宋琳　張利　蔣益蘭

〔摘要〕 目的 研究健脾消癌方對缺氧微環(huán)境下結(jié)腸癌細胞生物學行為的影響，并探討其抑癌機制。方法 將對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620細胞隨機分為健脾消癌方組（10%健脾消癌方的含藥血清培養(yǎng)）和對照組（10%的空白血清培養(yǎng)），兩組同時在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d。采用Real-time PCR和Western blot檢測兩組結(jié)腸癌細胞低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、Survivin mRNA及蛋白的表達;MTT法檢測細胞增殖;Transwell檢測細胞遷移能力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果 與對照組比較，健脾消癌方組結(jié)腸癌SW620細胞HIF-1α、VEGF、Bcl-2 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05），Caspase-3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）;健脾消癌方組結(jié)腸癌SW620細胞在48、72、96 h時細胞存活率降低（P<0.01），遷移和穿透室膜細胞數(shù)降低（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05）。結(jié)論 健脾消癌方能下調(diào)缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細胞HIF-1α水平，間接影響其下游靶基因的表達，抑制結(jié)腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡、減弱細胞的遷移，發(fā)揮抗癌作用。

〔關(guān)鍵詞〕 結(jié)腸癌;健脾消癌方;缺氧;低氧誘導(dǎo)因子-1α;生物學行為;抑癌機制

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Jianpi Xiaoai Formula on the biological behavior of colon cancer cells in hypoxic microenvironment and to explore its possible mechanism. Methods SW620 colon cancer cells in logarithmic growth phase were randomly divided into the Jianpi Xiaoai Formula group （cultured with 10% Jianpi Xiaoai Formula serum） and the control group （cultured with 10% blank serum）， both groups were induced and cultured in hypoxic environment for 14 days at the same time. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expressions of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）， VEGF，Bcl-2， Caspase-3， MMP-9， Survivin mRNA in colon cancer cells of the two groups; MTT was used to detect cell proliferation; transwell was used to detect cell migration and invasion ability; flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Results Compared with the control group， the mRNA and protein levels of HIF-1α， VEGF and Bcl-2 in SW620 colon cancer cells of the Jianpi Xiaoai Formula group decreased （P<0.05）， Caspase-3 increased （P<0.05）; the survival rate of SW620 colon cancer cells decreased at 48， 72 and 96 hours （P<0.01）， the number of migrating and penetrating ependymal cells decreased （P<0.05）， and the cells apoptotic rate increased （P<0.05） in the Jianpi Xiaoai Formula group. Conclusion Jianpi Xiaoai Formula can down-regulate the expression of HIF-1α in colon cancer cells in hypoxic microenvironment， indirectly affect the expression of its downstream target genes， inhibit the proliferation of colon cancer cells， promote cell apoptosis， reduce cell migration， so as to play an anti-cancer role.

〔Keywords〕 colon cancer; Jianpi Xiaoai Formula; hypoxia; hypoxia inducible factor-1α; biological behavior; anti-cancer mechanism

結(jié)腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤的第三位，根據(jù)中國癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國結(jié)腸癌發(fā)病率占全球24.3%，死亡率占全球22.9%，并且呈逐年上升趨勢[1]。目前，結(jié)腸癌治療主要為手術(shù)輔以放化療、基因治療及分子靶向治療等，其5年總體生存率仍不及50%[2]，結(jié)腸癌已成為嚴重威脅人類健康的一類疾病。因此，研究結(jié)腸癌發(fā)病機制中的關(guān)鍵調(diào)控分子以及揭示侵襲轉(zhuǎn)移機制，對結(jié)腸癌的防治具有重要的理論價值。研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)。由于惡性腫瘤異常的血管形成以及腫瘤細胞無限制的生長導(dǎo)致微環(huán)境中氧含量降低，即缺氧微環(huán)境。缺氧條件下可導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）的積累，腫瘤細胞在HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下適應(yīng)低氧環(huán)境，并且通過激活靶基因使其在腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3-4]，導(dǎo)致腫瘤常規(guī)治療預(yù)后較差。因此，研究HIF-1α信號通道與腫瘤之間的關(guān)系尤為重要。

中醫(yī)藥具有多途徑、多靶點的特點，可有效改善腫瘤微環(huán)境，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡、抑制誘導(dǎo)腫瘤基因表達和癌癥細胞遷移[5]。本課題組前期臨床研究[6-7]表明，健脾消癌方治療晚期結(jié)直腸癌能穩(wěn)定瘤體、有效降低腫瘤標志物、提高患者生活質(zhì)量、延長腸癌患者中位無進展生存期和中位總生存時間。

本文從分子生物學層面探討健脾消癌方對結(jié)腸癌的抗癌機制，研究在缺氧微環(huán)境下健脾消癌方對SW620結(jié)腸癌細胞HIF-1α水平及下游靶基因VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、Survivin的影響，揭示其在缺氧微環(huán)境下的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1? 動物及細胞系

SPF級SD大鼠10只，1.5～2個月齡，體質(zhì)量（200±20） g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2007-005。結(jié)腸癌SW620細胞系購自中科院上海細胞研究所（批號2018051233577），用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（內(nèi)含10%小牛血清，1%鏈青霉素），在CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。缺氧誘導(dǎo)條件：37 ℃，5% CO2，94% N2，培養(yǎng)14 d。

1.2? 藥物

健脾消癌方（甘草3 g，炒枳殼6 g，莪術(shù)10 g，法半夏10 g，黨參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，淫羊藿15 g，郁金15 g，黃芪20 g，薏苡仁30 g，半枝蓮30 g，靈芝30 g，重樓30 g，白花蛇舌草30 g）飲片符合2020年版《中華人民共和國藥典》[8]規(guī)定的標準，購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。將以上所有藥按5倍量處方，加8倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，過濾;再加6倍量水，煎煮1 h，過濾，合并兩次濾液靜置24 h，12 000 r /min離心15 min后將上清液濃縮至850 mL，4 ℃冷藏48 h，離心冷藏液得到約800 mL上清，滅菌后制成含生藥2.1 g/mL的水煎劑備用。

1.3? 主要試劑及儀器

胎牛血清（批號：P160704）、二甲亞楓（批號：35605-5G-F）均購自美國Sigma公司;胰酶消化液（批號：824300）、RPMI1640細胞培養(yǎng)液（批號：SA166734）購自美國Gibco公司;青霉素（批號：25465787）、鏈霉素（批號：5465687）、乙醇（批號：8754187）購自上海國藥集團;DEPC、MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒（批號：SA1022，AB218110，AB23356）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司;SYBR GREEN試劑盒（批號：P160704，ST728）、Western blot一抗（批號：ab78334）購自美國ABI公司;Western blot二抗（南京建成生物科技研究所，批號：ab189075）;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：ab489075）;Transwell小室（批號：ab889075）（美國康寧公司）。CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Multiskan 全波長酶標儀（德國Thermo公司）;QuantStudioTM 6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ABI公司）;PowerPAC凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）;FACS AriaⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4? 健脾消癌方含藥血清制備

參考文獻[9]方法制備健脾消癌方藥物和空白血清，SD 大鼠10只，雌雄各半，隨機分成 2 組，每組5只。健脾消癌方組大鼠灌胃健脾消癌方[10.8 g/kg，相當于70 kg成年人等效量（120 g/d）]，對照組按大鼠體質(zhì)量灌胃等容積的生理鹽水。每日1次，連續(xù)6 d，于第7天末次灌胃1 h后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，腹主動脈取血，4 ℃保存，24 h內(nèi)離心（2 000 r/min，10 min），吸取血清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 細胞分組與處理

將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620細胞用胰酶消化后，按1∶3擴大到2個培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù) 3 次。將2個培養(yǎng)皿的細胞隨機分為對照組和健脾消癌方組，其中對照組細胞用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，同時用10%的空白血清培養(yǎng)，健脾消癌方組細胞用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)14 d，同時用含10%健脾消癌方的血清培養(yǎng)。

1.6? 觀察指標及檢測方法

1.6.1? Real-time PCR法檢測HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin mRNA水平? 收集細胞，Trizol提取各組細胞總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計并合成HIF-1、VEGF、Survivin、MMP-9、Bcl-2、Caspase-3及GAPDH定量引物，引物序列見表1。

1.6.2? Western blot法檢測HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin蛋白表達水平? 用胰酶消化并收集處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620細胞系。BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性。取30 μg 蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%（M/V）脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h;用TBST洗膜3次后，加入用TBST按1∶500稀釋的一抗，置于搖床4 ℃冰箱過夜;用TBST洗膜3次，每次5 min;將二抗用TBST按1∶1 000稀釋后室溫與膜接觸，孵育2 h后，TBST洗膜3次;加ECL顯影劑，用自動凝膠成像分析儀檢測，用凝膠成像處理系統(tǒng)對目標條帶的分子量和光密度值做處理分析。

1.6.3? MTT法檢測結(jié)腸癌SW620細胞增殖活性? 將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620細胞隨機分為健脾消癌方組和對照組，給予相應(yīng)干預(yù)后，調(diào)整細胞濃度按4×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)12 h。兩組各孔均分別加入含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)67 h后，取出96孔板，每孔中加入MTT試劑20 μL，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。小心吸出各孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上避光孵育20 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度（OD）值，以對照組OD值為參數(shù)，計算細胞存活率。

1.6.4? Transwell細胞遷移實驗檢測結(jié)腸癌SW620細胞遷移? 將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌SW620細胞調(diào)整濃度后按4×105/孔接種于6孔板，隨機分為健脾消癌方組和對照組。將細胞換成不完全培養(yǎng)液饑餓12 h，胰酶消化吸收細胞，PBS緩沖液洗滌3次，用不完全DMEM培養(yǎng)基稀釋細胞調(diào)整密度為106/mL，在每孔上室加入150 μL細胞懸液，下室加入500 μL 10% DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱48 h后，從培養(yǎng)板中取出Transwell小室，吸出液體，PBS緩沖液洗滌小室3遍后，加入無水乙醇，放置30 min。將小室反扣于吸水紙上，室溫干燥基底膜，用結(jié)晶紫染色10 min，流水漂洗3遍，于顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野觀察細胞并拍照，Image J軟件計數(shù)細胞數(shù)值，結(jié)果以細胞數(shù)表示。

1.6.5? 流式細胞術(shù)檢測結(jié)腸癌SW620細胞凋亡? 取Falcon管分為健脾消癌方組和對照組，將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細胞用0.25%胰酶消化，離心收集后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加1×緩沖液制成1×106/mL細胞懸液;每個Falcon管中加入100 μL細胞懸液，樣本管同時加入AV-FITC和PI染料，同步設(shè)立陰性管（不加任何熒光抗體）和兩只單陽管（分別加入AV-FITC和PI染料）震蕩混勻后室溫避光孵育20 min。用1×緩沖液洗滌細胞1次，棄上清;用100 μL 1×緩沖液溶解0.5 μg Sav-FITC加入Falcon管中，混勻。加入5 μL PI，室溫避光孵育15 min。各管依次加入1×Binding緩沖液400 μL，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測實驗結(jié)果。

1.7? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 兩組HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin mRNA表達水平比較

與對照組比較，健脾消癌方組HIF-1α、VEGF及Bcl-2 mRNA表達降低（P<0.05），Caspase-3 mRNA表達升高（P<0.05）。見圖1。

2.2? 兩組HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin蛋白表達比較

與對照組比較，健脾消癌方組HIF-1α、VEGF及Bcl-2 蛋白表達降低（P<0.05），Caspase-3蛋白表達升高（P<0.05）。見圖2。

2.3? 兩組SW620細胞存活率比較

第0、24、48、72和96時，健脾消癌方組結(jié)腸癌細胞的存活率分別為（99%±1%），（107%±2%），（101%±4%），（89%±5%）和（78%±6%），對照組結(jié)腸癌細胞存活率分別為（100%±1%），（112%±2%），（148%±8%），（179%±4%）和（203%±6%）。與對照組比較，健脾消癌方組第48、72、96小時SW620細胞存活率降低（P<0.01）。見圖3。

2.4? 兩組SW620細胞遷移能力比較

倒置顯微鏡下可見對照組細胞數(shù)目較多，大小均一，分布均勻，細胞貼壁生長狀態(tài)，折光性較好，增殖較快;而健脾消癌方組細胞數(shù)目較對照組細胞數(shù)目明顯減少，細胞間連接減少，培養(yǎng)液中可見漂浮的細胞碎片，細胞形態(tài)呈皺縮、變小。結(jié)果顯示健脾消癌方組遷移和穿透室膜的結(jié)腸癌細胞數(shù)為（72.8±4.3），對照組為（92.3±4.1），與對照組比較，健脾消癌方組遷移和穿透室膜的結(jié)腸癌細胞數(shù)降低（P<0.05）。見圖4-5。

2.5? 兩組SW620細胞細胞凋亡率比較

健脾消癌方組結(jié)腸癌細胞的凋亡率（16.22%± 1.07%），高于對照組（5.17%±0.56%）（P<0.05）。見圖6。

3 討論

《素問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛”?！端貑枴ち⒅即笳摗吩唬骸拔镏鷱挠诨?，物之極由乎變”，論述了陰陽轉(zhuǎn)化之極致狀態(tài)。由此，機體產(chǎn)生腫瘤之原因在于環(huán)境之變化導(dǎo)致陰陽格拒而成，包括內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境，中醫(yī)腫瘤辨證論治的實質(zhì)就是干預(yù)腫瘤微環(huán)境[10]。

缺氧是實體瘤客觀存在的微環(huán)境，貫穿與腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程。研究表明，腫瘤細胞在缺氧微環(huán)境中不但能繼續(xù)存活，還能通過一系列機制繼續(xù)生長、逃脫缺氧應(yīng)急損傷，調(diào)控血管生長、能量代謝等使自身適應(yīng)缺氧環(huán)境，這在腫瘤的發(fā)生和惡性進展中扮演重要角色[11-13]。HIF-1α是一種缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核與特定啟動子的反應(yīng)元件結(jié)合后，能調(diào)控上百種靶基因的表達，從而對細胞適應(yīng)缺氧環(huán)境起調(diào)控作用，其中包括VEGF[14]、MMP-9[15]、Survivin[16]、Caspase-3[17]、Bcl-2[18]等。VEGF是已知最強的血管滲透劑，能提高血管尤其是微小血管的通透能力，為瘤細胞生長和毛細血管網(wǎng)建立提供物質(zhì)支持，對于預(yù)測腫瘤生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后等有重要意義[14]。MMPs是一類Zn2+、Ca2+依賴性內(nèi)肽酶家族，能降解并破壞細胞外基質(zhì)或基膜，MMPs能調(diào)控細胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成等[15]。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小的成員，定位于人類染色體17q25上，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，它能通過蛋白酶依賴途徑調(diào)控細胞凋亡[16]。Caspase是一類在線粒體途徑的細胞凋亡過程中起著極其重要的作用的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下結(jié)合特異輔因子后激活，進而激活下游效應(yīng)型Caspase，通過裂解特異性底物及激活內(nèi)源性核酸酶，最終使細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)和生化特征，發(fā)生不可逆的死亡[17]。Caspase和Survivin之間關(guān)系密切，Survivin是一種多功能蛋白，能通過Caspase蛋白酶依賴途徑調(diào)控細胞凋亡[19]。Bcl-2家族蛋白是細胞生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其家族成員間通過精準的平衡調(diào)控細胞的增殖和凋亡，Bcl-2基因及其編碼的蛋白能抑制細胞凋亡，因此又稱為凋亡抑制基因[18]。

中醫(yī)學認為，結(jié)腸癌多由于“虛”“毒”“瘀”相互作用、相互影響而形成。健脾消癌方是湖南名醫(yī)蔣益蘭教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗以“益氣健脾，化瘀解毒”為法創(chuàng)制而成，健脾消癌方以黨參、薏苡仁益氣健脾，以健生化之源，而療諸虛不足，從而扶正固本;郁金、莪術(shù)活血化瘀，白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒、散結(jié)消癰，全方配伍攻補兼施，共奏益氣健脾，化瘀解毒之功。健脾消癌方在降低結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長生存期，改善晚期結(jié)腸癌患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量、穩(wěn)定瘤體、調(diào)節(jié)免疫因子CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞等方面具有明顯優(yōu)勢[7，20]。并且前期實驗也通過TGF-β/LncRNA-ATB/miR-200a信號通路[21]及Wnt/β-catenin信號通路[22]證實健脾消癌方通過多環(huán)節(jié)、多靶點起到抗腫瘤的作用。

本實驗在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW620細胞，同時用健脾消癌方含藥血清培養(yǎng)14 d后，采用定量Real-time PCR檢測SW620細胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達情況，結(jié)果提示健脾消癌方能抑制缺氧誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞高表達HIF-1α;進一步實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α下游靶基因發(fā)生了相應(yīng)表達變化，其中VEGF、Bcl-2水平較對照組降低，Caspase-3較對照組升高;MMP-9、Survivin水平較對照組略有降低，但在本次實驗中表達差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于健脾消癌方引起的HIF-1α下調(diào)的程度不足以引起其下游靶基因MMP-9、Survivin表達產(chǎn)生統(tǒng)計學差異。本次研究也證實健脾消癌方能抑制缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細胞HIF-1α的表達，進而引起下游一些促癌因子VEGF、Bcl-2表達降低，而抑癌因子Caspase-3表達升高，發(fā)揮抗癌效應(yīng)。

本研究觀察了健脾消癌方處理的結(jié)腸癌細胞生物學行為。健脾消癌方干預(yù)下，缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌SW620細胞在MTT實驗的第0、24、48、72、96小時，細胞存活率分別為99%，107%，101%，89%和78%，整體生存曲線在對照組下方，其中在48、72和96 h 3個時間點上，健脾消癌方干預(yù)的SW620細胞存活率較對照組降低。并且健脾消癌方干預(yù)的SW620細胞凋亡率明顯高于對照組，表明健脾消癌方能抑制缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，發(fā)揮對結(jié)腸癌的治療作用。Transwell實驗證實了健脾消癌方干預(yù)的缺氧結(jié)腸癌SW620細胞的遷移和穿透小室的能力較對照組降低，說明健脾消癌方能抑制缺氧環(huán)境中結(jié)腸癌細胞的遷移。

綜上所述，健脾消癌方能抑制缺氧環(huán)境下結(jié)腸癌SW620細胞增殖，促進細胞凋亡，減弱細胞遷移和侵襲能力，從而發(fā)揮抗癌作用。

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