楊 陽，劉光勤，楊思龍，艾雪蓮，梁秋紅， 羅林頻，汪 蓉，王建龍，張文濤

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

抗壞血酸(AA)又被稱為維生素C(Vc)，是一類具有烯二醇結(jié)構(gòu)的還原性物質(zhì)?？箟难嵩诰S持人體正常生理機(jī)能中扮演著重要角色[1-2]，適量的攝入抗壞血酸有利于增強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力和免疫力，促進(jìn)鈣、鐵、葉酸等的吸收，預(yù)防癌癥與心血管疾病等。此外，抗壞血酸作為一種抗氧化劑也被廣泛用于醫(yī)療制藥、食品加工和化妝品等領(lǐng)域[2]。但人體自身不能合成抗壞血酸，只能從外界攝取，因此檢測(cè)食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中的抗壞血酸含量是非常有必要的。目前常見的抗壞血酸檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳法[3]、色譜法[4]、熒光法[5]以及電化學(xué)法[6]等，這些方法雖靈敏度高、特異性強(qiáng)，但其昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜費(fèi)時(shí)的操作過程限制了進(jìn)一步應(yīng)用?；诩{米酶的比色法因具有檢測(cè)成本低、操作簡單、無需專業(yè)人員的優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。

天然酶大多是蛋白質(zhì)和RNA，在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件下易變性失活，失去催化活性，且天然酶不易提取或提取費(fèi)用高。納米酶具有合成簡單、制備成本低、可回收利用、對(duì)極端反應(yīng)條件耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有望作為天然酶的替代品。盡管近年來納米酶領(lǐng)域已取得了很大發(fā)展，但納米酶的催化能力弱于天然酶，且特異性差[7]，這些缺點(diǎn)限制了納米酶在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，因此尋求具有優(yōu)異催化性能的納米材料是目前的研究熱點(diǎn)。金屬有機(jī)骨架(MOFs)也稱多孔配位聚合物(PCPs)，是一種新型晶態(tài)微孔材料，具有比表面積大、孔隙率高、孔道形狀及尺寸可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，已被廣泛用于納米酶的開發(fā)。迄今為止，大量的MOFs材料(如Fe-MOFs[10]、Cu-MOFs[11]、Co-MOFs[12]、Zn-MOFs[13]、Zr-MOFs[14]、Ce-MOFs[15]等)被開發(fā)作為納米酶用于生物傳感、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。這些MOFs材料的活性催化中心高度依賴于具有氧化還原活性的多價(jià)態(tài)金屬元素，因此以多金屬或多價(jià)態(tài)金屬作為活性中心是開發(fā)高性能納米酶的一個(gè)可行策略。

本文以對(duì)苯二甲酸(H2BDC)為有機(jī)配體，Ce為活性金屬中心合成了一種金屬有機(jī)框架材料Ce-BDC。Ce-BDC可模擬氧化物酶活性并催化3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)生成氧化反應(yīng)產(chǎn)物oxTMB，溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色并在652 nm處出現(xiàn)很強(qiáng)的紫外吸收峰?？箟难岬募尤肟梢赃€原oxTMB，從而使溶液藍(lán)色減弱且在652 nm處的紫外吸收值下降，本文基于此建立了一種檢測(cè)成本低、操作簡單、靈敏、迅速、選擇性好的檢測(cè)抗壞血酸的比色方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀、XRD粉末衍射儀(德國布魯克公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；X射線光電子能譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；高速冷凍離心機(jī)(北京儀諾科興科技發(fā)展有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；pH計(jì)(美國梅特勒-托利多儀器公司)；超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司)；分析天平(中國奧豪斯儀器公司)。

對(duì)苯二甲酸(H2BDC，99%)、抗壞血酸(AA，≥99.7%)、酒石酸(TA，≥99%)、檸檬酸(CA，≥99.5%)、谷氨酸(Glu，≥98.5%)、天冬氨酸(Asp，99%)、果糖(≥99%)、淀粉(≥99%)、蔗糖(≥99%)等均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。乙酸(≥99%)、醋酸鈉(≥99%)、氫氧化鈉(98%)、氯化鈉(≥99.5%)、氯化鉀(≥99.5%)、氯化鈣(≥96%)、氯化鐵(≥99%)、氯化鎂(≥98%)、氯化鎳(≥98%)、氯化銅(≥99%)、氯化錳(≥99%)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硝酸鈰銨、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。復(fù)合果汁購自楊凌示范區(qū)當(dāng)?shù)爻?。所有試劑均為分析純，?shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ce-BDC的制備采用改進(jìn)的水熱法合成Ce-BDC：首先，將0.548 g硝酸鈰銨溶于2 mL水中，0.166 g有機(jī)配體對(duì)苯二甲酸溶于6 mL DMF中，然后將硝酸鈰銨溶液緩慢加入到盛有對(duì)苯二甲酸的燒杯中，加熱至100 ℃并保持?jǐn)嚢?5 min，自然冷卻至室溫，離心得淡黃色沉淀。沉淀再用DMF洗滌3次，并用丙酮浸泡過夜，隨后放入80 ℃真空干燥箱中干燥2 h，最后得到淡黃色Ce-BDC(產(chǎn)率約72.6%)。

1.2.2 Ce-BDC的氧化物酶活性研究分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組實(shí)驗(yàn)。其中實(shí)驗(yàn)組依次加入醋酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 3.0)，不同濃度的Ce-BDC和TMB(20 mmol/L)；對(duì)照組中只加入TMB和緩沖液。兩組均于室溫下反應(yīng)10 min后，分別用紫外分光光度計(jì)在時(shí)間-掃描模式下監(jiān)測(cè)其光譜。

1.2.3 Ce-BDC的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究反應(yīng)體系為加入一定體積緩沖液(pH 3.0)、10 μL 1 mg/mL的Ce-BDC和不同濃度TMB溶液，最終反應(yīng)體系的總體積為200 μL，溶液混合均勻后，用紫外分光光度計(jì)在時(shí)間-掃描監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)溶液在652 nm處的吸光度值。動(dòng)力學(xué)參數(shù)根據(jù)米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S]) 計(jì)算，其中V代表催化反應(yīng)的初始速度；Vmax表示該反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度；Km表示米氏常數(shù)。

1.2.4 抗壞血酸的檢測(cè)向反應(yīng)體系中依次加入醋酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 3.0)、Ce-BDC(90 μg/mL)、TMB(1 mmol/L)以及一系列不同濃度的抗壞血酸溶液，反應(yīng)體系總體積為500 μL。將反應(yīng)體系置于室溫下孵育2 min，孵育結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)掃描其在300～800 nm下的吸收光譜，取652 nm處的吸光度值與抗壞血酸濃度繪制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ce-BDC的結(jié)構(gòu)表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)獲得了制備的Ce-BDC尺寸大小和形貌(圖1A)，圖中可見Ce-BDC呈較為均勻的納米顆粒狀，其直徑約150～180 nm。再采用XRD表征材料的晶體結(jié)構(gòu)(圖1B)，發(fā)現(xiàn)該材料具有明顯的晶形結(jié)構(gòu)，其出現(xiàn)的峰可與UIO-66(Zr-BDC)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜峰對(duì)應(yīng)。進(jìn)一步采用XPS分析Ce-BDC中Ce的化學(xué)價(jià)態(tài)組成(圖1C)，發(fā)現(xiàn)917.5、908.6、905.2、902.3 eV處的峰與Ce4+的特征峰對(duì)應(yīng)，899.1、889.0、886.2、883.7 eV處的峰與Ce3+的特征峰對(duì)應(yīng)[15]。由此表明，具有雙價(jià)態(tài)金屬活性中心的金屬有機(jī)框架材料Ce-BDC已成功合成。

圖1 Ce-BDC的結(jié)構(gòu)表征Fig.1 Structural characterizations of the Ce-BDC A:SEM images(SEM圖像),B:XRD patterns(XRD圖譜),C:XPS spectra of the Ce 3D regions(Ce 3D區(qū)域的XPS譜圖)

2.2 Ce-BDC氧化物酶的現(xiàn)象研究

為研究Ce-BDC的氧化物酶催化活性，選擇TMB為顯色底物[16]。由圖2A插圖可知，Ce-BDC/TMB體系在652 nm處有一個(gè)明顯的吸收峰且溶液呈藍(lán)色，而單純的TMB和Ce-BDC溶液在652 nm處則無吸收峰和相應(yīng)的藍(lán)色溶液，表明Ce-BDC催化無色的TMB生成了藍(lán)色氧化態(tài)的TMB，即Ce-BDC具有氧化物酶的催化活性。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化為了研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響，監(jiān)測(cè)了一系列濃度的Ce-BDC和TMB (1 mmol/L)混合溶液在652 nm處的吸光度值隨著時(shí)間的變化情況(圖2B)。結(jié)果顯示，在相同時(shí)間點(diǎn)下，Ce-BDC濃度越大，652 nm處的吸光度值越大，說明催化劑濃度越大反應(yīng)速率越大。在0～120 s范圍內(nèi)，652 nm處的吸光度隨著時(shí)間的逐漸延長而增大，120 s后吸光度基本保持不變，這可能是因?yàn)榈孜颰MB隨著時(shí)間消耗的越來越多，并在120 s時(shí)達(dá)到平衡。因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為120 s。

2.3.2 溫度的優(yōu)化為了研究溫度對(duì)Ce-BDC氧化物酶活性的影響，監(jiān)測(cè)了Ce-BDC(90 μg/mL)和TMB (1 mmol/L)混合溶液在不同溫度下(20～80 ℃)反應(yīng)2 min后在652 nm處的吸光度值(圖2C)。結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)體系溫度的升高，Ce-BDC的氧化物酶活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)溫度超過30 ℃時(shí)，Ce-BDC的氧化物酶活性開始下降。且在30～50 ℃溫度范圍內(nèi)，氧化物酶活性的下降幅度較小，在60～80 ℃溫度范圍內(nèi)，氧化物酶活性的下降幅度明顯增大，因此選擇最適的反應(yīng)溫度為30 ℃。

2.3.3 pH值的優(yōu)化Ce-BDC的氧化物酶活性和其他基于納米材料的酶模擬物一樣，也受pH值的影響。pH值對(duì)Ce-BDC氧化物酶活性的影響可通過Ce-BDC(90 μg/mL)/TMB (1 mmol/L)體系在不同pH值緩沖液孵育2 min所測(cè)得的652 nm處的吸光度值來評(píng)估(圖2D)。結(jié)果顯示，pH值對(duì)Ce-BDC的氧化酶活性的影響較大。當(dāng)pH值小于3.0時(shí)，隨著pH值的增大，Ce-BDC的氧化酶活性緩慢上升；當(dāng)pH值超過3.0時(shí)，Ce-BDC的氧化酶活性隨著pH值的增大反而下降。因此選擇反應(yīng)體系的pH值為3.0。如無特殊說明，此實(shí)驗(yàn)均在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行。

2.4 Ce-BDC模擬酶活性的動(dòng)力學(xué)研究

為進(jìn)一步評(píng)估Ce-BDC的模擬氧化物酶活性，實(shí)驗(yàn)對(duì)其氧化物酶的米氏動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究(圖3)。結(jié)果顯示，Ce-BDC的酶催化活性遵循穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，經(jīng)計(jì)算得Ce-BDC對(duì)底物TMB的Km和Vmax分別為0.393 89 mmol/L和1.8 μm·s-1，Ce-BDC材料表現(xiàn)出較低的Km值，Km越小，表明酶對(duì)該底物的親和能力越大，有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行。因此Ce-BDC對(duì)TMB具有較強(qiáng)親和力，在代替天然氧化酶應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著較大研究前景。

在已有研究中，以Ce為活性金屬中心的納米酶材料的氧化活性很有可能基于Ce3+/Ce4+兩種價(jià)態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化[15,17]。當(dāng)TMB顯色劑加入反應(yīng)體系后，TMB被氧化使溶液呈藍(lán)色，Ce4+隨后自身被還原為Ce3+,生成的Ce3+又自發(fā)被氧化成Ce4+。因而推測(cè)Ce-BDC的納米酶活性可能是來自于Ce3+/Ce4+。

2.5 檢測(cè)抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

基于Ce-BDC的氧化物酶活性建立了檢測(cè)抗壞血酸的比色方法(圖4)，結(jié)果顯示，反應(yīng)體系在652 nm處的吸光度值(A)隨著抗壞血酸濃度(c,mol/L)的增大呈下降趨勢(shì)，且在1.0～30 μmol/L范圍內(nèi)吸光度與抗壞血酸濃度呈線性關(guān)系，線性方程為A=-2.64×104c(mol/L)+0.815 4，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.991 4。當(dāng)抗壞血酸濃度為30 μmol/L時(shí)，體系呈無色(4A插圖)且在652 nm處無吸收峰。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得抗壞血酸的檢出限為0.32 μmol/L。

圖5 抗壞血酸檢測(cè)的選擇性測(cè)試Fig.5 Selective test of ascorbic acid detection

2.6 選擇性研究

考慮到果汁樣品中可能存在某些物質(zhì)干擾抗壞血酸的檢測(cè)，因此選擇果汁中的常見離子(K+、Na+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+)、檸檬酸(CA)、酒石酸(TA)、糖類(果糖、蔗糖)、氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)。于Ce-BDC和TMB的醋酸鹽緩沖液(pH 3.0)體系中，分別添加抗壞血酸(20 μmol/L)和其他干擾物質(zhì)(200 μmol/L)，混勻，在室溫下孵育2 min后再對(duì)其紫外可見光吸收光譜掃描(圖5)。結(jié)果顯示，10倍含量的上述物質(zhì)基本不干擾抗壞血酸的測(cè)定，表明方法對(duì)抗壞血酸具有良好的選擇性。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

取市售果汁樣品以12 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上清液用醋酸鹽緩沖液稀釋50倍，在反應(yīng)體系中加入Ce-BDC、TMB以及一系列不同濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、10、15、20 μmol/L)，于室溫下孵育2 min，采用紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)體系在300～800 nm下的吸收光譜，取波長為652 nm處樣品溶液的吸光度，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。結(jié)果顯示：3個(gè)添加水平下抗壞血酸的平均值分別為9.82、15.36、20.22 μmol/L，回收率為98.2%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～7.2%。該結(jié)果與抗壞血酸試劑盒(MAK074, Sigma)的檢測(cè)結(jié)果(10.01、15.13、19.91 μmol/L)能夠較好地吻合，表明方法可用于果汁中抗壞血酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

3 結(jié) 論

本文以對(duì)苯二甲酸(H2BDC)為有機(jī)配體，Ce為活性金屬中心制備了一種具有氧化物酶活性的Ce-BDC，利用Ce-BDC可以催化顯色底物TMB生成氧化反應(yīng)產(chǎn)物oxTMB，然后抗壞血酸可將oxTMB還原，反應(yīng)過程中oxTMB的消耗導(dǎo)致溶液在652 nm處吸光度的下降，從而建立了抗壞血酸的比色檢測(cè)方法。該比色方法具有檢測(cè)成本低、操作簡單、靈敏、迅速、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，為抗壞血酸的檢測(cè)提供了新方法。