于慧茹，陶田谷晟，楊顯超，劉健，李鑫，白藝蘭，王建，李凱航，周錦萍

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

禽白血病(avian leukosis)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的以禽類造血組織中某些細胞成分過度增生為主的一類可傳染的腫瘤性疾病[1]。該病為雞群中普遍存在并誘發(fā)腫瘤的三大類病之一，對養(yǎng)禽業(yè)的危害幾乎波及所有商品雞群。禽白血病的防治尚無有效疫苗及藥物，各國主要通過對雞群開展病毒凈化來控制該病。由于該病的垂直傳播機制，從種禽到商品禽會產(chǎn)生逐級放大效應，因此對原種禽場的凈化顯得尤為重要。本研究采用禽白血病凈化技術結合生物安全防控措施對上海市某原種雞場開展了禽白血病的凈化工作，經(jīng)過4個世代的凈化，原種雞場的禽白血病病原陽性率顯著降低，生產(chǎn)性能也得到提高，為原種雞場的禽白血病凈化提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

在對上海市某原種雞場的某地方品種調(diào)查的基礎上，于2017—2020年對其保種核心群進行連續(xù)4個世代外源性ALV的檢測與凈化。試驗采集的樣品包括胎糞、種蛋、血液、抗凝血和精液。

1.2 主要試劑

ALV p27抗原、ALV A/B亞群(ALV-A/B)抗體、ALV J亞群(ALV-J)抗體ELISA檢測試劑盒，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司(貨號分別為99-09257、99-09268、99-09254)；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰酶消化液(0.25%)、青鏈霉素溶液(100×)，購自GIBCO公司；兩性霉素B，購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。DF-1細胞由山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院禽病研究室贈送。

1.3 樣品的采集及處理

1.3.1 胎糞樣品采集與處理

輕輕擠壓1日齡雛雞腹部，用采樣棉簽在肛門處沾取糞便置于裝有0.5 mL稀釋液的離心管中，將棉簽頭折斷放于管中，標記，用振蕩器進行10 s短暫振蕩，液氮凍存。每只母雞的雛雞采集完胎糞后，更換手套或洗手消毒。檢測前，取出凍存管，靜置3 min后，取上清直接用于p27抗原檢測。

1.3.2 蛋清樣品采集與處理

每枚雞蛋吸取1 mL左右蛋清置于1.5 mL離心管中，反復凍融3次。凍存時可使用液氮罐進行速凍，也可用-80 ℃冰箱進行凍存，蛋清樣品直接檢測p27抗原。

1.3.3 血漿樣品采集與處理

母雞全血按照蛋號進行全血采集，公雞全血與精液對應采集。用肝素鈉抗凝管靜脈采集1 mL血液，顛倒混勻3次，2 000 r/min離心2 min，吸取血漿備用。

1.3.4 精液樣品采集與處理

無菌采集公雞精液50 μL以上，取40 μL加入到160 μL的精液稀釋液(PBS中加入1%雙抗、0.4%兩性霉素B)中，振蕩混勻，3 000 r/min離心2 min備用。

1.3.5 ALV分離培養(yǎng)

吸取100 μL處理好的血漿或精液樣品接種到24孔細胞板DF-1細胞中，37 ℃作用2 h。吸附完成后傾去上清，在每個孔中加入0.5 mL PBS，將細胞清洗1遍，棄去洗液加入0.5 mL維持液(DMEM培養(yǎng)液中加入1% PBS、1%雙抗、0.4%兩性霉素B)。將24孔板維持生長9 d，收集細胞上清進行p27抗原檢測。

1.3.6 檢測方法

將處理好的血清按照IDEXX公司ALV-A/B、ALV-J 抗體檢測試劑盒說明書進行。對處理好的胎糞、蛋清及血漿、精液的病毒分離細胞上清，按照IDEXX公司ALV- p27抗原檢測試劑盒說明書，進行p27抗原檢測。

1.4 原種雞場摸底調(diào)查

隨機采集雞場種母雞抗凝血200份，公雞抗凝血、公雞精液各50份，種蛋250份，進行 ALV- p27抗原檢測；公雞、母雞全血各50份，進行ALV- A/B抗體、ALV-J抗體檢測。

1.5 生物安全防控

對保種場的基礎設施設備及生物安全、生產(chǎn)管理等進行評估和完善[2]。配合出雛期紙袋孵化、育雛期隔板阻擋等創(chuàng)新措施降低水平傳播。在消毒管理、無害化處理、衛(wèi)生環(huán)保等關鍵風險點進行完善，降低病毒內(nèi)外部傳播的風險。在生產(chǎn)防疫管理、種源管理、凈化團隊建設等生產(chǎn)管理要求進一步規(guī)范，提升人員防疫意識。

1.6 凈化方案

參照文獻[3]，在1日齡、育雛后期(12周齡)、初產(chǎn)期(26周齡)、留種前(35周齡)4個時間點開展監(jiān)測。在1日齡進行胎糞p27檢測，發(fā)現(xiàn)陽性個體采取同母淘汰；育雛后期采集血漿進行病毒分離，發(fā)現(xiàn)陽性個體進行同群淘汰；初產(chǎn)期分別采集血漿、公雞精液進行病毒分離，采集初產(chǎn)蛋3枚普檢，淘汰陽性個體；留種前，采集血漿和精液病毒分離后普檢，淘汰陽性個體。其中該場在0世代全群監(jiān)測，第1世代開始追蹤檢測，并根據(jù)檢測結果，隨時調(diào)整檢測頻率和采樣數(shù)量。

1.7 生產(chǎn)性能評估

建立相應的基準線，采用同樣的采樣日齡、樣品類型和檢測方法，對保種群各世代18周齡體重進行測定，56周齡總產(chǎn)蛋數(shù)、繁殖性能(種蛋受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率)、成活率(育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率)進行統(tǒng)計。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel、SPSS Statistics 26.0軟件對A保種群各生產(chǎn)性能指標進行整理與分析，最小顯著差數(shù)法(LSD)對凈化種雞18周齡體重多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 ALV流行性調(diào)查

ALV流行性調(diào)查結果顯示(表1)，該種雞場母雞血漿p27陽性率為5.0%，公雞血漿p27抗原陽性率為4.0%，公雞精液p27抗原陽性率為2.0%，蛋清p27抗原陽性率為6.0%。ALV-A/B抗體陽性率母雞為36.0%，公雞為4.0%。ALV-J抗體陽性率母雞為8.0%，公雞為6.0%，母雞ALV-A/B、ALV-J抗體陽性率均高于公雞。

表1 ALV流行性調(diào)查結果 %

2.2 禽白血病凈化情況

保種群禽白血病凈化檢測結果顯示(表2)，經(jīng)過連續(xù)4個世代的凈化，核心保種群初產(chǎn)期血漿病毒分離率從第0世代的9.10%降至第3世代的0.50%，公雞精液病毒分離率從第0世代的3.26%降至第3世代的0，初產(chǎn)蛋p27抗原陽性率從第0世代的2.04%降至第2世代的0.60%。

表2 凈化監(jiān)測數(shù)據(jù)匯總

2.3 禽白血病對雞生產(chǎn)性能影響

隨著凈化的實施，保種群產(chǎn)蛋性能明顯提高，與凈化起始階段原雞群(0世代)對比，3世代種雞群56周齡產(chǎn)蛋數(shù)明顯增加，平均凈增8.95個(見圖1)。

圖1 禽白血病凈化對雞保種群56周齡產(chǎn)蛋數(shù)的影響

成活率測定對比中，經(jīng)過逐代凈化，育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率均有不同程度的增加，第3世代較第0世代分別增長3.01%、2.17%和1.48%(見圖2)。

圖2 禽白血病凈化對雞保種群成活率的影響

繁殖性能方面對比，種蛋受精率、受精蛋孵化率與0世代基本持平，入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%(見圖3)。

各世代種雞18周齡平均體重無顯著差異(P>0.05)，但整體呈逐代增加趨勢。第3世代相對第0世代，公雞平均體重增長35 g，母雞增長19 g(見表3)。

圖3 禽白血病凈化對雞保種群繁殖性能的影響

表3 18周齡體重測定比較 g

3 討論

從流行病學調(diào)查來看，該原種雞場禽白血病存在低水平感染，這既是疫病暴發(fā)的隱患也是凈化實施的良好時機。楊榮坤等[4]在地方雞江漢雞進行凈化研究中，結合企業(yè)育種實際選擇了開產(chǎn)初期 22 周齡和留種前35周齡2個時間點來檢測，經(jīng)過2個世代的凈化，p27抗原陽性率顯著降低。俞燕等[5]對4個地方雞種凈化過程中，確定了1日齡、育雛轉(zhuǎn)育成6周齡、開產(chǎn)初期(25～27周齡)、留種前2周(36～40周齡)等4個凈化關鍵時間點。本研究，參照崔治中[3]推薦的技術方案，結合該雞種生長特性及雞場實際育種情況，選擇種雞生長階段的1日齡、育雛后期(12周齡)、初產(chǎn)期(26周齡)、留種前(35周齡)4個時間點，通過多種檢測方法聯(lián)合應用的方式，增加了陽性雞的檢出率。

本研究中，核心保種群初產(chǎn)期血漿病毒分離率從第0世代的9.1%降至第3世代的0.50%，公雞精液病毒分離率從第0世代的3.26%降至第3世代的0。在生產(chǎn)性能方面，經(jīng)過4個世代的凈化，種母雞56周齡產(chǎn)蛋數(shù)平均凈增8.95個。第3世代育雛期成活率、育成期成活率、產(chǎn)蛋期成活率較第0世代分別增長3.01%、2.17%和1.48%。繁殖性能方面，第3世代入孵蛋孵化率相比第0世代提升2.72%。俞燕等[5]對某地方雞種進行3個世代的凈化，25～27周齡蛋清p27抗原陽性率由26.4%降至0.3%，36～40周齡血漿病毒分離陽性率由36.4%降至0.4%，育雛期、育成期和產(chǎn)蛋期死亡率均逐級下降；產(chǎn)蛋性能方面66周齡總產(chǎn)蛋數(shù)平均增加了23個/只。關于禽白血病低水平感染的凈化報道較少，本研究中部分生產(chǎn)指標雖有所增加，但增長趨勢不顯著，可能與雞群本身處于低水平感染相關。通過禽白血病的凈化，切實提升了該種雞群的生產(chǎn)性能及繁殖性能，但其凈化效果在商品代的表現(xiàn)，仍需要進一步追蹤。對于不同的原種雞場來說，沒有一個完全相同的凈化標準。凈化方案的制定需要根據(jù)各場的基礎設施建設及基本流調(diào)情況等實際情況進行制定。

禽白血病凈化是一個綜合性的工程，徹底完成凈化除了需要科學有效的方案外，還需要持之以恒的檢測以及嚴格的生物安全措施[6]。目前國內(nèi)外檢測和鑒別診斷ALV 的方法，主要包括病毒的分離與鑒定、病理學檢測、血清學檢測和分子生物學檢測等[7]。病毒的分離與鑒定一直被認為是診斷ALV的金標準,該方法特異性高，但耗費時間較長，對操作人員的技術要求和檢測中的儀器要求較高。國內(nèi)大多數(shù)種雞場不具備批量的病毒分離檢測條件，需委托具有相應資質(zhì)和條件的實驗室承擔。目前，適用于大規(guī)模流行病學調(diào)查和凈化的檢測方法主要還是針對ALV群特異性抗原p27的ELISA方法[8]。在市場需求和國家政策引導下，禽白血病凈化將在全國得到更大范圍的推廣，臨床上仍需要操作簡單、靈敏度高、技術成熟的快速檢測方法。同時，完善的生物安全體系建設和配套硬件設施是阻斷橫向傳播或其他傳播途徑的有利保障。即使已經(jīng)完成凈化的種禽場仍舊面臨多重感染途徑的再感染風險，必須依靠完善的生物安全體系建設將疫病擋在門外[9]?？茖W的監(jiān)測淘汰方法、規(guī)范的飼養(yǎng)管理制度、嚴謹?shù)纳锇踩胧┰谝卟艋^程中缺一不可。

綜上所述，研究選擇多個凈化關鍵檢測節(jié)點，采用血漿和精液病毒分離、胎糞和蛋清禽白血病抗原檢測等技術組合的方法檢出并淘汰感染雞，配合出雛期紙袋孵化、育雛期隔板阻擋等創(chuàng)新措施降低水平傳播，制定符合上海市原種雞場實際、具有可操作性的禽白血病凈化技術方案，可為其他種雞場凈化工作提供參考。