蘇靖茵，燕詩(shī)雨，張萌，粟碩

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫研究所，江蘇 南京 210095)

蓋塔病毒(Getah virus, GETV)是典型的蟲媒病毒，最早于1955年從馬來(lái)西亞的白雪庫(kù)蚊中分離并命名，隨后陸續(xù)又從豬群、馬群中分離出該病毒。近年來(lái)，世界各國(guó)出現(xiàn)母豬感染零星病例，而在2017年中國(guó)湖南豬場(chǎng)出現(xiàn)母豬和仔豬蓋塔病疫情[1]。臨床上，GETV對(duì)豬和馬的侵害性較大，他們的癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、浮腫等[2]。GETV在國(guó)內(nèi)外均有流行，且我國(guó)陸續(xù)報(bào)道除馬、豬以外的多種動(dòng)物(牛和狐貍等)感染病例[3]。

GETV是單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬的成員。GETV全基因組長(zhǎng)11～12 kb，包含2個(gè)開放閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。GETV的5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白分別是C、E3、E2、6K和E1。在甲病毒中，Cap蛋白是一種多功能蛋白，包含N端RNA結(jié)合域和C端結(jié)構(gòu)域[4]。Cap蛋白能與病毒基因組特性結(jié)合，這會(huì)影響病毒核衣殼形成和RNA合成[5]。此外，Cap蛋白不僅能促進(jìn)核衣殼組裝過(guò)程中Cap蛋白二聚作用，還能促進(jìn)在出芽過(guò)程中與糖蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相互作用[6]。E2是糖蛋白，分子量約為50 kDa；pE2是E2的前體，能裂解成E2和E3[5]。在甲病毒粒子感染過(guò)程中，E2作為介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要蛋白。

GETV的Cap蛋白與E2蛋白可能在病毒感染和病毒復(fù)制中起重要重要作用。但現(xiàn)今對(duì)于GETV的病毒蛋白與及致病機(jī)制等研究仍較少[7]，而GETV的抗體能促進(jìn)其相關(guān)研究。因此，本文通過(guò)了原核表達(dá)Cap和E2蛋白并制備了GETV的多抗，以用于GETV的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero、BHK細(xì)胞和pET-32a(+)載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。DH5α與BL21(DE3)感受態(tài)均購(gòu)自康為公司。GETV由本實(shí)驗(yàn)室分離純化后保存。6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker均購(gòu)自賽默飛公司；高保真DNA聚合酶、同源重組連接試劑盒，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色液均購(gòu)自諾唯贊公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗鼠的抗體均購(gòu)自KPL公司；His兔源抗體購(gòu)自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

以GenBank中登錄的GETV毒株NC_006558.1為參考毒株，設(shè)計(jì)E2基因糖蛋白區(qū)域和Cap基因編碼區(qū)特異性引物。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 GETV-Cap基因和GETV-E2基因擴(kuò)增引物

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增

Vero細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，接種GETV，細(xì)胞出現(xiàn)病變后，加入TRIzol裂解細(xì)胞。按照TRIzol試劑說(shuō)明書，提取細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的RNA。使用RT-PCR方法擴(kuò)增Cap基因及E2基因，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃，4 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，回收目的片段。

針對(duì)水產(chǎn)品運(yùn)輸環(huán)節(jié)監(jiān)管，2017年，佛山市建立鮮活水產(chǎn)品跨區(qū)域產(chǎn)銷對(duì)接監(jiān)管協(xié)作機(jī)制，與長(zhǎng)沙市食安辦、食藥監(jiān)、農(nóng)業(yè)等部門聯(lián)合簽署《加強(qiáng)區(qū)域間鮮活水產(chǎn)品產(chǎn)銷對(duì)接監(jiān)管合作框架協(xié)議》。建立水產(chǎn)品質(zhì)量安全聯(lián)盟，以何氏水產(chǎn)為代表的10多家大型水產(chǎn)品經(jīng)營(yíng)企業(yè)共同建立了統(tǒng)一的“收販運(yùn)”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，有效解決水產(chǎn)品運(yùn)輸環(huán)節(jié)非法添加問(wèn)題。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

空載體pET-32a(+)經(jīng)EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切后回收載體。使用同源重組酶將回收目的片段與回收后的載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)DH5α，并涂布于含氨芐抗性的平板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落，37 ℃擴(kuò)培后，提質(zhì)粒雙酶切(EcoRⅠ與HindⅢ)鑒定。根據(jù)酶切鑒定的結(jié)果，將陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，鑒定正確后獲得質(zhì)粒pET-Cap和pET-E2。

1.2.4 Cap與E2原核表達(dá)

將空載體pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中，挑取單菌落獲得pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2表達(dá)菌種。將pET-Cap 和pET-E2 菌種接種至含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～0.8。摸索誘導(dǎo)條件分別為：誘導(dǎo)溫度為37、25 和16 ℃；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)濃度為0.5、1.0 和1.5 mmol/L；誘導(dǎo)時(shí)間為3、5和7 h。選取較優(yōu)誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)后取菌體超聲約30 min至菌體清亮。12 000 r/min離心，分離上清與沉淀。將沉淀溶于包涵體溶解液中，4 ℃過(guò)夜，具體操作參考文獻(xiàn)[8]。SDS-PAGE分析pET-Cap和pET-E2原核表達(dá)蛋白主要分布于包涵體中。把原核表達(dá)蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化，通過(guò)SDS-PAGE分析純化效果。純化后的蛋白使用脲素梯度稀釋法進(jìn)行透析復(fù)性，4 ℃，12 h/次，前后經(jīng)過(guò)復(fù)性液1～4，具體操作參考文獻(xiàn)[9-10]。將復(fù)性蛋白和誘導(dǎo)空載體分別制備成蛋白樣品，SDS-PAGE分析后，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)；5% 脫脂奶封閉后，孵育His抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，ECL發(fā)光顯色。

1.2.5 小鼠多抗血清制備

復(fù)性的Cap和E2蛋白分別作為免疫原，經(jīng)皮下背部多點(diǎn)方式，100 μg/只，免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠。首免免疫原和等體積完全弗氏佐劑乳化，而二免和三免用不完全弗氏佐劑替代完全弗氏佐劑。每次免疫間隔為2周，三免后1周采血，分離免疫小鼠血清作為陽(yáng)性血清，不免疫小鼠血清作為陰性血清。ELISA測(cè)定血清效價(jià)，分別測(cè)定梯度稀釋后的陽(yáng)性血清效價(jià)，操作參照文獻(xiàn)[11]，酶標(biāo)儀讀取各孔的OD值。

1.2.6 Westeron blot鑒定

BHK細(xì)胞以感染復(fù)數(shù)(MOI) 0.01接種GETV，細(xì)胞病變后48 h，制備接種與不接種GETV的蛋白樣品，細(xì)胞裂解后收集樣品，加入4×上樣緩沖液后煮樣。經(jīng)SDS-PAGE分析后轉(zhuǎn)至NC膜；封閉NC膜后，孵育Cap和E2 陽(yáng)性血清一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗；洗膜后，ECL發(fā)光顯色。

1.2.7 免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定

BHK細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上時(shí)，以MOI為0.01接種GETV，48 h后使用冰甲醇固定細(xì)胞。封閉后，分別與 E2、Cap血清和PBS(對(duì)照組)作用；接著以FITC標(biāo)記的山羊抗鼠的抗體為二抗孵育，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，最后倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR目的條帶擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建

以GETV的cDNA為模板，通過(guò)Cap特異性引物，RT-PCR方法擴(kuò)增出約800 bp的片段(圖1A)，與GETV的Cap基因理論值(804 bp)相符；通過(guò)E2特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出約1 200 bp的片段(圖1B)，與GETV的E2基因理論值(1 209 bp)大小一致。

M. DNA Marker DL2000；1. Cap基因；2. E2基因

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

同源重組酶將目的片段與雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)的pET-32a(+)連接，構(gòu)建成重組克隆質(zhì)粒。分別使用Cap和E2的特異性引物，以Cap陽(yáng)性質(zhì)粒和E2陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增出804 bp與1 209 bp的單一條帶。質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果顯示，空載體酶切后可見(jiàn)大小為5 900 bp條帶；Cap陽(yáng)性質(zhì)粒有5 900和804 bp 2條帶；E2陽(yáng)性質(zhì)粒有2條分別在5 900和1 209 bp附近的條帶，均符合預(yù)期(圖2)。將陽(yáng)性質(zhì)粒送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)一致，分別命名為pET-Cap和pET-E2。

M1. DNA Marker DL2000；M2. DNA Marker DL5000；1.雙酶切pET-Cap質(zhì)粒；2.Cap基因擴(kuò)增；3.雙酶切空載體；4.雙酶切pET-E2質(zhì)粒；5.E2基因擴(kuò)增；6.雙酶切空載體

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

通過(guò)比較不同條件下誘導(dǎo)pET-Cap情況，最終選擇誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為1 mmol/L，37 ℃，誘導(dǎo)3 h。誘導(dǎo)后包涵體中40～55 kDa附近有明顯條帶，而上清僅有少量蛋白，表明Cap蛋白主要在包涵體中大量表達(dá)(圖3A)。包涵體中的蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后獲得重組Cap蛋白(圖3B)。純化復(fù)性后Cap蛋白樣品與His抗體結(jié)合，在40～55 kDa附近有條帶，純化復(fù)性蛋白為重組Cap蛋白(圖3C)。

A.pET-Cap表達(dá)：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1. pET-Cap未誘導(dǎo)；2.pET-Cap誘導(dǎo)；3.pET-Cap超聲后上清；4.pET-Cap超聲后沉淀；B.Cap蛋白純化：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1.純化pET-Cap沉淀；2.復(fù)性Cap蛋白；C.Cap蛋白與His抗體反應(yīng)：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1.復(fù)性Cap蛋白；2.pET-32a(+)誘導(dǎo)

通過(guò)分析比較不同溫度、時(shí)間與不同濃度的IPTG誘導(dǎo)pET-E2的效果，IPTG濃度為1 mmol/L時(shí)，在25 ℃，誘導(dǎo)5 h下E2蛋白大量表達(dá)，55～70 kDa附近有蛋白帶，且蛋白主要存在于包涵體中(圖4A)。經(jīng)鎳柱親和層析純化和復(fù)性透析包涵體中蛋白后，獲得重組E2蛋白(圖4B)。純化復(fù)性后的E2蛋白與His抗體反應(yīng)，在55 kDa處有明顯條帶而空載體沒(méi)有，表明純化復(fù)性的蛋白為重組E2蛋白(圖4C)。

A.pET-E2表達(dá)：1. pET-E2未誘導(dǎo)；2.pET-E2誘導(dǎo)；3.pET-E2超聲后上清；4.pET-E2超聲后沉淀；M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；B. E2蛋白的純化：1. 純化pET-E2沉淀；2.復(fù)性E2蛋白；C. E2蛋白與His抗體反應(yīng)：1.復(fù)性E2蛋白；2.pET-32a(+)誘導(dǎo)

2.4 Cap蛋白與E2蛋白多克隆抗體的制備

Cap與E2原核表達(dá)蛋白分別免疫小鼠制備多克隆抗體，經(jīng)3次免疫后ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果2種抗體效價(jià)均達(dá)到1∶105以上。

2.5 Western blot 驗(yàn)證多抗效果

GETV的Cap蛋白理論大小約為30 kDa，BHK(圖5A)和Vero(圖5C)細(xì)胞接種病毒后不同時(shí)間點(diǎn)的樣品在25～35 kDa附近可見(jiàn)有明顯條帶，而不接種病毒樣品未見(jiàn)條帶，說(shuō)明Cap多抗能與GETV發(fā)生特異性結(jié)合。

GETV的E2蛋白理論大小為46 kDa，其前體pE2為62 kDa。BHK(圖6B)和Vero(圖6C)細(xì)胞接種病毒后不同時(shí)間點(diǎn)的樣品在40～55 kDa與55～70 kDa附近均可見(jiàn)明顯條帶，而不接種病毒樣品未見(jiàn)條帶，說(shuō)明E2多抗與GETV的反應(yīng)性良好。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker；1.BHK細(xì)胞接種GETV；2.BHK細(xì)胞不接種病毒

2.6 IFA驗(yàn)證多抗效果

GETV接種于BHK細(xì)胞，以Cap多抗和E2多抗為一抗進(jìn)行IFA，均可檢測(cè)到綠色熒光，而對(duì)照組沒(méi)有綠色熒光，說(shuō)明Cap多抗和E2多抗能特異性識(shí)別GETV(圖6)。

圖6 Cap和E2多抗與GETV反應(yīng)性的IFA鑒定(標(biāo)尺=500 μm)

3 討論

GETV在我國(guó)廣西、四川、云南、海南、河北、湖南和甘肅等多地均有報(bào)道，表明該病毒在我國(guó)普遍流行[12]。在自然界中，GETV是一種蟲媒病毒，帶毒蚊蟲通過(guò)叮咬豬、馬、鼠等易感動(dòng)物，使病毒在這些動(dòng)物體內(nèi)增殖[13]。Li等[14]對(duì)家畜血清樣本進(jìn)行調(diào)查后，發(fā)現(xiàn)在雞、鴨、奶牛、豬和肉牛中均能檢測(cè)GETV的中和抗體，其中豬和肉?？贵w陽(yáng)性率較高(46%～72%)。2010年在河北省涉縣出現(xiàn)正常人群和發(fā)燒患者感染GETV情況，流行病學(xué)篩查后發(fā)現(xiàn)正常人群的總感染率高達(dá)16.67%，遠(yuǎn)高于海南瓊中地區(qū)的陽(yáng)性率(約2.0%)[15]。這說(shuō)明GETV可能具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

近年來(lái)對(duì)甲病毒的功能報(bào)道較多，而GETV的報(bào)道相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)甲病毒囊膜蛋白E2存在糖基化位點(diǎn)、宿主細(xì)胞受體識(shí)別位點(diǎn)和中和抗體的識(shí)別位點(diǎn)[5]。甲病毒科辛德比斯病毒(Sindbis virus)E2蛋白單抗能夠影響病毒在體內(nèi)和體外的復(fù)制[16]。E2單抗處理后感染病毒，盡管細(xì)胞內(nèi)核衣殼蛋白和囊膜蛋白仍持續(xù)合成，但病毒粒子釋放減少[17]。甲病毒囊膜糖蛋白E2蛋白C端接觸的是由Cap蛋白和基因組RNA組成的病毒核衣殼[6]。一旦核衣殼蛋白從初生的多肽鏈中釋放出來(lái)，N端信號(hào)序列將發(fā)揮作用，導(dǎo)致糖蛋白pE2插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[5]。甲病毒的Cap蛋白N端結(jié)構(gòu)域雖保守性較低，富含正電荷。Cap蛋白存在核定位信號(hào)和核出口信號(hào)位點(diǎn)，在核胞質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮作用[18]。而Cap蛋白的C端蛋白酶結(jié)構(gòu)域高度保守，Cap蛋白的114～264殘基表面存在疏水區(qū)域，并被譽(yù)為疏水口袋。該口袋能與E2蛋白C端的16個(gè)殘基相互作用[19]，該結(jié)合在甲病毒組裝中發(fā)揮積極作用。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于GETV的E2蛋白研究主要是基于原核表達(dá)E2蛋白并建立ELISA方法[20- 21]，而對(duì)于其抗體制備報(bào)道較少。E2與Cap蛋白抗體對(duì)研究GETV蛋白的功能起著重要的作用。姜焱等[22]成功制備了GETV的Cap蛋白多抗，但沒(méi)有進(jìn)一步驗(yàn)證Cap多抗與GETV的反應(yīng)性。GETV的Cap蛋白與E2蛋白多抗不僅能應(yīng)用于分離鑒定GETV，還能應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。為深入了解GETV，本文制備了其鼠源Cap多抗與E2多抗，Western blot和IFA均證實(shí)此2種多抗均能特異性識(shí)別GETV，為進(jìn)一步探究GETV致病機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。