靈敏度高，人工污染熟肉勻漿中4種致病菌的檢出限為103CFU/mL。熊蘇玥等[27]選取金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的正轉錄調節(jié)蛋白基因(hilA)、大腸桿菌O157∶H7鞭毛基因(flic)、單核細胞增生李斯特氏菌的毒力調控蛋白基因(prfA)及霉菌18S rRNA基因V5區(qū)，分別設計了5對特異性引物，并對PCR擴增反應體系和擴增條件進行優(yōu)化，確定獲得特異性良好的PCR擴增產(chǎn)物。隨后在37 ℃下對人工污染致病菌的香腸、面包和豆腐進行增菌培養(yǎng)，5種致病微生物在20 h內的檢出限均可達到10 CFU/25 g。Yang等[28]將多重PCR與膜芯片技術聯(lián)用，可同時檢測非預包裝即食食品中9種食源性致病菌，綜合檢出限達0.01 ng核酸樣本。

多重PCR技術適合檢測癥狀相同或易污染相同食品的多種食源性致病菌，可使食品中微生物的檢測實現(xiàn)標準化。由于多對引物在同一體系中進行擴增，各對引物之間相互影響，因此多重PCR實際操作過程中的擴增效果和實際擴增的片段數(shù)目往往不盡如人意。

1.2.3 實時熒光定量PCR技術實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)是在PCR體系中加入熒光標記的探針或熒光物質，并通過儀器實時監(jiān)測整個PCR擴增過程中熒光信號的積累，最后通過標準曲線對未知濃度的樣品進行定量分析的方法。

Nadin-Davis等[29]采用qPCR方法，以6個靶基因快速檢測腸道沙門氏菌，對239個家禽設施中的樣本進行測定，結果表明qPCR和普通培養(yǎng)方法在結果上呈現(xiàn)出良好的一致性，且qPCR方法比普通培養(yǎng)方法更省時。目前市面上有一種新型干燥型熒光PCR檢測試劑盒[30]，可對副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7和單增李斯特菌進行檢測，該試劑盒干燥后不影響酶的活性，可常溫運輸保存、運輸，對上述3種食源性致病菌的檢測靈敏度分別為140、380、7 900 CFU/mL，與常見品牌試劑盒效果相當。此外，Alia等[31]開發(fā)了一種獨特的四重實時定量熒光PCR方法，該方法能夠區(qū)分加工肉制品和即食肉制品中4種血清型的單核細胞增生李斯特菌，具有高靈敏度、高特異性和快速的特點，對于識別肉制品加工過程中單核細胞增生李斯特菌的污染來源和即食肉制品中持久性菌株的流行病學監(jiān)測很有意義。張焱鑫等[32]用實時熒光PCR法和國標法對采集的60件畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品和乳及乳制品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌進行同時檢測。結果表明，除金黃色葡萄球菌檢測結果均為陰性外，其他3種致病菌2種方法均有檢出，但實時熒光PCR法的陽性率均高于國標法。

qPCR是一項融合了多種技術的檢測手段，與普通PCR相比,qPCR技術的核酸擴增在封閉系統(tǒng)中完成，擴增完成后不需進行電泳分析，不僅減少了樣品的污染機會，也避免了污染造成的假陽性結果，縮短了檢測時間。具備重復性好、快速、實時性強、靈敏度高、可定量檢測的特點，現(xiàn)已成為食源性致病菌檢測的研究熱點。但實時熒光定量PCR技術實驗成本較高，所需儀器昂貴，需要操作人員具有較高的專業(yè)技術水平。

1.2.4 數(shù)字PCR技術數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)技術是將qPCR體系等量均分到相互隔離的大數(shù)量(多數(shù)大于10 000個)微小的反應單元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想狀態(tài)下一個反應體系中至多包含一個待測核酸分子。dPCR的反應過程與qPCR相似，擴增后的核酸分子在熒光下顯示熒光信號(表示為“1”)，或沒有熒光信號(表示為“0”)，通過泊松分布對熒光信號“0”和“1”進行統(tǒng)計分析，即可實現(xiàn)對核酸含量的測定。dPCR不需要建立標準曲線，無需通過Ct值(PCR熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))進行濃度比較，被認為是一種絕對定量的方法[33-35]。數(shù)字PCR原理示意圖見圖2。微滴式數(shù)字PCR((Droplet digital PCR，ddPCR)是一種將單個目標DNA分子分散到多個分離的液滴中，經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微液滴進行檢測，精確定量DNA拷貝數(shù)的新方法。在ddPCR檢測中，目標DNA分子的分布服從泊松統(tǒng)計，這意味著大多數(shù)反應要么包含一個目標，要么不包含目標。理想情況下，ddPCR陽性反應的數(shù)量等于最初存在的模板DNA分子的數(shù)量[36]。

圖2 數(shù)字PCR原理示意圖Fig.2 Principle diagram of digital PCR

馬薇等[37]以大腸菌群的lacZ基因為靶基因，建立了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的ddPCR定量檢測方法，可檢出每μL單個拷貝數(shù)的大腸菌群lacZ基因組DNA。方佩佩等[38]用微滴式數(shù)字PCR技術建立了副溶血性弧菌的快速定量檢測方法。結果表明，該法檢測特異性好，副溶血性弧菌有效基因組DNA濃度范圍為2～19 440拷貝/20 μL，分析得菌懸液濃度為50～4.86×105CFU/mL，與3M測試片所得菌懸液濃度無顯著性差異；與熒光PCR相比，ddPCR可以進行更低濃度檢測且能準確定量。Li等[39]采用一種ddPCR方法對蘋果汁、牛奶和菠菜洗液中的大腸埃希氏菌O157∶H7和O104∶H4進行定量檢測，在蘋果汁中的檢出限達2 CFU/mL。鄧雪蕾等[40]設計制作了一種基于聚二甲基硅氧烷-玻璃的多功能集成式ddPCR芯片，對副溶血性弧菌基因組DNA進行絕對定量，定量的線性范圍跨越5個數(shù)量級，檢測結果與理論參考濃度間具有良好的相關性。

數(shù)字PCR技術具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優(yōu)點，已在稀有突變檢測和復雜樣本基因表達檢測等方面得到廣泛的應用。

1.2.5 基因芯片技術基因芯片(Gene chip，GC)是一種新型的分子生物學檢測技術。GC通過采用原位合成或顯微點樣技術將大量DNA探針有規(guī)律地固化于玻璃芯片或硅芯片載體上，然后與待測標記樣品按堿基配對原理雜交，經(jīng)放射自顯影、激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等掃描芯片，對雜交信號進行檢測分析，獲得樣品的基因序列、基因表達等遺傳信息[41-42]。

近年來，采用基因芯片技術對食源性致病菌進行檢測的研究逐漸增多，Suo等[43]利用基因芯片與多重PCR相結合的技術檢測了大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌的3個種、空腸彎桿菌以及單核細胞增生李斯特菌。Day等[44]利用懸浮芯片系統(tǒng)對單核細胞增生李斯特菌進行檢測，使用磁性微球-抗體偶聯(lián)物對單核細胞增生李斯特菌上存在的特異性膜蛋白進行識別，可在24 h內識別哈密瓜和包裝沙拉中的單核細胞增生李斯特菌，最低檢出限達到100CFU/g?；蛐酒夹g的自動化程度高，可一次分析大量樣品，數(shù)據(jù)客觀可靠。但成本昂貴、檢測靈敏度較低、重復性差，分析泛圍較狹窄。

1.2.6 環(huán)介導等溫核酸擴增技術環(huán)介導等溫核酸擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物,并利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(65 ℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，具有高特異性和等溫快速擴增的特點。

LAMP技術是Notomi等[45]于2000年開發(fā)的一種靈敏度高、檢測時間短的核酸擴增方法。近年來越來越多被應用于食源性致病菌檢測。關玉婷等[46]根據(jù)沙門氏菌特異性靶基因腸毒素stn基因設計了4條LAMP引物，建立的LAMP方法僅需30 min即可得到準確結果，可視化LAMP方法對3株沙門氏菌和8株非沙門氏菌表現(xiàn)出良好的檢測特異性。杜琳等[47]針對金黃色葡萄球菌的TRAP基因設計LAMP引物，建立了金黃色葡萄球菌的LAMP測定方法，與生鮮乳中常見的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌無交叉反應，靈敏度為10 CFU/mL。Babu等[48]采用LAMP技術對致病性彎曲桿菌進行快速檢測，樣本包括純培養(yǎng)物和陽性污染的即食食品，最低檢出限達6 CFU每反應。Garrido-Maestu等[49-50]建立了基于環(huán)介導等溫擴增技術檢測不同類型食物中單核細胞增生李斯特菌的方法，檢出限可低于10 CFU/25 g。Xu等[51]針對不同乳制品中的常見食源性致病菌，基于LAMP建立了便捷、快速、高效的檢測方法，整個擴增過程可在30 min內完成，最低檢出限可到1拷貝。

LAMP是一種實用價值及檢測效率很高的等溫擴增技術,同時也存在著明顯的缺點：如加入環(huán)引物后，可能出現(xiàn)假陽性結果；雖然可借助各種方式減少假陽性發(fā)生的頻率，但依舊無法避免其對引物設計要求高、難度大的缺陷；LAMP不適用于擴增較長片段，因為其產(chǎn)物不均勻，擴增產(chǎn)物組成復雜，多種長度片段共存的產(chǎn)物起不到再次驗證擴增特異性的作用，且在反應體系中容易被污染[52]。

1.3 生物傳感器檢測技術

生物傳感器(Biosensor)是一種對生物物質敏感并可將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，是以固定化的生物敏感材料作識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質)，由適當?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等)及信號放大裝置構成的分析工具或系統(tǒng)。根據(jù)工作原理不同，生物傳感器可以分為：光學生物傳感器、電化學生物傳感器、酶生物傳感器、物理生物傳感器、機械生物傳感器等。生物傳感器檢測技術由于高靈敏度、高特異性的特點，被廣泛用于食源性致病菌的檢測。下面主要介紹使用較多的光學生物傳感器和電化學生物傳感器。

1.3.1 光學生物傳感器光學生物傳感器(Optical biosensors)檢測技術憑借檢測快速和靈敏度高的特性被廣泛應用于食源性致病菌檢測。光學傳感器可通過折射率的原位檢測或通過細菌細胞附著在傳感器表面受體上的厚度來區(qū)分食品中的微生物。光學傳感器還包括一種可生物降解的聚合物，由微生物在天然產(chǎn)物代謝過程中產(chǎn)生的酶組成。目前主要的光學傳感技術有比色、熒光、化學發(fā)光和表面等離子共振等。

Shang等[53]開發(fā)了一種基于化學發(fā)光的光學生物傳感器檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌，在優(yōu)化條件下，對牛奶中單核細胞增生李斯特菌的檢測時間僅為40 min，最低檢測濃度達到1.1 logCFU/mL。Kim等[54]發(fā)明了一種可視化的比色生物傳感器來檢測嬰幼兒乳粉中的阪崎腸桿菌，在最優(yōu)條件下，30 min內能直觀檢測到的最低濃度為7.1×103CFU/mL。Mudgal等[55]用BaTiO3-石墨烯-親和層表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)檢測假單胞菌，檢測時間為25 min，檢出限為7.09 logCFU/mL。

1.3.2 電化學生物傳感器電化學生物傳感器(Electrochemical biosensor)通常將抗體、酶、適體、多肽等生物敏感物質或細胞器、細胞、組織等生物組分作為識別元件，電極作為轉換元件。將生物識別元件通過生物固定化技術固定在電極上后，生物分子間特異性識別產(chǎn)生的各種物理、化學等信號將由電極轉換成電阻、電位、電流或電容等物理量形式并作為特征檢測信號輸出，從而實現(xiàn)被測物的檢測[56]。根據(jù)固定在電極表面的生物識別元件不同，電化學生物傳感器可分為電化學酶傳感器、電化學免疫傳感器、電化學DNA傳感器、電化學適體傳感器、電化學多肽傳感器等[57]。

Saini等[58]利用特異性的NH2標記探針建立了一種基于DNA的納米傳感器，用于檢測牛奶樣品中腸炎沙門氏菌的stn基因。采用循環(huán)伏安法(CV)和微分脈沖伏安法(DPV)進行電化學表征，DPV檢測靈敏度為728.42 (μA/cm2)/ng，檢測下限為1.8 pg/6 μL (0.3 pg/mL)。Sobhan等[59]用多克隆抗體成功固定了一種單壁碳納米管生物傳感器，在泡菜中檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌，最低檢出限達104CFU/mL。Silva等[60]開發(fā)了一種在蘋果汁中檢測傷寒沙門氏菌的方法，該方法使金納米粒子聚合物與包裹膜上的電位生物傳感器結合，最低檢出限達6 CFU/mL。Ge等[61]建立了一種簡便的鼠傷寒沙門氏菌電化學檢測傳感器，靈敏度達16 CFU/mL，線性范圍為20～2×108CFU/mL，具有良好的信號放大性能，重復性好，基質效應低。

1.4 代謝學檢測技術

代謝學檢測技術是食源性致病菌檢測的一種常用技術手段。其原理是利用各種技術檢測不同致病菌在特定培養(yǎng)環(huán)境下產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的量和種類的變化特征以對該致病菌進行鑒定。按照檢測技術不同，分為電阻抗技術、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光技術、放射測量技術和微熱量計技術等。下面對使用較多的電阻抗技術和ATP生物發(fā)光技術進行介紹。

1.4.1 電阻抗技術電阻抗技術依據(jù)微生物在生長過程中代謝活動的不同，通過電阻抗技術對微生物進行檢測鑒定。Dong等[62]改進了電阻抗檢測技術，使用金納米顆粒和聚胺多壁碳納米管-殼聚糖納米復合膜修飾玻碳電極(AuNPs/PAMAM-MWCNT-Chi/GCE)來檢測牛奶中的沙門氏菌，與僅用六氰化鐵氧化還原電極的阻抗檢測法相比，靈敏度提高至5.0×102CFU/mL。Tan等[63]在用聚二甲基硅氧烷(PDMS)阻抗免疫生物傳感器檢測金黃色葡萄球菌時，選取多孔氧化鋁膜固定抗體，檢測靈敏度為102CFU/mL。Dweik等[64]證實，采用阻抗免疫生物傳感器檢測大腸桿菌O157∶H7時，其抗原抗體結合率與反應時間之間不存在明顯的線性關系，反應60 min后，抗原抗體結合率最高。Chowdhury等[65]使用阻抗免疫生物傳感器檢測大腸桿菌O157∶H7，選取聚苯胺(PANI)作為工作電極，檢測線性范圍為102～107CFU/mL。

1.4.2 ATP生物發(fā)光技術ATP生物發(fā)光技術利用活菌內含有ATP，當細菌死亡后其內的ATP被細胞內酶分解，應用熒光素和熒光素酶可使之釋放能量并產(chǎn)生熒光，且熒光量與ATP濃度成正比的原理進行檢測。因此，通過測定ATP濃度即可推算出活菌總數(shù)[66-67]。Chang等[68]在最佳的ATP再生條件下偶聯(lián)生物發(fā)光法，對ATP標準品、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的檢測限分別為10-17mol/mL、102CFU/mL和102CFU/mL。該方法無需對樣本中的微生物進行培養(yǎng)，操作簡便、快捷且測定范圍廣，由于檢測的是食品中的活菌總數(shù)，更能準確反映食品衛(wèi)生的真實情況。其不足之處在于：易受溫度、酸堿等因素影響，食品和ATP提取劑含有的某些離子會干擾測定；不能進行細菌鑒定；靈敏度有待提高；僅適用于細菌含量高的物質。該方法無特異性，但可通過用免疫磁分離技術(IMS)捕獲靶細菌再進行熒光測定進行克服[69]。

1.5 核酸適配體檢測技術

核酸適配體(Aptamer)是從包含隨機序列的巨大核酸分子庫中篩選出來的一種單鏈DNA或RNA配體，是一段能特異性識別并結合靶分子的15～90個堿基寡核苷酸片段。這些特異性選擇的核酸序列可以結合廣泛的非核酸靶點，并且具有高親和力和高特異性。同時，所選已知序列的適配體可批量制備，易于官能團修飾，與生物分子或熒光標記結合的穩(wěn)定性好。適配體的這些獨特特性[70]，為快速高效的食源性致病菌現(xiàn)場即時檢測提供了巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

適配體的選擇過程稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)，由兩個獨立的研究小組于 1990 年開發(fā)[71-72]。SELEX 是適配體選擇的一個重要工具，為適配體和基于適配體技術的發(fā)展奠定了基礎。SELEX 過程包含多個循環(huán)，每個循環(huán)包含4個步驟：(1)將寡核苷酸庫與目標物孵育；(2)將與目標物結合和未結合的核酸序列分離，并刪除未與目標物結合的序列；(3)將與目標物結合的序列用洗脫緩沖液洗脫下來；(4)將洗脫下來的序列作為后續(xù)聚合酶鏈反應(PCR)的模板，進行 PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物作為下一輪篩選的寡核苷酸庫，按上述步驟進行多達20輪的篩選，直到獲得具有高靶親和力的適配體序列庫[73]，這些適配體可以被克隆并測序。一般來說，一個隨機的寡核苷酸庫包含 40～100個單鏈核苷酸序列，每個序列的中間部分為隨機序列的核苷酸，兩端為固定序列。

SELEX 技術已被應用于篩選致病菌的適配體。目前已有較多的常見致病菌篩選出核酸適配體，比如大腸桿菌[74]、副溶血弧菌[75]、鼠傷寒沙門氏菌[76]、單增李斯特菌[77]。與傳統(tǒng)的抗體生成過程相比，SELEX可以在相對較短的時間內有效地生成針對各種分析物的特異性核酸探針。更重要的是，所選擇的適配體的特殊性質，如易于規(guī)模合成、易于修飾和長期穩(wěn)定性等，使適配體成為傳統(tǒng)抗體的理想替代品。

1.5.1 納米金適配體技術納米金適配體技術是核酸適配體與納米金技術結合，構建的高靈敏度、高特異性的快速檢測技術。當目標菌存在時，適配體作為識別與捕獲因子特異性地結合目標菌，并引起納米金狀態(tài)發(fā)生改變?；跔顟B(tài)變化，可對目標菌進行定性與定量分析。

Jia等[78]將銅綠假單胞菌的適配體與超順磁性氧化鐵納米粒子共價結合，通過在加入目標菌后測量自旋-自旋弛豫間(T2)的增加對靶物質進行定量測定。該法已應用于雞肉與飲用水樣品中銅綠假單胞菌的檢測，檢測可在40 min內完成，檢測限為50 CFU/mL。Chen等[79]利用雙適配體修飾的牛血清蛋白可穩(wěn)定金納米團簇并增強細菌對過氧化物酶類的活性，開發(fā)了一種快速檢測沙門氏菌的方法，最低檢出限達1 CFU/mL。Li等[80]提出了一種新的表面增強拉曼散射響應方法，該法基于適配體、互補DNA、對氨基噻吩(PATP)和金納米棒對食源性致病菌進行檢測。在最優(yōu)條件下，表面增強拉曼散射信號與鼠傷寒沙門氏菌濃度在56～56×107CFU/mL范圍內線性相關，檢出限為9 CFU/mL。

1.5.2 熒光適配體技術熒光適配體技術是將核酸適配體與熒光標記技術結合，基于適配體與相應食源性致病菌作用后發(fā)生的熒光強度變化檢測食源性致病菌。利用熒光基團或猝滅基團修飾適配體，加入目標菌后，適配體構象發(fā)生的改變可引起熒光信號的變化。

Jiang等[81]基于金屬有機骨架材料的熒光猝滅特性以及對核酸適配體的吸附性，結合核酸適配體的高親和力與高特異性識別能力，構建了特異性識別沙門氏菌的新方法，熒光信號與沙門氏菌濃度的對數(shù)在101～105CFU/mL范圍內呈良好的線性關系，檢出限為7 CFU/mL。Maeng等[82]根據(jù)RNA適配體熒光強度的變化，開發(fā)了金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測系統(tǒng)，將篩選出的RNA適配體通過硫醇基團固定在銀膜上，RNA適配體捕獲的細菌可通過添加適配體和攜帶有熒光素基團的胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dT-FAM)的復合物后導致的熒光發(fā)射量的增加而被檢測。該方法操作簡捷、快速、特異性強。Huang等[83]通過磁選技術的12輪篩選，在體外獲得了親和度高、選擇性好的可與金黃色葡萄球菌腸毒素A結合的核酸適配體，用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的腸毒素A的檢測，檢出限為8.7×10-3μg/mL。

1.5.3 電化學適配體技術電化學適配體技術通過將核酸適配體與電化學技術結合，使適配體與電化學活性傳感元件固定在電極上。有目標菌存在時，適配體與目標菌結合導致電極表面修飾物結構改變，可通過檢測電化學信號或電流變化進行定性與定量檢測。

Luo等[84]建立了檢測大腸桿菌O111的電化學適配體生物傳感器技術，先將捕獲探針通過Au-硫醇錨定在電極表面上，適配體因與捕獲探針雜交被固定在金電極表面，當目標菌存在時，適配體會識別、結合目標菌并脫離捕獲探針，捕獲探針與標記生物素的檢測探針結合后留在電極表面，并在加入識別元件鏈霉抗堿性磷酸酶后產(chǎn)生電化學信號。該技術可在3.5 h內實現(xiàn)對目標致病菌的精確定量，對牛奶樣品中目標菌的檢測限為305 CFU/mL，是一種特異性強、準確性高、靈敏、快速的檢測技術。Abbaspour等[85]設計了一種基于雙適配體的電化學夾心傳感器測定法檢測金黃色葡萄球菌，該方法通過固定在磁珠表面上的初級適配體捕獲金黃色葡萄球菌，而與銀納米顆粒綴合的次級適配體可提供限定的電化學特性，顯著提高了檢測靈敏度，應用釋放的Ag+離子進行差示脈沖陽極溶出伏安(DPV)信號的測量，實現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的定性與定量檢測。該方法靈敏度高，為采用適配體常規(guī)檢測方法無法檢測的微量細菌的檢測提供了新方法。

2 食源性致病菌快速檢測方法存在的問題及展望

近年來，多學科和各種技術的交匯發(fā)展、食品檢驗體量的增加、各種會議保障的需求等因素，促進了食源性致病菌快速檢測方法的開發(fā)。但是各種食源性致病菌快速檢測方法各有優(yōu)缺點：免疫學方法成本低、操作簡單，但靈敏度有待提高，且易出現(xiàn)假陽性；分子生物學技術雖然快速高效，但存在價格昂貴，基因測序還不完全等不足；代謝學檢測技術具有快速、簡便的優(yōu)點，但需要大量的數(shù)據(jù)支撐，易受環(huán)境因素的影響；生物傳感器和核酸適配體技術具有較強的特異性和選擇性?？偟膩碚f，食源性致病菌快速檢測方法具有特異性高、靈敏度高、成本低，對操作人員及環(huán)境和儀器要求低，檢測速度快等優(yōu)點，適合大量樣品的快速篩查，能將食品安全問題遏制在進入消費者餐桌的前端，是保障食品安全和防控食源性致病菌感染的重要技術支撐。

各種技術的改進和創(chuàng)新提高了快速檢測技術的準確性，解決了部分專業(yè)局限性的問題，為食源性致病菌快速檢測技術的發(fā)展和應用提供了機遇。如分子生物學技術的飛速發(fā)展帶來的高通量及絕對定量的檢測分析技術，以蛋白質組學為基礎的飛行時間質譜技術的發(fā)展和應用及膠體金技術與多學科的結合等，這些技術雖然還存在各方面的不足，需要進一步的改進和拓展，但在未來，隨著生物傳感器技術、核酸適配體技術、免疫學技術等各種檢測技術的不斷發(fā)展，食源性致病菌快速檢測技術的準確度和靈敏度將逐步提高，檢測成本將逐步降低，并最終應用于日常檢測監(jiān)管中，不斷提高人們的食品安全等級。