丁 園，秦 爽，劉偉美，王鳴華，華修德

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

滴滴涕(Dichlorodiphenyltrichloroethane,DDT)和硫丹均為有機(jī)氯類殺蟲劑，由于具有較高的殺蟲活性，同時(shí)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低廉，曾在第二次世界大戰(zhàn)后被廣泛、大量的使用。DDT具有持久性有機(jī)污染物的 4 個(gè)屬性(持久性、生物富集性、跳躍性和毒性)，對(duì)野生動(dòng)物，尤其是鳥類和魚類危害極大[1]。雖然已被限制使用40多年，但DDT在地球上仍無處不在[2-4]，依然可以通過食物鏈在人體中富集[5-6]?！吨袊称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)》規(guī)定DDT在不同食品中的再殘留限量范圍為0.02～2 mg· kg-1[7]。硫丹由于其劇毒性、生物蓄積性和內(nèi)分泌干擾素作用，在2011年被列入《斯德哥爾摩公約》持久性有機(jī)污染物清單，目前已被50多個(gè)國家禁用，但與DDT一樣，在全球各地均能檢測(cè)到硫丹殘留[8-9]，對(duì)人類健康具有不容忽視的潛在威脅。目前，硫丹在不同食品中的最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)范圍為0.01～10 mg· kg-1[7]。水胺硫磷是高毒性有機(jī)磷類農(nóng)藥，目前中國已禁止其在蔬菜和水果上的施用，但在棉花和水稻中仍被廣泛使用[10]，其在不同食品中的MRL值在0.01～0.05 mg· kg-1之間[7]。因此，檢測(cè)殘留在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的DDT、硫丹和水胺硫磷對(duì)保障生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。

目前，儀器法是DDT、硫丹和水胺硫磷殘留檢測(cè)的常用方法，如氣相色譜法(Gas chromatography,GC)[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[18]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]等。此外，基于特異性抗體的免疫分析方法已成功用于農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)[20-22]。相比于儀器檢測(cè)，免疫分析具有快速、簡便、成本低及可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)，十分符合我國國情。其中，間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)是最常用的免疫分析方法，其基本策略是將競(jìng)爭(zhēng)抗原固定在微孔板中，加入抗原特異性抗體和待測(cè)樣品，使競(jìng)爭(zhēng)抗原與分析物共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，洗去多余試劑后，加入酶標(biāo)二抗測(cè)定與競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合的抗體，從而計(jì)算出待測(cè)樣品中分析物的濃度。

抗體是免疫分析的核心試劑，其質(zhì)量決定免疫分析方法的特性。單克隆抗體具有均一性好、特異性強(qiáng)、可大量制備等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)藥等污染物免疫分析最常用的抗體。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已有研究研制出DDT、硫丹和水胺硫磷的單克隆抗體，并建立了ic-ELISA方法。在抗DDT抗體制備及其ic-ELISA建立方面：Abad等[23]設(shè)計(jì)并合成了5種DDT的半抗原，制備出抗DDT的單克隆抗體，建立的ic-ELISA的靈敏度(半數(shù)抑制濃度：50% inhibitory concentration，IC50)最高可達(dá)到0.74 ng·mL-1；Hong等[24]制備出抗DDT的多克隆抗體，ic-ELISA的檢出限(Low of detection,LOD)為3.4 ng·mL-1；楊星星等[25]制備出了抗DDT的單克隆抗體，ic-ELISA的IC50為61.1 ng·mL-1。在抗硫丹抗體制備及其ic-ELISA建立方面：Wang等[26]制備出了抗硫丹的多克隆抗體，ic-ELISA的IC50為5.3 ng·mL-1；Manclús等[27]設(shè)計(jì)并合成了4種硫丹半抗原，制備出抗硫丹的單克隆抗體，ic-ELISA的IC50為2.85 ng·mL-1。在抗水胺硫磷抗體制備及其ic-ELISA建立方面：Wang等[28]制備了廣譜的抗有機(jī)磷農(nóng)藥的單克隆抗體，ic-ELISA檢測(cè)水胺硫磷的IC50為58.85 ng·mL-1；秦娜[29]建立了O-(2-異丙氧基羰基苯基)硫代磷酰胺類農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法，ic-ELISA檢測(cè)水胺硫磷的IC50為23.39 ng·mL-1。由于DDT、硫丹和水胺硫磷在一些農(nóng)產(chǎn)品中的MRL值較低，我國自主研制的相關(guān)農(nóng)藥單克隆抗體的質(zhì)量還有待進(jìn)一步提高，避免在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)樣品進(jìn)行濃縮處理。

本研究分別制備了抗DDT、硫丹和水胺硫磷的單克隆抗體，并使用商業(yè)化的辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為檢測(cè)二抗，分別建立了上述3種農(nóng)藥的ic-ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DDT標(biāo)準(zhǔn)品(94.6%)購自廣州佳途科技有限公司，硫丹(96.0%)和水胺硫磷(99.7%)標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrensorfer公司，其他用于交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的農(nóng)藥均由江蘇省農(nóng)藥研究所提供。用于細(xì)胞融合與培養(yǎng)的相關(guān)試劑均購自美國Invitrogen公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自美國Boster公司。牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)購自北京索萊寶科技有限公司。二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide,DMF)、四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl benzidine,TMB)、二環(huán)己基碳二亞胺(Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)和弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)均購自美國Sigma公司。用于抗體純化的Protein A柱購自美國GE Healthcare公司。透明酶標(biāo)板購自美國Corning公司。BALB/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)，本研究中使用的動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)江蘇省科學(xué)技術(shù)廳批準(zhǔn)，許可證號(hào)為SYXK(SU) 2017-0007。

1.2 單克隆抗體制備

按照已報(bào)道的合成方案，分別制備DDT[23]、硫丹[27]和水胺硫磷[29]的半抗原，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。采用活潑酯法[30]將半抗原分別與BSA和OVA偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。

圖1 農(nóng)藥及其半抗原結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of pesticides and its haptens A.DDT;B.endosulfan;C.isocarbophos

小鼠免疫：選擇6周齡的BALB/c小鼠，將100 μL 1 mg·mL-1免疫抗原(每只小鼠)與等體積的FCA混合乳化后對(duì)小鼠進(jìn)行首次免疫。3周后，使用相同劑量的免疫抗原與等體積的FIA混合乳化后免疫小鼠，隨后每隔兩周對(duì)小鼠進(jìn)行一次免疫。第3次免疫后，每隔一周采集小鼠尾血，并使用ELISA進(jìn)行評(píng)價(jià)。選擇血清效價(jià)和靈敏度最佳的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞融合前3 d，用100 μL 1 mg·mL-1免疫抗原對(duì)小鼠進(jìn)行沖刺免疫。

細(xì)胞融合：采用電融合法進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的融合實(shí)驗(yàn)，電融合條件為：用終質(zhì)量濃度為0.25 mg·mL-1的Pronase酶處理脾淋巴細(xì)胞和SP2/0，交流電壓為45 V，直流電壓為3 kV。融合后第14 d取融合細(xì)胞上清液進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)，篩選出存在特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)孔，并使用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株，將其擴(kuò)大培養(yǎng)后保存于液氮中。將保存于液氮中的細(xì)胞株復(fù)蘇并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射入已接種石蠟油的6周齡BALB/c小鼠腹腔中，待小鼠腹腔變大后收集腹水，并使用Protein A柱純化單克隆抗體。

1.3 ic-ELISA程序

用碳酸鹽緩沖液(Carbonate buffer solution,CBS)將包被抗原稀釋至最優(yōu)濃度，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，4 ℃過夜包被；將包被后的酶標(biāo)板用含0.05%吐溫的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution containing 0.05% Tween,PBST)洗滌5次后，每孔加入300 μL 含有3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，37 ℃封閉2 h；用PBST洗去殘留的封閉液后，每孔加入50 μL系列稀釋的分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，隨后再加入50 μL 最優(yōu)濃度的抗體溶液，37 ℃孵育1 h；反應(yīng)結(jié)束后，用PBST洗滌酶標(biāo)板10次，加入100 μL/孔HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體(1∶20 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌10次后，每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃顯色15 min；每孔加入50 μL終止液(2 mol·L-1H2SO4)結(jié)束反應(yīng)，使用Spectra-Max M5酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm處的吸光值(OD450 nm)。

1.4 ic-ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化

包被抗原與抗體用量優(yōu)化:使用ELISA棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原和抗體的濃度，選擇OD450 nm值(Amax)在1～2之間對(duì)應(yīng)的包被抗原和抗體濃度。

Na+濃度優(yōu)化：用Na+濃度為0.07、0.14、0.4、0.8、1.6 mol·L-1的PBS配制分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和抗體溶液，建立不同Na+濃度下ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線;pH值優(yōu)化：用pH值為6.0、6.5、7.0、7.4、8.0和9.0的PBS配制分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液及抗體溶液，建立不同pH值下ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線；甲醇濃度優(yōu)化：用甲醇含量為5%、10%、20%和40%的PBS配制分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(反應(yīng)體系中甲醇的最終含量分別為2.5%、5%、10%和20%)，建立不同甲醇含量下ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 特異性

配制系列濃度的分析物結(jié)構(gòu)類似物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用ic-ELISA進(jìn)行分析，建立不同類似物的ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC50值后，按照下述公式計(jì)算交叉反應(yīng)率(Cross-reactivity,CR)：

CR%=[ IC50(分析物)/ IC50(結(jié)構(gòu)類似化合物) ]×100

1.6 加標(biāo)回收

稻田水和土壤樣品采自南京當(dāng)?shù)剞r(nóng)場(chǎng)，蘋果和香蕉樣品購自南京當(dāng)?shù)爻?，所有樣品使用GC或HPLC法均未檢出DDT、硫丹和水胺硫磷，作為空白樣品。稻田水樣品過濾后添加分析物的甲醇溶液至終濃度為10、20、40 ng·mL-1；固體樣品徹底均質(zhì)化后，添加分析物的甲醇溶液至終濃度為150、300、600 ng·g-1。稻田水的加標(biāo)樣品在適當(dāng)稀釋后，直接使用ic-ELISA進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于固體樣品，準(zhǔn)確稱取10 g加標(biāo)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 含30%甲醇的PBS提取分析物，充分渦旋5 min后超聲15 min，繼續(xù)渦旋5 min，4 000 r/min離心5 min后收集提取液，并用最優(yōu)緩沖液定容至25 mL，將定容液適當(dāng)稀釋后使用ic-ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 色譜儀器檢測(cè)

稻田水樣品均采自南京當(dāng)?shù)剞r(nóng)場(chǎng)，分別向稻田水樣品中隨機(jī)添加未知濃度的DDT、硫丹和水胺硫磷，采用色譜儀和ic-ELISA同時(shí)檢測(cè)。ic-ELISA的提取及檢測(cè)程序如“1.6”所示；色譜檢測(cè)的前處理及儀器條件如下：

DDT提取與GC分析：取稻田水樣50 mL于分液漏斗中，加入30 mL石油醚劇烈振蕩3 min，靜置分層，收集上層有機(jī)相，再加入20 mL石油醚重復(fù)萃取。將兩次萃取的有機(jī)相合并，過無水硫酸鈉后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，再使用氮吹儀吹干。用 2.0 mL 正己烷溶解提取物，過 0.2 μm 濾膜，利用GC(Aglient 7890N)檢測(cè)DDT含量。色譜檢測(cè)條件如下：色譜柱：DB-1701P，30.0 m×0.32 mm×0.25 μm毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比 10∶1；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣(N2)：3.0 mL·min-1；尾吹氣(N2)：60 mL·min-1；柱溫：190 ℃保持 2 min，以 8 ℃· min-1升溫至 270 ℃，保持 10 min；檢測(cè)器及溫度：電子捕獲檢測(cè)器(ECD)，300 ℃。

硫丹提取與GC分析：稻田水樣中的硫丹使用乙酸乙酯提取，提取程序與DDT相同。利用GC(Aglient 7890N)檢測(cè)硫丹含量，色譜檢測(cè)條件如下：色譜柱：HP-5，30.0 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比 5∶1；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣(N2)：1.0 mL·min-1；尾吹氣(N2)：40 mL·min-1；柱溫：160 ℃保持 1 min，以 15 ℃·min-1升溫至 250 ℃，保持 4 min，以20 ℃· min-1升溫至 280 ℃，保持3 min；檢測(cè)器及溫度：ECD，300 ℃。

水胺硫磷提取與HPLC分析：稻田水樣中的水胺硫磷使用乙腈提取，以2.0 mL甲醇-水(60∶40,體積比)溶解提取物，其它提取程序與DDT相同。利用HPLC(Aglient 1260)檢測(cè)水胺硫磷含量，色譜檢測(cè)條件如下：色譜柱：Eclipse plus-C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：甲醇∶水=60∶40(體積比)；流速：1 mL·min-1，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣體積 20 μL，檢測(cè)波長 225 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 單克隆抗體特性

對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行亞克隆后，共獲得30株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，并使用ic-ELISA驗(yàn)證每個(gè)細(xì)胞株所分泌抗體的靈敏度(表1)。DDT有16株，其中克隆5F9靈敏度最高(IC50=15.9 ng·mL-1)，抗體亞型為IgG3型；硫丹有9株，其中克隆9F9靈敏度最高(IC50=12.3 ng·mL-1)，抗體亞型為IgG3型；水胺硫磷有5株，其中克隆7C10B8靈敏度最高(IC50=15.6 ng·mL-1)，抗體亞型為IgG2b型。

表1 DDT、硫丹和水胺硫磷的單克隆抗體細(xì)胞株靈敏度Table 1 Sensitivities of monoclonal antibodies cell lines to DDT,endosulfan and isocarbophos

2.2 ic-ELISA的最優(yōu)條件

選擇靈敏度最好的抗體建立DDT、硫丹和水胺硫磷的ic-ELISA測(cè)定方法。在競(jìng)爭(zhēng)免疫分析中，包被抗原和抗體的用量是影響靈敏度的關(guān)鍵因素，通過棋盤滴定法確定DDT包被抗原和單克隆抗體(5F9)的最優(yōu)工作濃度分別為0.06 μg·mL-1和2.5 μg·mL-1，硫丹包被抗原和單克隆抗體(9F9)的最優(yōu)工作濃度分別為1 μg·mL-1和10 μg·mL-1，水胺硫磷包被抗原和單克隆抗體(7C10B8)的最優(yōu)工作濃度分別為1.25 μg·mL-1和2.5 μg·mL-1。

在包被抗原和抗體的最優(yōu)工作濃度下，繼續(xù)優(yōu)化緩沖液的Na+濃度和pH值。根據(jù)ic-ELISA陽性值(Amax)與靈敏度(IC50)的比值(Amax/IC50)選擇最佳參數(shù)。如表2和表3所示，DDT、硫丹和水胺硫磷的最優(yōu)Na+濃度和pH值均分別為0.14 mol·L-1和6.5、0.4 mol·L-1和7.4、0.8 mol·L-1和6.5。

表2 ic-ELISA的Na+濃度優(yōu)化Table 2 The optimization of the concentrations of Na+ for ic-ELISA

表3 ic-ELISA的pH值優(yōu)化Table 3 The optimization of pH value for ic-ELISA

在免疫分析中，通常需要有機(jī)溶劑提取和溶解分析物，但高濃度的有機(jī)溶劑會(huì)嚴(yán)重影響抗原和抗體的反應(yīng)。其中，甲醇作為一種良好的有機(jī)溶劑，對(duì)免疫反應(yīng)的影響相對(duì)較小，故選擇甲醇用于分析物的溶解和提取。根據(jù)ic-ELISA陽性值(Amax)與靈敏度(IC50)的比值(Amax/IC50)選擇最佳參數(shù)。如表4所示，DDT、硫丹和水胺硫磷ic-ELISA的最佳甲醇終含量分別為2.5%、10%和5%。

表4 甲醇含量對(duì)ic-ELISA的影響Table 4 Effect of methanol content on ic-ELISA

2.3 ic-ELISA的靈敏度

在最優(yōu)條件下，以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、OD450 nm為縱坐標(biāo)，使用Origin 8.0按照Logistic方程擬合出ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。根據(jù)公式：ODX=抑制率×ODmax(ODmax：不加分析物時(shí)的OD450 nm減去空白對(duì)照孔的OD450 nm，ODX：抑制率為X時(shí)的OD450 nm)，計(jì)算抑制率在10%、50%和90%時(shí)的OD450 nm值，并代入擬合出的Logistic方程，分別計(jì)算抑制率在10%(LOD，IC10)、50%(IC50)和90%(IC90)時(shí)的分析物濃度。其中DDT的IC50、線性范圍(IC10～I(xiàn)C90)和LOD分別為10.72 ng·mL-1、1.85～102.6 ng·mL-1和1.85 ng·mL-1。Abad等[23]建立的ic-ELISA檢測(cè)DDT的IC50為0.74 ng·mL-1，是本研究的14倍。本研究使用的半抗原與該文獻(xiàn)相同，造成靈敏度差異的可能原因是：雜交瘤細(xì)胞株篩選的偶然性造成本研究未獲得分泌高質(zhì)量抗體的雜交瘤細(xì)胞株。但基于單克隆抗體5F9的ic-ELISA的靈敏度(LOD或IC50)均高于其他已報(bào)道的DDT抗體[24-25]。硫丹的IC50、IC10～I(xiàn)C90和LOD分別為9.69 ng·mL-1、2.19～39.92 ng·mL-1和2.19 ng·mL-1，靈敏度略低于Manclús等[27]建立的硫丹ic-ELISA(IC50=2.85 ng·mL-1)。水胺硫磷的IC50、IC10～I(xiàn)C90和LOD分別為13.26 ng·mL-1、3.04～73.01 ng·mL-1和3.04 ng·mL-1，高于Wang等[28]和秦娜[29]建立的ic-ELISA的靈敏度。

2.4 ic-ELISA的特異性

利用與結(jié)構(gòu)類似化合物的CR來評(píng)價(jià)ic-ELISA的特異性(表5)。由于o,p'-DDT(CR=33.4%)、p,p'-DDE(CR=17.7%)和o,p'-DDE(CR=9.0%)與p,p'-DDT 的結(jié)構(gòu)相似，故DDT的 ic-ELISA對(duì)這些結(jié)構(gòu)類似化合物均表現(xiàn)出較大的交叉反應(yīng)(9.0%～33.4%)，但對(duì)其他類似物均無明顯交叉反應(yīng)(CR≤2.4%)。硫丹的ic-ELISA對(duì)艾氏劑、氯丹、狄氏劑、β-硫丹和α-硫丹均存在明顯的交叉反應(yīng)(CR≥17.4%)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似化合物均無交叉反應(yīng)(CR≤1.0%)。水胺硫磷ic-ELISA的特異性較好，對(duì)水胺硫磷的6種結(jié)構(gòu)類似化合物均無交叉反應(yīng)(CR<0.1%)。

表5 ic-ELISA對(duì)分析物結(jié)構(gòu)類似化合物的交叉反應(yīng)Table 5 Cross-reactivity of a set of analogues structurally related to analyte by ic-ELISA

(續(xù)表5)

DDTEndosulfanIsocarbophosCompoundCR(%)CompoundCR(%)CompoundCR(%)<0.1<0.1

2.5 加標(biāo)回收率

樣品基質(zhì)對(duì)抗原-抗體的免疫反應(yīng)存在干擾，影響免疫分析方法的準(zhǔn)確性。因此，在檢測(cè)前需對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。由于免疫反應(yīng)特異性強(qiáng)，基質(zhì)干擾可通過稀釋樣品提取液的方法去除，該方法簡便、快速，但會(huì)降低免疫分析的靈敏度。將空白樣品的提取液進(jìn)行倍比稀釋，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇與緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合的最低稀釋倍數(shù)為樣品檢測(cè)的稀釋倍數(shù)。DDT進(jìn)行 ic-ELISA檢測(cè)時(shí)對(duì)稻田水樣品的最終稀釋倍數(shù)為2倍、蘋果樣品的最終稀釋倍數(shù)為30倍、土壤和香蕉樣品的稀釋倍數(shù)為60倍。硫丹則需對(duì)稻田水樣品稀釋4倍、蘋果和土壤樣品稀釋30倍、香蕉樣品稀釋60倍。水胺硫磷需將稻田水樣品稀釋2倍，其他樣品均需稀釋30倍。

在相應(yīng)稀釋倍數(shù)下，DDT、硫丹和水胺硫磷進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為71.4%～93.3%和3.8%～9.6%、74.0%～97.4%和3.0%～11%及70.8%～97.0%和4.2%～12%(表6)，表明ic-ELISA對(duì)加標(biāo)樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性高[31]。樣品加標(biāo)濃度根據(jù)ic-ELISA的靈敏度和樣品基質(zhì)稀釋倍數(shù)設(shè)置，3種農(nóng)藥在稻田水中的加標(biāo)水平為10、20、40 ng·mL-1，在土壤、蘋果和香蕉中的加標(biāo)水平為150、300、600 ng·g-1。根據(jù)中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[7]，DDT在不同食品中的再殘留限量范圍為0.02～2 mg·kg-1，硫丹和水胺硫磷在不同食品中的MRLs分別為0.01～10 mg·kg-1和0.01～0.05 mg·kg-1。因此，采用本研究建立的ic-ELISA進(jìn)行實(shí)際測(cè)定時(shí)需對(duì)水胺硫磷樣品及部分DDT和硫丹樣品進(jìn)行凈化和濃縮，其靈敏度才能達(dá)到檢測(cè)需求。

表6 ic-ELISA對(duì)加標(biāo)樣品的平均回收率Table 6 Average recoveries of spiked samples by the ic-ELISA

2.6 與儀器檢測(cè)的一致性

ic-ELISA和GC對(duì)稻田水樣品中DDT的檢測(cè)結(jié)果分別為13.1～55.0 ng·mL-1和17.4～57.5 ng·mL-1，兩組檢測(cè)結(jié)果的P=0.147 2(>0.05);ic-ELISA和GC對(duì)稻田水樣品中硫丹的檢測(cè)結(jié)果分別為14.3～55.1 ng ·mL-1和20.7～62.0 ng·mL-1，兩組檢測(cè)結(jié)果的P=0.129 6(>0.05);ic-ELISA和HPLC對(duì)稻田水樣品中水胺硫磷的檢測(cè)結(jié)果分別為16.4～75.2 ng·mL-1和15.7～83.1 ng·mL-1，兩組檢測(cè)結(jié)果的P=0.271 1(>0.05)。上述結(jié)果表明ic-ELISA的檢測(cè)結(jié)果與色譜儀器法無顯著性差異。此外，ic-ELISA和色譜儀器法對(duì)DDT、硫丹和水胺硫磷檢測(cè)結(jié)果之間線性回歸方程的斜率和R2值均接近 1(圖3)，表明ic-ELISA與色譜儀器法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。

3 結(jié) 論

本研究分別制備了DDT單克隆抗體細(xì)胞株16株、硫丹9株、水胺硫磷5株，選擇靈敏度較高的單克隆抗體(5F9、9F9和7C10B8)分別建立了DDT、硫丹和水胺硫磷的ic-ELISA測(cè)定方法。系統(tǒng)優(yōu)化后，ic-ELISA對(duì)DDT、硫丹和水胺硫磷的IC50和LOD分別為10.72 ng·mL-1和1.85 ng·mL-1、9.69 ng·mL-1和2.19 ng·mL-1、13.26 ng·mL-1和3.04 ng·mL-1。本研究建立的ic-ELISA的靈敏度均優(yōu)于國內(nèi)科研機(jī)構(gòu)已報(bào)道的數(shù)據(jù)，但DDT和水胺硫磷的靈敏度較國外報(bào)道的低。在特異性方面，DDT、硫丹與結(jié)構(gòu)類似物具有明顯的交叉反應(yīng)(9.0%≤CRDDT%≤33.4%、17.4%≤CR硫丹%≤84.3%)，水胺硫磷無明顯交叉反應(yīng)(CR<0.1%)。ic-ELISA對(duì)不同基質(zhì)中農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率和RSDs分別為70.8%～97.4%和3.0%～12%，且對(duì)盲樣的檢測(cè)結(jié)果與色譜儀器一致，表明ic-ELISA的準(zhǔn)確性高。然而，ic-ELSIA在實(shí)際應(yīng)用中需對(duì)水胺硫磷樣品及部分DDT和硫丹樣品進(jìn)行凈化和濃縮，靈敏度才能達(dá)到檢測(cè)要求。

總之，本研究制備的單克隆抗體的質(zhì)量和建立的ic-ELISA的靈敏度較我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體和ic-ELISA有所提高，但是仍需質(zhì)量更好的抗體或靈敏度更高的檢測(cè)方法，才能配合稀釋法(前處理)實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。