陳暢，何希君，汪昊，伍靖賢，吳睿智，丁佰韜，步志高，陳秋生*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069；3. 江蘇省濱?？h農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 鹽城 224523)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)自2018年在我國首次暴發(fā)以來備受關(guān)注，由于該病目前缺乏有效的商品化疫苗，一旦發(fā)生疫情，只能通過撲殺感染豬來控制疫情，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASF由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起，該病毒是非洲豬瘟科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[1]。病毒顆粒的直徑為175～215 nm，呈20面體對稱，有囊膜，基因組為雙股線狀DNA，大小170～190 kb[2]。ASFV主要在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中復(fù)制[3-4]。病毒主要分布于病豬的各組織器官、體液、分泌物和排泄物中，以淋巴結(jié)、脾臟和腎臟中含量最高。病毒主要通過豬的消化道和呼吸道感染，吸血昆蟲叮咬也可機(jī)械傳播本病[5]。該病感染率高，發(fā)病快，致死率高，在世界范圍內(nèi)流行，嚴(yán)重威脅全球的生豬養(yǎng)殖業(yè)。

淋巴結(jié)是機(jī)體重要的免疫器官，當(dāng)機(jī)體某器官或部位發(fā)生病變或被病毒、細(xì)菌等異物入侵時，病原體可隨淋巴管擴(kuò)散到附近相應(yīng)的淋巴結(jié)，淋巴結(jié)具有攔截和清除這些病毒和細(xì)菌等異物的作用，防止病原體擴(kuò)散。臨床上ASFV感染豬出現(xiàn)脾腫大，腎臟皮質(zhì)和腎盂出血，膀胱黏膜、心外膜、心內(nèi)膜和胸膜有瘀點出血等[6]。除此之外，淋巴結(jié)更是該病發(fā)生病理變化的重要器官，有文獻(xiàn)指出，感染ASFV后淋巴結(jié)廣泛性出血，呈大理石花紋狀[7]。之前的文獻(xiàn)多是從器官水平上對該病的病理變化做了宏觀研究，而關(guān)于該病對淋巴結(jié)組織的具體損傷和病理變化研究，以及從細(xì)胞水平和微觀水平上對該病的研究極少。本研究系統(tǒng)地觀察并分析了感染ASFV的各種淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)不同淋巴結(jié)感染ASFV后均出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)變化，其中，胃肝淋巴結(jié)相較于其他淋巴結(jié)病理變化最為顯著。因此，本研究選取感染ASFV的胃肝淋巴結(jié)作為研究對象，通過光鏡和電鏡技術(shù)對ASFV引起的胃肝淋巴結(jié)病理組織學(xué)變化以及病理變化和病毒劑量的關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)比較，為后續(xù)ASF病理組織學(xué)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試驗設(shè)計

本試驗選擇12周齡健康的SPF豬(由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心提供)，并分為3組，每組3頭豬，其中1組作為健康對照組，另外2組作為感染組，肌肉注射ASFV HLJ/18株(由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)。本研究注射的病毒滴度為107.2HAD50/mL(HAD50：半數(shù)紅細(xì)胞吸附量)，2感染組注射病毒劑量分別為103HAD50和104HAD50。感染104HAD50劑量的豬第6天死亡并剖檢取材，作為高劑量組；感染103HAD50劑量的豬第8天死亡并剖檢取材，作為低劑量組。病毒感染試驗與樣品采集和處理，均在哈爾濱獸醫(yī)研究所P4實驗室進(jìn)行。

1.2 HE染色

采集的胃肝淋巴結(jié)樣品保存在4%多聚甲醛(P6148，Sigma-Aldrich)中，石蠟包埋，用切片機(jī)(RM2015，德國Leica)制成石蠟切片，HE染色(蘇木精1 min 40 s，伊紅8 s)。奧林巴斯顯微鏡(DP73，日本Olympas)觀察分析。

1.3 網(wǎng)狀纖維染色

用Gordon and Sweets方法對胃肝淋巴結(jié)網(wǎng)狀纖維進(jìn)行染色。切片用1%高錳酸鉀(441244，Sigma-Aldrich)氧化3 min，草酸溶液(247537，Sigma-Aldrich)漂白2.5 min，2.5%的鐵銨明礬(A9750，北京陽光生物技術(shù)有限公司)處理15 min使嗜銀染色效果更好，氨水銀鹽溶液(R20376，源葉生物技術(shù)有限公司)鍍銀，10%甲醛(Sigma-Aldrich F8775)處理切片1.5 min還原銀鹽，0.2%的氯化金(S30172，源葉生物技術(shù)有限公司)調(diào)整顏色2 min，最后用5%的硫代硫酸鈉(S24159，源葉生物技術(shù)有限公司)去除銀鹽2.5 min。顯微鏡觀察。

1.4 透射電子顯微鏡

1 mm3的胃肝淋巴結(jié)組織塊在2.5%戊二醛溶液中固定9 h，0.1 mol/L磷酸緩存液(pH=7.4)清洗3次，15 min/次。丙酮梯度脫水(30%、50%、70%、80%、90%各1次，15 min/次，100%丙酮3次，20 min/次)。包埋劑浸漬、修塊、切片、染色(3%醋酸雙氧鈾25 min，3%檸檬酸鉛15 min)。觀察切片并用透射電子顯微鏡(日立H-7650)拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯檢驗。GraphPad Prism 5.0軟件繪制相應(yīng)的直方圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色

胃肝淋巴結(jié)被膜下、小梁周圍以及皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)等處嚴(yán)重淤血、出血，嚴(yán)重者正常結(jié)構(gòu)被破壞，可見炎性細(xì)胞增多(圖1)。低劑量感染豬淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)變化不明顯(圖1a、1c)，病理變化主要發(fā)生在被膜下，充滿大量紅細(xì)胞，但紅細(xì)胞未破損(圖2a)。高劑量感染豬相較低劑量感染豬病理變化更嚴(yán)重，淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)模糊，與周圍組織界限不清，不形成規(guī)則的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，淋巴小結(jié)區(qū)域也嚴(yán)重淤血(圖1b、1d)。高劑量感染豬被膜下和小梁周圍都嚴(yán)重出血，淋巴竇間隙增大，分布在其中的紅細(xì)胞破裂并發(fā)生溶血現(xiàn)象(圖2b)。關(guān)于淋巴細(xì)胞的變化情況，正常組淋巴細(xì)胞呈規(guī)則的圓形，淋巴細(xì)胞之間網(wǎng)狀細(xì)胞均勻分布其間(圖3a)；低劑量感染豬淋巴細(xì)胞分布無規(guī)則，有少量紅細(xì)胞從血管滲出分布于淋巴細(xì)胞之間(圖3b)；高劑量感染豬淋巴細(xì)胞形狀發(fā)生變化，呈不規(guī)則的“括號狀”或“逗點狀”，可見大量紅細(xì)胞破裂，發(fā)生溶血現(xiàn)象(圖3c)。本研究中未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞缺失，與正常組相比，103HAD50劑量組和104HAD50劑量組淋巴細(xì)胞甚至有增多的趨勢。

2.2 網(wǎng)狀纖維染色

對照豬網(wǎng)狀纖維分布稀疏，纖維不發(fā)達(dá)，網(wǎng)狀纖維的分支細(xì)而疏松，染色較淺(圖4a、4d、4g)；感染豬網(wǎng)狀纖維變粗，分布雜亂不規(guī)則，圍繞淋巴小結(jié)周圍的和小梁周圍的網(wǎng)狀纖維數(shù)量增多，纖維增粗，顏色深染，且ASFV劑量越高，網(wǎng)狀纖維直徑越大，數(shù)量越多(圖4b、4c、4e、4f、4h、4i)。與對照豬相比，低劑量感染豬和高劑量感染豬胃肝淋巴結(jié)網(wǎng)狀纖維面積百分占比均增加，差異極顯著(P<0.01)。且劑量越高，網(wǎng)狀纖維面積百分占比越大(圖5)。

a. 103HAD50劑量組：結(jié)構(gòu)完整的紅細(xì)胞(→)；b. 104HAD50劑量組：破裂的紅細(xì)胞()

a. 對照組：淋巴細(xì)胞呈橢圓形或圓形(→)；b. 103HAD50劑量組：淋巴細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形(→)，淋巴細(xì)胞間散在分布的紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞()；c. 104HAD50劑量組：變形呈“逗點狀”的淋巴細(xì)胞(→)，淋巴細(xì)胞間大量分布的紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞()

a、b、c.低倍鏡下淋巴小結(jié)周圍網(wǎng)狀纖維；d、e、f.被膜下網(wǎng)狀纖維；g、h、i.高倍鏡下淋巴小結(jié)周圍網(wǎng)狀纖維。Ln.淋巴小結(jié)；Tb.淋巴小梁(→);.被膜

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

2.3 透射電子顯微鏡

電鏡下，ASFV病毒顆粒的復(fù)制主要在巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中(圖6)，也有部分病毒顆粒在淋巴細(xì)胞胞核中復(fù)制(圖7a)。ASFV感染胃肝淋巴結(jié)后，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都出現(xiàn)顯著的病理組織學(xué)變化，ASFV顆粒在淋巴細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，破壞淋巴細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，核膜破裂，細(xì)胞核變形皺縮，核染色質(zhì)邊集或聚集成團(tuán)，核中可見大量未成熟的ASFV顆粒(圖7a)。病毒顆粒結(jié)構(gòu)清晰完整，呈典型的正六邊形，核呈致密圓形。巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞間，淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞間充滿大量不成型的紅細(xì)胞，溶血現(xiàn)象嚴(yán)重(圖7b)。有些細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞核變形呈新月形和鐮刀形(圖7c)。被ASFV感染的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中含有大量線粒體，為ASFV復(fù)制提供能量，有的線粒體發(fā)生腫脹，完整雙層膜結(jié)構(gòu)被破壞，缺損嚴(yán)重(圖8a)，有些線粒體甚至出現(xiàn)空泡化的現(xiàn)象(圖8b)，有的靠近ASFV顆粒的線粒體膜消失，線粒體嵴模糊不清(圖8c)。

a.104HAD50劑量ASFV感染的巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中含大量未成熟的病毒顆粒()；b.103HAD50劑量ASFV感染的巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)病毒顆粒()。V.ASFV顆粒；ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mit.線粒體；Bv.血管

a.被ASFV感染的淋巴細(xì)胞胞核，核中可見未成熟ASFV顆粒()；b.ASFV感染后細(xì)胞間出血嚴(yán)重，大量紅細(xì)胞聚集發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核，細(xì)胞核呈鐮刀形或新月形(★)。V.ASFV顆粒；N.細(xì)胞核

a.104HAD50劑量ASFV感染的淋巴細(xì)胞胞核，核中線粒體結(jié)構(gòu)破壞()；b.104HAD50劑量ASFV感染巨噬細(xì)胞中線粒體腫脹，發(fā)生空泡化()，線粒體膜溶解消失()，胞外可見空心ASFV顆粒()；c.103HAD50劑量ASFV感染巨噬細(xì)胞中存在結(jié)構(gòu)完整的ASFV顆粒()，ASFV周圍線粒體的線粒體嵴不明顯(→)，膜溶解消失()。V.ASFV顆粒；Mit.線粒體；N.細(xì)胞核

3 討論

本試驗采用的毒株HLJ/18是由哈爾濱獸醫(yī)研究所在暴發(fā)非洲豬瘟的豬原代肺泡巨噬細(xì)胞中所分離，該病毒基因型為II型，與東歐流行的ASFVs基因相近。研究表明HLJ/18接種豬在接種后9 d內(nèi)死亡，接觸豬在與接種豬接觸后2周內(nèi)死亡，在豬中毒性很強(qiáng)，屬于高毒力毒株[8]。豬接種病毒后3～5 d均出現(xiàn)疾病癥狀，包括發(fā)燒(超過41 ℃)、食欲不振、嗜睡、皮膚發(fā)紅、耳朵邊緣和尾巴及腿末端發(fā)紺、呼吸困難和嘔吐等，6～9 d內(nèi)均死亡，表明攻毒建模成功。本研究用HE染色法、網(wǎng)狀纖維染色法和透射電鏡觀察了ASFV感染豬胃肝淋巴結(jié)的病理組織學(xué)變化。胃肝淋巴結(jié)病理組織學(xué)變化明顯，淤血、出血現(xiàn)象嚴(yán)重，且存在ASFV劑量的差異性。有文獻(xiàn)報道，ASFV感染后淋巴結(jié)廣泛性出血，其中胃、肝、腎、腹部淋巴結(jié)尤其腸系膜淋巴結(jié)受影響最大，下頜淋巴結(jié)、咽淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)出血頻率較低[5]。本研究發(fā)現(xiàn)豬淋巴結(jié)病理組織學(xué)變化以胃肝淋巴結(jié)變化顯著，相較于其他淋巴結(jié)出血更明顯。網(wǎng)狀纖維由Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，纖維細(xì)小、分支多，交織成網(wǎng)，嗜銀染色呈黑色。主要分布在結(jié)締組織與其他組織交界處，在造血器官和內(nèi)分泌腺中構(gòu)成支架。豬胃肝淋巴結(jié)網(wǎng)狀纖維主要密集分布在淋巴結(jié)髓質(zhì)部、小梁處、血管壁和淋巴小結(jié)外周等處，在淋巴小結(jié)的生發(fā)中心處分布較少。本研究發(fā)現(xiàn)感染豬網(wǎng)狀纖維變粗，纖維數(shù)量明顯增加，且ASFV劑量增加，網(wǎng)狀纖維數(shù)量增多，差異顯著。可能是淋巴結(jié)在受到ASFV入侵后結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，正常生理功能受到影響，為了減少ASFV對淋巴結(jié)組織造成的損傷，機(jī)體自身發(fā)生代償性增生以維持正常生理功能。

電鏡下發(fā)現(xiàn)大量未成熟ASFV顆粒存在于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞核中，核皺縮和碎裂，正常結(jié)構(gòu)被破壞。ASFV復(fù)制主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中被稱為“病毒工廠”的區(qū)域，但早期階段是在細(xì)胞核中進(jìn)行[9]。ASFV在核中復(fù)制早期階段的作用目前尚不清楚，但卻對細(xì)胞核有較大影響，包括幾種核蛋白質(zhì)的重新分布，以及RNA聚合酶Ⅱ的去磷酸化和隨后的降解等[10]。也有文獻(xiàn)報道在細(xì)胞核中合成的ASFV DNA小片段，可能是較大的細(xì)胞質(zhì)序列的前體，以及全長成熟基因組的多聯(lián)體中間體[9]。ASFV在核中進(jìn)行早期復(fù)制，可能對ASFV之后在胞質(zhì)中進(jìn)一步加工有重要意義，為后續(xù)大量ASFV顆粒的合成提供數(shù)量保障，有利于ASFV感染。

ASFV感染后，電鏡下可見組織細(xì)胞間充滿大量紅細(xì)胞，且紅細(xì)胞破裂溶血，與HE染色結(jié)果一致。有研究提出假說：淋巴結(jié)毛細(xì)血管內(nèi)缺少定植的巨噬細(xì)胞，使得感染激活毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬作用，血管內(nèi)溶酶體大量增生，吞噬細(xì)胞碎片增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增大，引起毛細(xì)血管腔阻塞，血管內(nèi)壓力增大，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞破裂，使得細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞暴露而引起出血[11]。

感染ASFV后有些細(xì)胞發(fā)生凋亡導(dǎo)致細(xì)胞核呈月牙形和鐮刀形。ASFV大量的增殖會誘發(fā)感染細(xì)胞壞死、凋亡，隨后大量ASFV游離于血液、淋巴、間質(zhì)組織中，造成各組織器官的感染[12]。有文獻(xiàn)認(rèn)為，單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的破壞被歸因于凋亡[13]或壞死[14]。ASFV在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中復(fù)制，當(dāng)ASFV數(shù)量達(dá)到一定水平后，ASFV主要通過對細(xì)胞核和線粒體產(chǎn)生破壞作用，使宿主細(xì)胞不能很好地接受細(xì)胞核“細(xì)胞代謝活動控制中心”的指令。線粒體損傷后對宿主細(xì)胞的能量供應(yīng)也會受到影響，加上線粒體也參與細(xì)胞凋亡，ASFV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，使得宿主細(xì)胞不能正常發(fā)揮生理功能而裂解死亡，大量ASFV顆粒從細(xì)胞中釋放出來有利于病毒的后續(xù)感染。