劉姍姍，鄭 琴，岳鵬飛，楊 明，帥書苑，劉小金，胡鵬翼

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330004

腦卒中具有極高的致死率和致殘率，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等均為導(dǎo)致腦卒中病情加重的重要原因。美國(guó)腦卒中協(xié)會(huì)揭示缺血性腦卒中是腦卒中最常見的形式，占所有腦卒中病例的87%[1-2]。目前溶栓、降纖為腦卒中主要治療手段，但血液循環(huán)恢復(fù)后，神經(jīng)元損傷，再灌注損傷加重腦梗死程度，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，這一病理過程為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。CIRI會(huì)損傷大腦的血腦屏障，血腦屏障功能紊亂可導(dǎo)致嚴(yán)重繼發(fā)性損傷如炎性損傷、腦水腫等，因此，血腦屏障的保護(hù)和恢復(fù)被認(rèn)為是減少腦損傷的新型治療策略。

補(bǔ)陽還五湯、天麻鉤藤湯、血府逐瘀湯、圣愈湯、當(dāng)歸芍藥散[3-5]在防治CIRI、保護(hù)血腦屏障完整性、抑制細(xì)胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)等方面都具有一定的療效。補(bǔ)陽還五湯和血府逐瘀湯中含有赤芍和川芎，圣愈湯和當(dāng)歸芍藥散中含有川芎和白芍，芍藥苷為赤芍和白芍的活性成分，可減輕急性腦梗死大鼠的組織損傷程度，抑制缺血后腦組織中氧自由基的形成，降低脂質(zhì)過氧化程度[6]。課題組前期研究表明，川芎中的3個(gè)苯酞類成分藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I可增加芍藥苷、天麻素和松果菊苷在MDR1轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞（MDCK-MDR1）模型上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其機(jī)制與下調(diào)P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、claudin-5和ZO-1表達(dá)有關(guān)[7-9]。本研究采用氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)MDCK-MDR1細(xì)胞建立體外腦缺血再灌注損傷模型，探討藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)OGD/R損傷MDCK-MDR1細(xì)胞的保護(hù)作用以及對(duì)配伍藥物芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為其防治缺血性腦血管疾病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

MDCK-MDR1細(xì)胞購自上海中亞生物基因研究所。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品藁本內(nèi)酯（批號(hào)wkqq9011005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、洋川芎內(nèi)酯I（批號(hào)DST190902-009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、洋川芎內(nèi)酯A（批號(hào)PCS0323，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、芍藥苷（批號(hào)S-010-180710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；3460型Transwell小室（孔徑0.4 μm，直徑12 mm，表面積1.12 cm2）、培養(yǎng)瓶購自美國(guó)Costar公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號(hào)KG02448）、高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)KGM12800S-500）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；無糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)10566-016）購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、非必需氨基酸、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）購自美國(guó)Gibco公司；RIPA裂解液（批號(hào)C1053）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010）購自美國(guó)Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)CW0014S）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；超敏發(fā)光液（批號(hào)RJ239676）購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；P-gp抗體（批號(hào)ab170904）、ZO-1抗體（批號(hào)ab96587）、occludin抗體（批號(hào)ab167161）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）抗體（批號(hào)ab115730）購自美國(guó)Abcam公司；claudin-5抗體（批號(hào)29235）購自美國(guó)SAB公司；β-actin抗體（批號(hào)TA-09）、HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)L3032-2）、HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)L3012-2）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；乙腈為HPLC級(jí)；水為雙蒸水。

1.3 儀器

AB Triple Quad 4500復(fù)合三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜，配備ESI離子源及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB SCIEX公司）；BT25S型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；3-18K型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；YCP-10S型三氣培養(yǎng)箱（長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司）；Eclipse TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；HHS型恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；TDZ4A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；MERS00002型跨膜電阻儀（美國(guó)Millipore公司）；WD-2102B型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 MDCK-MDR1細(xì)胞培養(yǎng)

MDCK-MDR1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，棄去培養(yǎng)基，用37 ℃的HBSS溶液洗滌2次，以0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化。

2.2 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK-MDR1細(xì)胞，以1×105/mL接種至96孔板中，設(shè)置對(duì)照組，模型組，藁本內(nèi)酯低、中、高劑量（20、40、80 μg/mL）組，洋川芎內(nèi)酯A低、中、高劑量（20、40、80 μg/mL）組和洋川芎內(nèi)酯I低、中、高劑量（20、40、80 μg/mL）組[9]。對(duì)照組加入高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；模型組和各給藥組加入無糖DMEM培養(yǎng)基，于95% N2、5% CO2、37 ℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h造成OGD損傷；藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I溶于無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，以高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。各給藥組再加入相應(yīng)藥物，模型組加入不含藥物的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h進(jìn)行再灌注[10]。再灌注結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A給藥/A對(duì)照

2.3 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞上清液LDH釋放率的影響

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集上清液，按試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞上清液LDH釋放率。

2.4 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK-MDR1細(xì)胞，以1×106/mL接種至6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入100 μL結(jié)合緩沖液，制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FTTC和5 μL碘化丙啶（PI），室溫避光放置15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.5 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞ZO-1、claudin-5、occludin、P-gp和GLUT-1蛋白表達(dá)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK-MDR1細(xì)胞，以1×106/mL接種至6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶粉封閉2 h，加入ZO-1抗體（1∶500）、claudin-5抗體（1∶500）、occludin抗體（1∶50 000）、P-gp抗體（1∶1000）、GLUT-1抗體（1∶100 000）和β-actin抗體（1∶2000），4 ℃孵育24 h，TBST洗滌3次；加入HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG抗體（1∶5000）孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光試劑顯影，采用Image J和Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描及圖像分析。

2.6 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)芍藥苷在MDCK-MDR1細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK-MDR1細(xì)胞，以2.5×105/mL接種至Transwell小室，0.5 mL/孔，培養(yǎng)7 d，每2天換液1次，測(cè)定細(xì)胞跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值＞300 Ω/cm2時(shí)，按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，吸去Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入0.5 mL含芍藥苷（200 μg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基，Transwell下室加入1.5 mL高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，吸取200 μL下室培養(yǎng)基，加入180 μL甲醇，渦旋3 min，16 000 r/min離心10 min，取上清液，按課題組前期方法LC-MS系統(tǒng)測(cè)定芍藥苷質(zhì)量濃度[7]，計(jì)算芍藥苷的表觀滲透系數(shù)（Papp）。

Papp＝dQ/(dt·A·C0)

dQ/dt為轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間dt內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)速率（μg/s）；A為細(xì)胞單層表面積（cm2）；C0為Transwell小室內(nèi)芍藥苷的初始質(zhì)量濃度（μg/mL）

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以±s表示，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行處理，兩組間相互比較，滿足方差齊性時(shí)用LSD檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時(shí)用T2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1所示，對(duì)照組MDCK-MDR1細(xì)胞清晰透亮，呈“鋪路石”狀，排列緊密，緊密連接清晰可見。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞間隙增大，藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I組隨著劑量增加，細(xì)胞間隙明顯增大；藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）、洋川芎內(nèi)酯A（80 μg/mL）組細(xì)胞整體回縮變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)減少，緊密連接破壞嚴(yán)重；洋川芎內(nèi)酯I組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相近，呈“鋪路石”狀，排列緊密。

圖1 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞形態(tài)的影響 (×100)Fig.1 Effect of ligustilide,senkyunolide A,and senkyunolide I on morphology of MDCK-MDR1 cells (× 100)

3.2 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組MDCK-MDR1細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）組、洋川芎內(nèi)酯A組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），洋川芎內(nèi)酯I（80 μg/mL）組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）。表明洋川芎內(nèi)酯A（20～80 μg/mL）對(duì)細(xì)胞毒性較大，洋川芎內(nèi)酯I在同等質(zhì)量濃度范圍內(nèi)細(xì)胞毒性較小，且高劑量可提高OGD/R損傷的細(xì)胞存活率。

圖2 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞存活率的影響 ()Fig.2 Effect of ligustilide,senkyunolide A,and senkyunolide I on survival rate of MDCK-MDR1 cells(±s ,n=6)

3.3 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞上清液LDH釋放率的影響

以細(xì)胞上清液中LDH釋放作為細(xì)胞損傷的指標(biāo)，結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中LDH釋放率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，藁本內(nèi)酯（40、80 μg/mL）組、洋川芎內(nèi)酯A組細(xì)胞上清液中LDH釋放率顯著升高（P＜0.01），洋川芎內(nèi)酯I（40、80 μg/mL）組細(xì)胞上清液中LDH釋放率顯著降低（P＜0.05、0.01）。表明洋川芎內(nèi)酯I可改善OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

圖3 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞上清液LDH釋放率的影響(±s ,n=6)Fig.3 Effectof ligustilide,senkyunolide A,and senkyunolide I on LDH release rate in supernatant of MDCK-MDR1 cells (±s ,n=6)

3.4 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，藁本內(nèi)酯（20、40 μg/mL）組、洋川芎內(nèi)酯I組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）組、洋川芎內(nèi)酯A（40、80 μg/mL）組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05、0.01）。

3.5 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞ZO-1、claudin-5、occludin、P-gp和GLUT-1蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），GLUT-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，藁本內(nèi)酯（20 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），GLUT-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；藁本內(nèi)酯（40 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、ZO-1和GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），occludin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、occludin、ZO-1和GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），P-gp蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；洋川芎內(nèi)酯A（20 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、ZO-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），occludin和GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；洋川芎內(nèi)酯A（40、80 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、occludin、ZO-1、GLUT-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；洋川芎內(nèi)酯I（20 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），GLUT-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；洋川芎內(nèi)酯I（40 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、occludin、ZO-1和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；洋川芎內(nèi)酯I（80 μg/mL）組細(xì)胞claudin-5、occludin和P-gp蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），ZO-1和GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

3.6 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)芍藥苷在MDCK-MDR1細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

以芍藥苷為探針?biāo)幬颷11]，研究藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I對(duì)芍藥苷在OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞緊密連接受損，細(xì)胞膜通透性增加，芍藥苷Papp顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，藁本內(nèi)酯（20 μg/mL）組、洋川芎內(nèi)酯A（40、80 μg/mL）組和洋川芎內(nèi)酯I組芍藥苷Papp顯著升高（P＜0.05、0.01），促進(jìn)芍藥苷的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 討論

圖4 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞凋亡的影響 (±s ,n=6)Fig.4 Effect of ligustilide,senkyunolide A,and senkyunolide I on apoptosis of MDCK-MDR1 cells (±s ,n=6)

圖5 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞ZO-1、claudin-5、occludin、P-gp和GLUT-1蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Fig.5 Effect of ligustilide,senkyunolide A and senkyunolide I on ZO-1,claudin-5,occludin,P-gp,and GLUT-1 protein expressions in MDCK-MDR1 cells (±s ,n=3)

圖6 藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)芍藥苷在MDCK-MDR1細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 (±s ,n=3)Fig.6 Effect of ligustilide,senkyunolide A,and senkyunolide I on transport of paeoniflorin across membrane of MDCK-MDR1 cells (±s ,n=3)

腦卒中是我國(guó)成年人致死、致殘的首位病因，也是我國(guó)疾病致壽命損失的首位病因。目前最有效的治療手段是溶栓、降纖，但腦組織在缺血狀態(tài)下恢復(fù)供血，會(huì)加重腦損傷，病情進(jìn)一步惡化，從而出現(xiàn)CIRI，抑制細(xì)胞凋亡可以緩解缺血再灌注造成的傷害[12]。本研究結(jié)果表明，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）會(huì)加劇OGD/R誘導(dǎo)的MDCKMDR1細(xì)胞損傷，洋川芎內(nèi)酯I（80 μg/mL）顯著升高OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞存活率；洋川芎內(nèi)酯I（40、80 μg/mL）顯著抑制OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞上清液中LDH釋放率，藁本內(nèi)酯（40、80 μg/mL）和洋川芎內(nèi)酯A顯著促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞上清液中LDH釋放；藁本內(nèi)酯（20、40 μg/mL）和洋川芎內(nèi)酯I顯著抑制細(xì)胞凋亡，藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）和洋川芎內(nèi)酯A（40、80 μg/mL）顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，與藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯A相比，洋川芎內(nèi)酯I在相同質(zhì)量濃度下對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞毒性較小，可抑制OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞凋亡和LDH釋放，從而提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，保護(hù)受損細(xì)胞。低劑量藁本內(nèi)酯具有類似洋川芎內(nèi)酯I的作用，高劑量藁本內(nèi)酯加速細(xì)胞損傷。洋川芎內(nèi)酯A（20～80 μg/mL）對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞毒性較大，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和LDH釋放。

血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是血腦屏障維持結(jié)構(gòu)與功能的重要基礎(chǔ)。緊密連接蛋白ZO-1是其重要組成蛋白之一，血腦屏障的變化與ZO-1水平密切相關(guān)[13]。Claudin-5是血腦屏障中最主要的跨膜蛋白，是緊密連接蛋白的主要組成部分，主要在脈絡(luò)膜叢和腦毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)[14-15]。Occludin是一種由細(xì)胞內(nèi)氨基和羧基末端組成的四通路跨膜蛋白，也是細(xì)胞旁屏障的功能成分[16]。血腦屏障的損傷在CIRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。缺血性腦卒中再灌注后，缺血區(qū)線粒體能量代謝障礙、呼吸鏈?zhǔn)茏?，?dǎo)致活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生，ROS攻擊細(xì)胞膜并破壞細(xì)胞骨架，降解跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白，破壞緊密連接蛋白復(fù)合體（tight junction protein systerm，TJPs），從而破壞血腦屏障[17]。炎性反應(yīng)是缺血性腦卒中再灌注后損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理過程，CIRI引起炎性因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6大量釋放，TNF-α和IL-1β刺激中性粒細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生炎性因子，從而誘發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致TJPs結(jié)構(gòu)損壞，進(jìn)而增加血腦屏障通透性[18-19]。通過藥物干預(yù)保護(hù)腦CIRI大鼠TJPs結(jié)構(gòu)能夠有效降低血腦屏障通透性并緩解腦水腫，減輕CIRI[20]。藁本內(nèi)酯（5、10、20μmol/L）能夠通過上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，保護(hù)OGD誘導(dǎo)的體外血腦屏障共培養(yǎng)細(xì)胞損傷[21]。本研究結(jié)果表明，20 μg/mL藁本內(nèi)酯能夠通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表達(dá)水平，恢復(fù)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞生物屏障功能，但隨劑量增加，緊密連接蛋白表達(dá)水平降低，血腦屏障膜通透性增加；洋川芎內(nèi)酯I（20～80 μg/mL）可上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表達(dá)水平，恢復(fù)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞生物屏障功能；洋川芎內(nèi)酯A（20～80 μg/mL）下調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)水平，加劇血腦屏障損傷。

P-gp是一種跨膜糖蛋白，在肝、腸、腦、腎、等組織中表達(dá)，P-gp可通過促進(jìn)外源性化合物外排，對(duì)組織器官起到保護(hù)作用[22]。缺血性腦卒中使P-gp水平顯著升高，導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)藥物生物利用度降低、療效減小[23]。抑制P-gp蛋白表達(dá)，可以增加P-gp底物維拉帕米細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量濃度[24]。本研究結(jié)果顯示，洋川芎內(nèi)酯A（20～80 μg/mL）可抑制外排蛋白P-gp表達(dá)水平，增加配伍藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高療效。20 μg/mL藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I可下調(diào)P-gp蛋白表達(dá)水平，但劑量升高時(shí)，可上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)水平，不利于配伍藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

缺血性腦卒中大鼠缺血后葡萄糖水平降低，再灌注后葡萄糖水平略有提升，但再灌注24 h后仍未恢復(fù)到基線水平[25]；由于缺血再灌注后大腦的能量需求增加，葡萄糖及其代謝顯著影響缺血性腦卒中的療效和長(zhǎng)期恢復(fù)[26-27]，增加血腦屏障葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解能量代謝障礙，可減少神經(jīng)元死亡[28]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組GLUT-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明葡萄糖需求增加，細(xì)胞代償性上調(diào)GLUT-1用于自我修復(fù)。尼古丁/可替寧和含有尼古丁的電子煙蒸氣可以顯著降低缺血性腦卒中大腦葡萄糖的利用，加劇病情，其機(jī)制與下調(diào)GLUT-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)[29]。與模型組比較，20 μg/mL洋川芎內(nèi)酯A顯著增加GLUT-1蛋白表達(dá)水平，藁本內(nèi)酯（20～80 μg/mL）、洋川芎內(nèi)酯I（20～80 μg/mL）和洋川芎內(nèi)酯A（40～80 μg/mL）均顯著抑制GLUT-1蛋白表達(dá)水平，由于藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I和洋川芎內(nèi)酯A均可不同程度地下調(diào)OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞GLUT-1蛋白表達(dá)水平，減少細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求，因此可能加劇細(xì)胞損傷，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

課題組前期研究表明芍藥苷為難透血腦屏障的藥物，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以被動(dòng)擴(kuò)散為主，兼有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，為P-gp蛋白的底物，受到P-gp的外排作用。本研究結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯（20 μg/mL）顯著增加芍藥苷在OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，藁本內(nèi)酯（20 μg/mL）可上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin表達(dá)水平，恢復(fù)血腦屏障的生物屏障功能，減小芍藥苷的細(xì)胞間隙轉(zhuǎn)運(yùn)，但可能由于以抑制P-gp蛋白表達(dá)、增加芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)為主，最終表現(xiàn)為芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加。藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）可以顯著減少芍藥苷在OGD/R誘導(dǎo)的MDCK-MDR1細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，由于藁本內(nèi)酯（80 μg/mL）下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin蛋白表達(dá)水平，增加膜通透性，增加芍藥苷的細(xì)胞間隙轉(zhuǎn)運(yùn)，但可能由于以上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)水平、減少芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)為主，最終表現(xiàn)為芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)減小。洋川芎內(nèi)酯A促進(jìn)芍藥苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與洋川芎內(nèi)酯A抑制緊密連接蛋白和P-gp外排蛋白表達(dá)水平有關(guān)；洋川芎內(nèi)酯I細(xì)胞毒性最低，使細(xì)胞緊密相連，顯著上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)，但仍增加了芍藥苷的轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與其他機(jī)制有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突