吳艷榮,劉光偉,劉全忠,朱志強,王琳琳,鄭穎穎,李 昕
1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 針灸科,河南 鄭州 450003
2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 鄭州 450004
3.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,河南 鄭州 450003
缺血性腦血管疾病是威脅老年人群死亡的疾病之一,研發(fā)缺血性腦血管疾病的治療藥物成為重點研究方向之一,腦缺血造成腦組織損傷甚至危及生命安全,腦組織缺氧時誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激可激活凋亡信號通路進而誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡,因而如何抑制神經(jīng)元細胞炎癥、氧化應(yīng)激成為主攻方向[1]。近年來,中藥在腦血管疾病中的作用逐漸受到重視,研究表明管花肉蓯蓉醇提取物[2]、白藜蘆醇[3]等中藥成分在預(yù)防腦組織損傷方面發(fā)揮重要作用,但關(guān)于其作用機制尚未闡明。
黃芩苷是黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的有效成分之一,其可以改善帕金森病動物神經(jīng)行為學(xué)癥狀,還可減輕小膠質(zhì)細胞損傷從而保護神經(jīng)細胞[4]。但黃芩苷對神經(jīng)元細胞損傷的作用機制尚未闡明。微小RNA(microRNA,miRNA)在缺氧缺糖(oxygen glucose deficiency,OGD)誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中表達異常并可調(diào)控細胞增殖及凋亡等過程[5]。微小RNA-190(microRNA-190,miR-190)在帕金森氏病小鼠模型中表達水平降低,上調(diào)miR-190可減輕神經(jīng)元損傷及抑制炎癥反應(yīng)[6]。
但黃芩苷是否可通過調(diào)控miR-190的表達從而參與改善神經(jīng)元細胞損傷尚未可知。因此,本研究采用OGD處理小鼠海馬神經(jīng)元細胞建立細胞損傷模型,探討黃芩苷對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞增殖、凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激的影響,探究其對miR-190的調(diào)控作用。
黃芩苷,批號20191203,購自成都格利普生物科技有限公司,質(zhì)量分數(shù)95%;小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司;DMEM培養(yǎng)液(批號20190306)、胎牛血清(批號20190203)、胰蛋白酶(批號20190105)購自美國Hyclone公司;Lipofectamine 2000(批號20190402)、Trizol試劑(批號20190306)、cDNA合成試劑(批號20190506)與實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑(批號20190607)購自美國Thermo Fisher公司;白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β,批號20190911)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號20190616)檢測試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH,批號20190618)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批號20190625)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;miR-190寡核苷酸模擬物(miR-190 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-190特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-190)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司;甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(批號20190611)、凋亡檢測試劑盒(批號20190518)、RIPA裂解液(批號20190419)購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗鼠細胞周期蛋白1(CyclinD1)、未剪切的半胱天冬酶-3(pro-cysteinyl aspartate-specific protease-3,pro-Caspase-3)、p21、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-cysteinyl aspartate-specific protease-3,cleaved-Caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;Multiskan Sky酶標儀購自美國Thermo Fisher公司;FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司;DYY-7C電泳儀電源、DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀購自北京六一儀器廠;HI650離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;Nano-100微量分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司。
1.2.1 分組及給藥 OGD誘導(dǎo)HT22細胞建立細胞損傷模型[7]。HT22細胞培養(yǎng)于不含糖的DMEM培養(yǎng)液內(nèi),置于94% N2、5% CO2、1% O2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后更換為正常培養(yǎng)液,建立細胞損傷模型。HT22細胞(2.5×104個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔),將正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。OGD處理的HT22細胞作為OGD組。HT22細胞中分別加入含有不同質(zhì)量濃度(10、30 mg/L)黃芩苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,進行OGD處理[8],分別記作OGD+黃芩苷低劑量組、OGD+黃芩苷高劑量組。參照Lipofectamine 2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-190 mimics轉(zhuǎn)染至HT22細胞后進行OGD處理,分別記作OGD+miR-NC組、OGD+miR-190組。分別將anti-miR-NC、anti-miR-190轉(zhuǎn)染至HT22細胞后,分別加入含有質(zhì)量濃度為30 mg/L黃芩苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,進行OGD處理,分別記作OGD+黃芩苷+anti-miR-NC組、OGD+黃芩苷+anti-miR-190組。
1.2.2 MTT檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期HT22細胞(2.5×104個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔),培養(yǎng)12 h,設(shè)置對照組、黃芩苷(10、20、30、40 mg/L)給藥組,對照組給予培養(yǎng)基,不同質(zhì)量濃度給藥組分別給予相應(yīng)質(zhì)量濃度黃芩苷溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別加入MTT溶液(20 μL/孔)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清后加入DMSO(150 μL/孔),室溫孵育5 min后應(yīng)用酶標儀檢測各孔490 nm吸光度(A)值。
1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取各組HT22細胞加入預(yù)冷PBS洗滌細胞,棄上清后加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞,按照凋亡試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC與PI,室溫振蕩孵育10 min后應(yīng)用FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。
1.2.4 ELISA法檢測炎性因子IL-1β、TNF-α的水平 各組HT22細胞中加入RIPA裂解后,使用離心機(3000 r/min離心5 min)離心后吸取上清,采用ELISA法檢測炎性因子IL-1β、TNF-α的水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
1.2.5 檢測氧化應(yīng)激指標LDH、SOD的含量 取各組細胞培養(yǎng)上清液,采用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH的活性。采用反復(fù)凍融法裂解各組HT22細胞,采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的含量,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
1.2.6 qRT-PCR檢測細胞中miR-190的表達水平采用Trizol法提取HT22細胞中的總RNA,應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度后置于?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。按照cDNA試劑盒操作得到cDNA,以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:SYBR Green Master Mix 10 μL/孔,正反向引物0.8 μL/孔,cDNA 1 μL/孔,ddH2O補足體系至20 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。采用2?ΔΔCt法計算miR-190(內(nèi)參U6)相對表達量。
1.2.7 Western blotting檢測CyclinD1、pro-caspase3、p21、cleaved-Caspase-3蛋白表達 各組HT22細胞中加入400 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳反應(yīng),轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育一抗稀釋液(1∶1000,4 ℃孵育24 h)與二抗稀釋液(1∶2000,室溫孵育1 h),滴加ECL,暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。
采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以±s表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
與對照組比較,10、20、30 mg/L黃芩苷組的細胞存活率無顯著差異,40 mg/L黃芩苷組的細胞存活率顯著降低(P<0.05),經(jīng)多次驗證,確定后續(xù)實驗采用10、30 mg/L黃芩苷,見圖1。
圖1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷對HT22細胞存活率的影響(±s ,n=9)Fig.1 Effects of different concentrations of baicalin on survival rate of HT22 cells (±s ,n=9)
與對照組比較,OGD組A值降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),CyclinD1、pro-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05),p21、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05);與OGD組比較,OGD+黃芩苷低劑量組、OGD+黃芩苷高劑量組A值升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),CyclinD1、pro-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05),p21、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05),見圖2~5。
圖2 黃芩苷對OGD處理造成的細胞增殖 (A) 和凋亡 (B)的影響 (±s ,n=9)Fig.2 Effects of baicalin on cell proliferation (A) and apoptosis (B) induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖3 黃芩苷對OGD處理造成的細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響 (±s ,n=9)Fig.3 Effects of baicalin on cell proliferation and apoptosisrelated proteins (±s ,n=9)
圖4 黃芩苷對OGD誘導(dǎo)細胞凋亡流式圖Fig.4 Flow cytometric diagram of baicalin on OGDinduced cell apoptosis
圖5 黃芩苷對OGD處理細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5 Effects of baicalin on proliferation and apoptosisrelated proteins expression of OGD-treated cells
與對照組比較,OGD組IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性升高(P<0.05),SOD的含量降低(P<0.05);與OGD組比較,OGD+黃芩苷低劑量組、OGD+黃芩苷高劑量組IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性降低(P<0.05),SOD的含量升高(P<0.05),見圖6、7。
圖6 黃芩苷對OGD處理造成的細胞炎性因子的影響(±s ,n=9)Fig.6 Effects of baicalin on cell inflammatory factors induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖7 黃芩苷對OGD處理造成的氧化應(yīng)激的影響 (±s ,n=9)Fig.7 Effects of baicalin on oxidative stress induced by OGD treatment (±s ,n=9)
與對照組比較,OGD組miR-190的表達水平降低(P<0.05);與OGD組比較,OGD+黃芩苷低劑量組、OGD+黃芩苷高劑量組miR-190的表達水平升高(P<0.05),見圖8。
圖8 黃芩苷對OGD處理造成的細胞中miR-190表達的影響 (±s ,n=9)Fig.8 Effects of baicalin on miR-190 expression in OGD-treated cells (±s ,n=9)
與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-190組A值升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),CyclinD1、pro-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05),p21、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05),見圖9~12。
圖9 過表達miR-190對OGD處理造成的細胞增殖 (A) 和凋亡 (B) 的影響 (±s ,n=9)Fig.9 Effects of overexpression of miR-190 on cell proliferation (A) and apoptosis (B) induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖10 過表達miR-190對OGD處理造成的細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響 (±s ,n=9)Fig.10 Effects of overexpression of miR-190 on cell proliferation and apoptois-related proteins induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖11 過表達miR-190對OGD誘導(dǎo)細胞凋亡流式圖Fig.11 Flow cytometric diagram of overexpression of miR-190 on OGD-induced cell apoptosis
圖12 過表達miR-190對OGD誘導(dǎo)細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.12 Overexpression of miR-190 on expression of cell proliferation and apoptosis associated proteins induced by OGD treatment
與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-190組IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性降低(P<0.05),SOD的含量升高(P<0.05),見圖13、14。
圖13 過表達miR-190對OGD處理造成的細胞炎性因子的影響 (±s ,n=9)Fig.13 Effects of overexpression of miR-190 on cell inflammatory factors induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖14 過表達miR-190對OGD處理造成的氧化應(yīng)激的影響 (±s ,n=9)Fig.14 Effects of overexpression of miR-190 on oxidative stress induced by OGD treatment (±s ,n=9)
與OGD+黃芩苷+anti-miR-NC組比較,OGD+黃芩苷+anti-miR-190組A值降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),CyclinD1、pro-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05),p21、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性升高(P<0.05),SOD的含量降低(P<0.05),見圖15~20。
黃芩苷是一種異黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化等作用,并可通過抑制p38 MAPK通路從而減輕人胃黏膜上皮細胞損傷[9],可抑制氧化應(yīng)激從而減輕氯化鈷誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷[10],可通過抑制氧化應(yīng)激從而減輕海馬神經(jīng)細胞損傷[11]。本研究結(jié)果顯示,OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞活力降低,凋亡率升高,提示成功建立神經(jīng)元細胞損傷模型。CyclinD1可正向調(diào)控細胞周期,促進細胞增殖,p21可抑制CyclinD1與CDK6結(jié)合形成復(fù)合物從而誘導(dǎo)細胞周期阻滯[12]。細胞接收凋亡信號后可激活線粒體途徑從而促進Caspase級聯(lián)反應(yīng),Caspase-3活化后形成cleaved-Caspase-3從而誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示,OGD可明顯降低神經(jīng)元細胞中CyclinD1、pro-Caspase-3的表達水平及提高p21、cleaved-Caspase-3的表達水平,黃芩苷處理后可明顯提高OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞活力,降低細胞凋亡率,并可促進CyclinD1、pro-Caspase-3表達及抑制p21、cleaved-Caspase-3表達,提示黃芩苷可促進OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞增殖及抑制細胞凋亡從而減輕細胞損傷。炎性因子IL-1β、TNF-α在腦缺血再灌注損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用,其水平升高可加重神經(jīng)元細胞損傷,而SOD的含量升高可通過清除氧自由基從而增強其抗氧化能力,LDH的活性升高可促進氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生而促進神經(jīng)細胞凋亡從而加重神經(jīng)細胞損傷[14]。本研究結(jié)果顯示,OGD處理后神經(jīng)元細胞IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性升高,而SOD的含量降低,黃芩苷處理后可明顯降低IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性,而提高SOD的含量,提示黃芩苷可通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激而抑制神經(jīng)元細胞凋亡從而減輕OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷。
圖15 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的細胞增殖 (A) 和凋亡 (B) 的影響 (±s ,n=9)Fig.15 Inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on cell proliferation (A) and apoptosis (B) induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖16 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響 (±s ,n=9)Fig.16 Inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on cell proliferation and apoptois-related proteins induced by OGD treatment (±s ,n=9)
圖17 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的細胞凋亡流式圖Fig.17 Flow cytometric diagram of inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on apoptosis induced by OGD treatment
圖18 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.18 Inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on cell proliferation and apoptosis-related proteins expression caused by OGD treatment
圖19 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的細胞炎性因子的影響 (±s ,n=9)Fig.19 Inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on cytoinflammatory factors caused by OGD treatment (±s ,n=9)
圖20 抑制miR-190表達逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD處理造成的氧化應(yīng)激的影響 (±s ,n=9)Fig.20 Inhibition of miR-190 expression reversed effects of baicalin on oxidative stress caused by OGD treatment(±s ,n=9)
miR-190通過靶向MAPK8和調(diào)節(jié)MAPK8/ERK信號通路抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡從而減輕細胞損傷[15]。本研究結(jié)果顯示,OGD可明顯降低神經(jīng)元細胞中miR-190的表達水平,而黃芩苷可明顯提高miR-190的表達水平,提示黃芩苷可能通過上調(diào)miR-190的表達從而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示,miR-190過表達可明顯提高OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞活力,降低細胞凋亡率,還可降低IL-1β、TNF-α的水平及LDH的活性,提高SOD的含量,提示miR-190過表達可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激而抑制細胞凋亡從而減輕OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷。同時本研究結(jié)果顯示,抑制miR-190表達可明顯逆轉(zhuǎn)黃芩苷對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞增殖、凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激的作用。
綜上所述,黃芩苷可通過上調(diào)miR-190的表達而抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激進而抑制神經(jīng)元細胞凋亡從而減輕OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷,miR-190可能作為黃芩苷治療缺血性腦血管疾病的潛在靶點,但關(guān)于其具體作用機制尚未闡明。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突