錢壯壯，朱孔鑫，王會(huì)利，覃其云，鄧小軍，曹繼釗，莊舜堯★

（1.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇 南京210008；2.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧530002）

人類的化石燃料使用、工業(yè)生產(chǎn)以及毀林開荒等活動(dòng)導(dǎo)致大量的CO2向大氣排放, 使得大氣CO2濃度顯著增加[1-2]。由于大氣CO2濃度上升引起的全球變暖已經(jīng)成為一個(gè)重大的環(huán)境挑戰(zhàn)，“溫室效應(yīng)”可能對(duì)世界環(huán)境和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[3]。土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳庫(kù)，土壤有機(jī)質(zhì)對(duì)維持土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)功能起著重要作用[4-5]。人工林栽植可以在較短時(shí)間內(nèi)吸收大氣中大量的CO2，把碳固定在植物和土壤中，因此，被廣泛認(rèn)為是緩解全球氣候變化的有效方法[6]。

桉樹（Eucalyptusspp. Smith）原產(chǎn)澳洲，由于其生長(zhǎng)速度快，抗性強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)在中國(guó)南方尤其是廣西壯族自治區(qū)廣泛引種，目前在廣西桉樹人工林面積已有171.29 萬(wàn)hm2[7-8]。廣西地處中國(guó)西南方，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候和熱帶季風(fēng)氣候，水熱條件好，是中國(guó)的人工林種植大省。目前，廣西全區(qū)擁有林業(yè)用地約1 600 萬(wàn)hm2，占全國(guó)林地面積的10%，林地資源相當(dāng)豐富[9]。廣西的重要人工林樹種還包括松樹（Pinus spp.） 和杉 木（Cunninghamia lanceolata），分別占全區(qū)樹種結(jié)構(gòu)的11.50%和17.66%[10]。但是，在人工林的經(jīng)營(yíng)過(guò)程中，由于人工林經(jīng)營(yíng)以純林為主，且輪伐期較短，林木被砍伐后，大量的生物量和養(yǎng)分被移出，使得養(yǎng)分無(wú)法歸還到土壤，隨著經(jīng)營(yíng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤地力衰退，土壤生產(chǎn)能力急劇下降[11-12]。

森林凋落物是森林植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中新陳代謝的產(chǎn)物。凋落物作為土壤有機(jī)質(zhì)輸入的主要來(lái)源，是土壤微生物進(jìn)行生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且對(duì)土壤溫度、濕度也會(huì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到土壤呼吸作用[13-14]。目前已有很多關(guān)于廣西人工林地力維持的研究，但是主要集中在地力退化[15]，生態(tài)評(píng)估地力評(píng)價(jià)[16-17]，合理施肥[18-20]等方面，對(duì)于菌劑腐解凋落物和林地土壤微生物的研究還比較少。菌劑具有促進(jìn)凋落物及土壤養(yǎng)分循環(huán)，增加土壤肥力的作用[21]。菌肥主要施用在水稻、小麥[22-23]及蔬菜[24-25]等農(nóng)作物土壤中，但是，目前缺乏菌劑對(duì)人工林土壤地力提升方面的研究。因此，本研究目的是通過(guò)比較不同市售菌劑對(duì)3 種林地凋落物分解及土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響，明確菌劑對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)提升的作用及機(jī)制，從而為廣西人工林地力提升和生態(tài)修復(fù)提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)崇左市扶綏縣東門林場(chǎng)，地理位置22°19′47″ N，107°50′31″ E，屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.7 ℃，年平均降雨量約1 300 mm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤樣品來(lái)自于廣西壯族自治區(qū)東門林場(chǎng)5年生桉樹林（Eucalyptus robusta），10年生杉木林（C.lanceolata）及15年生馬尾松林（P. massoniana）。每種人工林試驗(yàn)地面積為50 m×50 m，從每個(gè)試驗(yàn)樣地每種森林類型采用5 點(diǎn)交叉采樣法采集0~10 cm 深度土壤樣品，取樣前，要將枯枝落葉清除，取樣點(diǎn)的土樣由5 個(gè)重復(fù)混合而成。土樣去除根系和石頭后，在室溫下自然風(fēng)干，過(guò)2 mm 篩后備用。在采集土壤的過(guò)程中，同時(shí)隨機(jī)采集地面上的枯葉，取回實(shí)驗(yàn)室烘干研磨過(guò)2 mm 篩備用。

各取20 g 過(guò)2 mm 篩的桉樹、杉木及馬尾松林下風(fēng)干土壤均勻混合為60 g 土（土壤初始有機(jī)質(zhì)含量為51.11·g kg-1），平鋪于500 mL 玻璃錐形瓶中，取粉碎后的桉樹葉，杉木葉和馬尾松葉0.2 g 分別與0.1 g 市售菌劑（韋美微生物菌劑，濰坊市信得生物科技有限公司，主要成分為棘孢木霉菌、枯草芽孢桿菌等；益加益發(fā)酵劑，益加益生物科技有限公司，主要成分為芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、固氮菌等；貝佳有機(jī)肥發(fā)酵劑，山東貝佳生物科技有限公司，主要成分為芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、木霉菌等）均勻混合灑在土壤表面，濕潤(rùn)土壤水分至田間持水量（共計(jì)9 個(gè)處理，記為松益（SEb）、杉益（SHEb）、桉益（AEb）、松韋（SWb）、杉韋（SHWb）、桉韋（AWb）、松貝（SBb）、杉貝（SHBb）、桉貝（ABb）,同時(shí)做未加菌劑只加3 種凋落物的空白組記為松CK，杉CK，桉CK）。將一個(gè)裝有50 mL 0.1 mol·L-1KOH 溶液的小瓶子系在土壤表面上方，以吸收釋放的CO2。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)36 個(gè)錐形瓶封口放置在一個(gè)有密封蓋和無(wú)光的培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。每周測(cè)定釋放的CO2并更換KOH 溶液及補(bǔ)充土壤水分。培養(yǎng)期為2 個(gè)月。用0.1 mol·L-1HCl 滴定KOH 溶液中吸收的CO2并計(jì)算呼吸速率。培養(yǎng)結(jié)束后仔細(xì)去除上層凋落物及菌劑后，取出錐形瓶中的土壤，一部分風(fēng)干過(guò)0.25 mm 篩測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量，一部分新鮮土壤放入－80 ℃冰箱保存，用于微生物測(cè)定。

1.3 土壤樣品分析方法

1.3.1 有機(jī)質(zhì)測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)采用濃硫酸重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定[26]。

1.3.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

1.3.3 庫(kù)的構(gòu)建和排序

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

將原始的fastq 文件解復(fù)用，并使用QIIME（版本1.17）按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾：1）在10 bp 滑動(dòng)窗口中平均質(zhì)量得分＜20 的任何站點(diǎn)上，將250 bp的讀數(shù)都截短，并丟棄截短的讀數(shù)短于50 bp。2）精確的barcode 匹配，引物匹配中2 個(gè)核苷酸錯(cuò)配，包含歧義字符的讀段被刪除。3）僅重疊超過(guò)10 bp 的序列根據(jù)其重疊序列進(jìn)行組裝。無(wú)法組裝的讀物將被丟棄。使用UPARSE（7.1 版，http：//drive5.com/uparse/）對(duì)OUT 進(jìn)行聚類，相似度為97%，并使用ucheime 對(duì)嵌合序列進(jìn)行識(shí)別和去除。利用ucheime 對(duì)嵌合序列進(jìn)行識(shí)別和去除。利用50%的置信閾值，用uclust 對(duì)silva（SSU123）16sRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了每個(gè)16sRNA 基因序列的親緣關(guān)系[27]。

1.4.2 Alpha 多樣性分析

進(jìn)行了基于Mothur v.1.21.1 的稀疏性分析[28]，以揭示多樣性指數(shù)，包括Chao 和Shannon 多樣性指數(shù)。熱圖是通過(guò)R 中的Vegan 2.0 包繪制的。

1.4.3 方差分析

有機(jī)質(zhì)及土壤呼吸數(shù)據(jù)均通過(guò)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，3 個(gè)重復(fù)的平均數(shù)用IBM SPSS Statistics 20.0 進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加菌劑對(duì)各處理土壤呼吸的影響

對(duì)不同凋落物添加菌劑后發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各個(gè)處理土壤呼吸速率均呈現(xiàn)先降低后增長(zhǎng)再降低的趨勢(shì)。在試驗(yàn)剛開始時(shí)，各處理呼吸速率在2.31～6.05 μmol·m-2·s-1之間，直到培養(yǎng)結(jié)束，各處理呼吸速率處于0.12～1.27 μmol·m-2·s-1之間。其中，桉樹添加益加益處理呼吸速率在培養(yǎng)21 d 后開始超過(guò)其他處理，并于培養(yǎng)42 d 和培養(yǎng)結(jié)束時(shí)顯著高于所有處理。與未添加菌劑的對(duì)照相比，添加菌劑顯著提升了土壤呼吸效率，綜合比較各凋落物添加益加益菌劑的呼吸速率均高于添加其他菌劑，益加益對(duì)土壤呼吸具有較好的促進(jìn)作用。

2.2 菌劑對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響

由表1 和表2 可知，與未添加菌劑的對(duì)照相比，添加菌劑后均提升了土壤有機(jī)質(zhì)含量，但是可能由于培養(yǎng)時(shí)間較短及菌劑和凋落物添加數(shù)量的原因，各處理均沒(méi)有顯著差異。最高增幅為馬尾松+益加益的處理，對(duì)比初始有機(jī)質(zhì)含量提升了5.48%，其次為桉樹+益加益和杉木+益加益的處理，培養(yǎng)結(jié)束后有機(jī)質(zhì)含量比對(duì)照有機(jī)質(zhì)含量分別提高了4.49%和4.17%。綜合比較，松杉桉3 種凋落物均表現(xiàn)為添加益加益對(duì)有機(jī)質(zhì)提升效果最佳。

圖1 添加菌劑對(duì)各處理土壤呼吸的影響Fig. 1 Effects of microbial agents on soil respiration in different treatments

表1 添加菌劑對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響Tab. 1 Effects of microbial agents on soil organic matter

2.3 菌劑對(duì)土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性的影響

在對(duì)低質(zhì)量的reads 和嵌合體序列進(jìn)行過(guò)濾和去除后，共獲得2 448 個(gè)OTUs，它們的相似度為97%。細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)如圖2 所示。各處理的的Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為松益＞桉益＞杉韋＞桉韋＞松韋＞桉貝＞松貝＞杉益＞杉貝，松+益加益顯著高于其他處理。此外，Shannon 指數(shù)表現(xiàn)為桉益＞松益＞桉貝＞杉韋＞松貝＞杉貝＞松韋＞桉韋＞杉益（圖2b）。益加益對(duì)比其他菌劑具有更好的提升土壤細(xì)菌群落多樣性的作用，尤其是對(duì)松樹和桉樹土壤效果提升最明顯。

2.4 菌劑對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

圖2 不同菌劑處理的Chao1(a)和Shannon(b)細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Fig. 2 Bacterial community diversity of Chao1 (a) and Shannon (b) index in different treatments

對(duì)相對(duì)豐度排名前20 位的土壤細(xì)菌門進(jìn)行了分析（圖3），在各處理土壤中，5 個(gè)主要門類為厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度最高，占8.16%～99.52%，其次為變形菌門（Proteobacteria），占0.17%～90.31%；其它細(xì)菌門分別為放線菌門（Actinobacteria，0.02%～16.82%）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.11%～6.41%）、和浮霉菌門（Planctomycetes ，0.06%～5.06%）。這5 個(gè)細(xì)菌門的相對(duì)豐度共占92.94%～99.91%。

圖3 土壤細(xì)菌群落主要門的相對(duì)豐度Fig. 3 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

圖4 FAPROTAX 功能注釋聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of FAPROTAX functional annotation clustering

2.5 功能注釋聚類分析

通過(guò)對(duì)樣品在數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋及豐度信息，繪制熱圖，并從功能差異層面進(jìn)行聚類分析（圖4）。結(jié)果表明：桉益處理細(xì)菌群落在硫化合物的呼吸作用纖維素化、甲醇氧化、甲基營(yíng)養(yǎng)、芳香族化合物降解、木聚糖分解、碳?xì)浠衔锝到?、芳烴降解、脂肪族非甲烷烴降解、硫代硫酸鹽呼吸功能強(qiáng)度顯著表達(dá)；松益處理細(xì)菌群落在好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用、硫酸鹽呼吸、硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸和氮呼吸能強(qiáng)度顯著表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

土壤呼吸是生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過(guò)程中不可或缺的部分[29]，它受到土壤溫度、濕度、有機(jī)質(zhì)含量和土壤微生物等因素影響[30]。本研究結(jié)果表明，不同處理土壤呼吸速率具有明顯的時(shí)間差異，在培養(yǎng)后期各處理土壤呼吸速率降低了69.28%～97.05%，說(shuō)明不同菌劑對(duì)于不同凋落物分解促進(jìn)效果不同，后期有些菌劑已經(jīng)與凋落物基本反應(yīng)完全，無(wú)法起到長(zhǎng)期促進(jìn)凋落物分解的作用。通過(guò)對(duì)不同菌劑相同凋落物的處理比較，總體呈現(xiàn)出馬尾松＞杉木＞桉樹葉的趨勢(shì)，這與吳志東等[31]研究一致，但是與楊鈣仁等[32]研究結(jié)果不同，可能是受到桉樹林齡和菌劑的影響。

土壤呼吸的升高并不一定意味著土壤有機(jī)質(zhì)分解與大氣二氧化碳濃度之間存在正反饋，單獨(dú)測(cè)量土壤呼吸并不能為評(píng)估土壤在氣候變暖下是碳源或碳匯提供確鑿的證據(jù)[33]。筆者通過(guò)對(duì)凋落物分解之后的土壤有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌劑對(duì)于凋落物分解具有促進(jìn)作用，雖然由于處理時(shí)間的限制，各處理沒(méi)有呈現(xiàn)顯著差異，但是由圖1 可以看出，益加益菌劑到培養(yǎng)后期仍維持了較高的土壤呼吸速率，在田間長(zhǎng)期施用可能可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的顯著上升，這點(diǎn)需要配合田間試驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

凋落物分解對(duì)于土壤有機(jī)質(zhì)的補(bǔ)充具有重要作用[34]。由于凋落物的添加引起土壤有機(jī)碳的增加，為微生物提供較多可利用碳源，微生物的數(shù)量增多；土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要作用[35-36]。從土壤細(xì)菌群落組成結(jié)果可以看出，益加益可以顯著提升松樹和桉樹Shannon 和Chao1 多樣性和豐富度指數(shù)，說(shuō)明菌劑添加對(duì)于提升微生物物種總數(shù)及多樣性具有顯著作用（圖2），尤其是益加益提升效果最佳，表明益加益更能提高凋落物土壤中微生物的數(shù)量和活性，使微生物在養(yǎng)分豐富的條件下生長(zhǎng)迅速。對(duì)比其他處理，馬尾松及桉樹添加益加益后，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria是相對(duì)豐度最高的4 個(gè)門，但是Proteobacteria門所占比例顯著上升，Proteobacteria 門具有增加養(yǎng)分可利用性的作用[37]，表明添加益加益后可以有效提升植物對(duì)土壤養(yǎng)分的利用情況。

土壤微生物功能多樣性與土壤功能關(guān)系密切，土壤微生物功能多樣性是土壤功能的保證,同時(shí)也是恢復(fù)土壤功能的基礎(chǔ)[38]。筆者的研究表明桉益處理芳香族化合物降解，碳?xì)浠衔锝到夂头紵N降解等碳代謝的功能表達(dá)有強(qiáng)烈上升（圖4），這與之前土壤呼吸的結(jié)果一致（圖1），表明益加益對(duì)桉樹葉有機(jī)質(zhì)分解具有很好的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)不同凋落物添加3 種菌劑顯著增加了土壤呼吸速率，土壤有機(jī)質(zhì)含量也得到了有效提升，對(duì)土壤微生物群落及功能多樣性有明顯的提升效果。其中益加益菌劑對(duì)凋落物分解及土壤有機(jī)質(zhì)含量提升效果最佳，馬尾松添加益加益處理對(duì)比初始有機(jī)質(zhì)含量提升了5.48%，桉樹添加益加益處理對(duì)比初始有機(jī)質(zhì)含量提升了4.55%。并且馬尾松處理和桉樹處理添加益加益菌劑后，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)顯著上升，表明益加益顯著改善了土壤微生物群落多樣性，對(duì)于提升土壤地力及改善土壤生態(tài)環(huán)境具有重大促進(jìn)作用。