高雅，李曉晗，孫睿聰，婁錦秀，陳茜，周斌

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

姜黃素(curcumin)是姜科植物姜黃等根莖提取而來的橙黃色脂溶性酚類色素，性狀一般為粉末，分子式為C21H20O6，相對分子質(zhì)量368.39，主鏈由芳香族基團(tuán)及不飽和脂族構(gòu)成，有光熱敏性[1]。因其具有天然生物活性，包括抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗菌抗病毒等[2-3]，近年來備受矚目。姜黃素還可提高動物免疫力，促進(jìn)動物生長，提高動物制品質(zhì)量，也有研究其在動物飼料添加劑等方面的應(yīng)用[4]。

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和死亡率，豬瘟的暴發(fā)對養(yǎng)豬業(yè)打擊巨大，豬瘟的典型臨床特征是高熱、出血以及白細(xì)胞減少，還可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)[5]。豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬。截至目前，姜黃素抑制黃病毒科諸多病毒已見相關(guān)報道，如日本乙型腦炎病毒[6]、登革熱病毒[7]等。CSFV是囊膜病毒，其復(fù)制周期包括吸附、膜融合、內(nèi)化、病毒蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因組復(fù)制、病毒粒子的裝配和釋放等過程，以上過程缺一不可。姜黃素可作用于多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]，會減少病毒產(chǎn)物和感染性病毒粒子的釋放，可能對CSFV病毒復(fù)制周期的多個過程均發(fā)揮抑制作用。本研究擬證明姜黃素及其衍生物對豬瘟病毒具有抑制作用，進(jìn)一步探究姜黃素抑制豬瘟病毒的具體作用路徑。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞

豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)、CSFV(石門株；序列號：AF092448)由本實驗室保存。

1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑(DMEM、胎牛血清、青鏈霉素)，購于Gibco ; 姜黃素(HY-N0005)、去甲氧基姜黃素(HY-N0006)、雙去甲氧基姜黃素 (HY-N0007)，購于MCE ；RIPA-PMSF，購于Solarbio；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker，購于Bio-Rad；鼠源抗β-actin單抗、羊抗鼠、羊抗兔IgG HRP，購于Santa Cruz；TRIzol試劑，購于TaKaRa；5×All-In-One RT Master Mix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)(Cat. No. G492)，購于Abm；Cell Counting Kit-8(CCK-8，K1018)，購于APExBIO；兔抗CSFV-Npro抗體，為本實驗室保存；兔抗熱休克蛋白70(HSP70)抗體，購于Abcam；兔抗RhoA(ras homolog family member A)，購于Cell Signaling Technology；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購于上海天能科技有限公司；AR級純度化學(xué)試劑，購于南京壽德試驗器材有限公司。

1.3 姜黃素工作濃度配制

姜黃素溶于DMSO,配制濃度為10 mg/mL儲存液，存放于-80 ℃。試驗組姜黃素濃度設(shè)置為2.5、5、10、15 μmol/L，對照組添加0.1% DMSO。

1.4 細(xì)胞處理

在24或6孔板中培養(yǎng)PK15細(xì)胞，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至85%時，用無血清DMEM洗滌細(xì)胞，接種CSFV石門株(MOI=0.5，MOI為感染復(fù)數(shù))，37 ℃培養(yǎng)1 h后，洗滌，根據(jù)試驗?zāi)康姆謩e加入含姜黃素(10 μmol/L)、去甲氧基姜黃素(10 μmol/L)、雙去甲氧基姜黃素(10 μmol/L)的2% DMEM(含血清)維持，設(shè)空白對照(MOCK)。

1.5 Western blot檢測

棄去細(xì)胞上清，然后用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌3遍。使用組織裂解液(RIPA)于冰上裂解細(xì)胞獲得蛋白，加入5×SDS Loading buffer，經(jīng)煮沸變性處理后存于-80 ℃。制12.5% SDS-PAGE凝膠，于凝膠上電泳分離樣品中蛋白，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4 ℃過夜孵育，PBST洗凈，二抗室溫孵育45～60 min，PBST洗凈后，經(jīng)ECL發(fā)光，由成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.6 激光共聚焦試驗

PK-15細(xì)胞在培養(yǎng)皿上生長至80%匯合度時，用含10 μmol/L姜黃素的2% DMEM孵育細(xì)胞4 h，以CSFV感染1 h(MOI=10)，更換2% DMEM維持液，分別于30、60和90 min收獲細(xì)胞。將收獲的單層細(xì)胞用含4%多聚甲醛的PBS室溫固定15 min，并用0.1% TritonX-100室溫透膜處理，然后與按說明書稀釋后的FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽共同孵育。通過軟件(Nikon A1；Nikon，Japan)拍攝照片。

1.7 核酸提取和實時熒光定量(RT-qPCR)

按試驗所需的時間點收取全細(xì)胞樣本，使用TRIzol法抽提總RNA，使用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。采用實時熒光定量方法采集信號分析細(xì)胞CSFV、環(huán)氧化酶2(COX-2)和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)mRNA水平。引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成(表1)。

表1 熒光定量PCR引物

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用GraphPad Prism 5進(jìn)行t檢驗比較組間數(shù)據(jù)，各試驗均獨立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素及其衍生物對CSFV增殖的抑制作用

在前期細(xì)胞活性試驗中，與空白對照組相比，姜黃素的濃度低于15 μmol/L時對細(xì)胞活性影響差異不顯著(P>0.05)(結(jié)果未顯示)，因此后續(xù)選取以5、10、15 μmol/L為主要試驗濃度。經(jīng)Western blot證明，細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白Npro減少，見圖1?；叶戎捣治隹芍?，與DMSO組相比，在感染后24和48 h雙去甲氧基姜黃素可將Npro的總量降至62%和84%；姜黃素可將Npro的總量降至71%和70%；去甲氧基姜黃素可將Npro的總量降至73%和69%。

圖1 雙去甲氧基姜黃素(A)、姜黃素(B)和去甲氧基姜黃素(C)抑制CSFV病毒蛋白的Western blot比較

按照上述處理細(xì)胞方式提取獲得細(xì)胞全基因組后，使用RT-qPCR檢測細(xì)胞中CSFV的含量，如圖2所示，結(jié)果也同樣證明姜黃素及其衍生物均具有抑制CSFV的作用，且差異顯著(P<0.05)。

與DMSO組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 姜黃素影響病毒感染后纖維狀肌動蛋白(F-actin)形成與重排

姜黃素預(yù)處理細(xì)胞4 h后，用CSFV感染細(xì)胞，更換2% DMEM培養(yǎng)24 h，不能顯著抑制病毒增殖。延長藥物預(yù)處理時間至16 h，姜黃素對病毒的復(fù)制產(chǎn)生明顯了影響，且呈劑量依賴關(guān)系(圖3)。5 μmol/L藥物處理后顯著降低CSFV水平(P<0.05)，10和15 μmol/L藥物處理后產(chǎn)生極顯著抑制作用(P<0.01)。

共聚焦試驗結(jié)果如圖4所示，姜黃素干擾病毒進(jìn)入時對F-actin的解聚作用，降低病毒感染性，并且在60 min時影響最為明顯。姜黃素預(yù)處理會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)效力，阻止病毒進(jìn)入時對細(xì)胞骨架的重排作用。

圖3 不同濃度姜黃素預(yù)處理不同時間對CSFV水平的影響

圖4 PK-15細(xì)胞感染CSFV后不同時間姜黃素(10 μmol/L)抑制CSFV介導(dǎo)的F-actin重排的激光共聚焦比較(標(biāo)尺=50 μm)

如圖5所示，不同濃度姜黃素作用24 h后，隨姜黃素濃度升高，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)被破壞，同時F-actin蛋白表達(dá)減少。

A. DMSO;B. 5 μmol/L；C. 10 μmol/L；D. 15 μmol/L

對調(diào)節(jié)F-actin的上游分子RhoA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同濃度的姜黃素對細(xì)胞中RhoA的蛋白水平并未產(chǎn)生明顯影響(圖6)。

圖6 Western blot檢測不同濃度姜黃素對RhoA蛋白水平的影響

2.3 姜黃素通過抑制細(xì)胞應(yīng)激抑制CSFV復(fù)制

通過對藥物處理后細(xì)胞蛋白樣本的提取，經(jīng)Western blot分析可知，不同濃度作用下的姜黃素可減少細(xì)胞中與CSFV復(fù)制相關(guān)的HSP70表達(dá)，使用Image J分析灰度值可知，不同濃度藥物處理后，能分別降低病毒感染細(xì)胞中HSP70的含量達(dá)10%、24%、31%(圖7)。

圖7 不同濃度姜黃素影響HSP70蛋白水平的Western blot比較

對感染后24和48 h收獲的細(xì)胞樣本進(jìn)行RT-qPCR檢測，通過與DMSO對照組相比，姜黃素均顯著下調(diào)病毒氧化應(yīng)激相關(guān)因子COX-2(P<0.01或P<0.05，圖8A)和上調(diào)PPAR-γ(P<0.01或P<0.05，圖8B)。根據(jù)以上結(jié)果推測，姜黃素還可減輕CSFV引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而減少CSFV的復(fù)制。

圖8 RT-qPCR檢測COX-2(A)和PPAR-γ(B)的mRNA水平

3 討論

姜黃素具備天然產(chǎn)物所特有的生物活性，藥理作用廣泛、毒性較低，受到研究者的廣泛關(guān)注。近年來關(guān)于姜黃素抗病毒作用和機理已有許多研究。馮春等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制馬立克病病毒復(fù)制；Du等[9]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制病毒內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，阻礙病毒脫衣殼，減輕病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合現(xiàn)象，來抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒，保護(hù)細(xì)胞；朱光等[10]還發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶抑制該病毒復(fù)制；Ali等[11]證明姜黃素促進(jìn)Tat蛋白降解從而抗人類免疫缺陷病毒；Narayanan等[12]研究得出姜黃素抑制 NF-κB通路來抑制裂谷熱病毒的復(fù)制；Leonardo等[7]研究表明姜黃素干擾登革熱病毒Ⅱ型感染宿主的過程來抵御病毒感染宿主；Kim等[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制Akt-SREBP-1途徑，減少丙型肝炎病毒復(fù)制；Dutta等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的異常表達(dá)，減少子代病毒粒子來抑制日本乙型腦炎病毒。

本研究證實了姜黃素及其衍生物均具有抗CSFV的作用。藥物預(yù)處理時間增長后，會產(chǎn)生抑制病毒入胞的影響，但無論預(yù)處理4或16 h，這種抑制均與CSFV入胞相關(guān)蛋白Rab5、Rab7、發(fā)動蛋白、網(wǎng)格蛋白[14]無關(guān)(結(jié)果未顯示)。病毒進(jìn)入細(xì)胞過程依靠細(xì)胞骨架的重塑，F(xiàn)-actin是病毒內(nèi)吞囊泡形成的關(guān)鍵[15]。病毒介導(dǎo)的F-actin的重排和降解是加速病毒感染進(jìn)程的關(guān)鍵，研究已發(fā)現(xiàn)姜黃素對F-actin具有調(diào)節(jié)作用[16]。因此，為了解姜黃素預(yù)處理對細(xì)胞產(chǎn)生何種影響，選取了已被證明在病毒早期復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用的F-actin。共聚焦試驗結(jié)果顯示，在病毒入侵細(xì)胞階段，會阻止病毒引起的F-actin解聚，保留微絲結(jié)構(gòu)，從而阻止病毒進(jìn)入，但作用時間過長，又會影響細(xì)胞自身正常形態(tài)，使細(xì)胞受損，這也解釋了姜黃素作用時間過長，濃度過高，會對細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響，以上結(jié)果提示姜黃素可能對F-actin存在不同的調(diào)節(jié)方式，安全劑量下的姜黃素長時間預(yù)處理細(xì)胞可通過抑制病毒對F-actin的重排作用來抑制病毒進(jìn)入，進(jìn)而減少病毒的侵襲，但姜黃素對F-actin上游調(diào)節(jié)因子RhoA并無明顯影響[16]。因此，姜黃素對F-actin的作用機制有待進(jìn)一步研究。

CSFV利用宿主細(xì)胞器合成自身相關(guān)的病毒組分[17]，推測姜黃素可作用于病毒復(fù)制的多種過程和多條途徑發(fā)揮抗病毒作用。通過后續(xù)試驗可知，除了病毒早期復(fù)制階段，姜黃素還可影響病毒復(fù)制后期。豬瘟可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，而姜黃素是常見的抗氧化應(yīng)激藥物[5]。HSP70是熱激蛋白伴侶分子，已被證實通過與CSFV NS5A蛋白互作幫助CSFV的復(fù)制[18]，本試驗中證明姜黃素可抑制病毒感染后HSP70的表達(dá)。此外，NS5A對CSFV的復(fù)制發(fā)揮重要作用，其能引起細(xì)胞炎性反應(yīng)[18]。COX-2和PPAR-γ是重要的促炎性介質(zhì)[19]。豬瘟感染后，細(xì)胞內(nèi)抗炎因子PPAR-γ水平會明顯下降，而COX-2會顯著升高，二者呈現(xiàn)動態(tài)平衡[20]。為了探究姜黃素處理后對細(xì)胞的保護(hù)作用，分別選取不同的時間點對細(xì)胞中這兩種重要介質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制COX-2并且升高PPAR-γ的水平，說明姜黃素可減輕CSFV感染后引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞。一系列結(jié)果表明姜黃素可通過多途徑抑制CSFV，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。