黃建飛，申翰欽，張鈺坤，巫秀紅，黃松健，嚴專強，周慶豐*

(1. 溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527400；2. 廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點實驗室，廣東 云浮 527400 3. 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；4. 華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642)

雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種免疫抑制性傳染病，發(fā)病率和死亡率高，具有急性、高度的傳染性，3～12周齡的雛雞和青年雞易感，嚴重危害世界家禽業(yè)，對養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。IBDV基因組編碼5種蛋白，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，其中VP2和VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒核衣殼組成的主要成分。VP2蛋白能誘導中和抗體，與病毒毒力和抗原變異相關(guān)，是IBD防控中主要的抗原靶基因[3-5]。

目前市場上IBDV疫苗主要有載體疫苗、中等毒力的弱毒疫苗和滅活疫苗，其中基因工程苗也有相關(guān)報道。基因工程苗因其副作用小、免疫原性高等特點，成為生產(chǎn)應用上常見的禽病疫苗[6]。本研究采用原核表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達IBDV的VP2蛋白。因相關(guān)文獻報道，融合標簽能促進重組蛋白的可溶性表達，本試驗采用組氨酸(His)和麥芽糖(MBP)2種融合標簽與VP2基因進行融合表達和純化，煙草蝕紋病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶切除標簽后形成病毒樣顆粒(VLP)，并通過動物試驗評估VLP的免疫原性和保護效果，為IBDV基因工程疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒

IBDV強毒株W2512G-61，由溫氏食品集團股份有限公司研究院提供。

1.2 載體與菌株

pSYno-1載體購自常州基宇生物科技有限公司；His-TEV蛋白酶由本實驗室制備；BL21(DE3)、TOP10感受態(tài)細胞購于TaKaRa公司。

1.3 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒(RaPure Viral RNA/DNA Kits)，購自美基生物公司；氨芐青霉素、瓊脂糖，購自上海生工生物股份有限公司；Protein Marker,購自Thermo公司；Gold view I型核酸染色劑、DL2000 Marker、DL5000 Marker、一步法轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、PremixExTaqProbe qPCR，均購自TaKaRa公司。

1.4 實驗動物

1日齡SPF雞由大華農(nóng)生物科技有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 VP2基因原核表達載體的構(gòu)建

提取IBDV強毒株dsRNA，-20 ℃保存。根據(jù)參考文獻[7]合成VP2基因的引物。上游引物F:5′-CGAGCTCGATGACAAACCTGCAAGATCAAC-3′(下劃線部分為SacⅠ酶切位點)，下游引物R :5′-CCGCTCGAGCGGCACCGGCACAGCTATCTCCTT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)，預期擴增產(chǎn)物大小為1 356 bp ，引物由廣州生工生物科技有限公司合成。將VP2擴增的目的片段和原核表達載體pSYno-1分別用SacⅠ/XhoⅠ雙酶切，凝膠電泳后，回收各自目的片段，連接后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，重組表達質(zhì)粒命名為pSYno-1-VP2。

1.5.2 重組蛋白的表達與可溶性分析

重組質(zhì)粒pSYno-1-VP2轉(zhuǎn)化表達菌株BL21(DE3)，挑取重組菌單菌落接種于含有Kana(50 μg/mL)的1 000 mL 的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm到0.6，加入IPTG(0.5 mmol/L)，在22 ℃ 160 r/min過夜培養(yǎng)誘導蛋白表達，用緩沖液Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCL，pH=8.0)重懸菌體，超聲波破碎儀進行破碎，破碎后的混合液 4 ℃、12 000 r/min離心30 min收集上清，通過SDS-PAGE分析，測定蛋白可溶性。

1.5.3 蛋白純化

收集上述表達的上清加入含有NI-NTA填料的柱子，選用洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH =8.0)洗去非特異性雜帶，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，400 mmol/L咪唑，pH=8.0)洗脫pSYno-1-VP2重組蛋白。通過TEV蛋白酶酶切純化得到的His-MBP-VP2重組蛋白，4 ℃過夜反應，反應后繼續(xù)用NI-NTA填料柱進行純化，收集VP2蛋白，通過透析去除咪唑，濃縮后用BSA蛋白測定VP2蛋白的濃度。

1.5.4 電鏡觀察

將洗脫后的VP2蛋白用50 mmol/L Tris-HCl與300 mmol/L NaCl作為緩沖液，分析VLP的組裝情況和外觀，是否形成納米顆粒，通過透射電鏡(TEM)檢測收集的蛋白。

1.5.5 VLP免疫原性試驗

將純化后的VP2蛋白與白油佐劑以2∶3體積比混合并乳化，通過頸部皮下免疫接種10只1日齡SPF雞，免疫劑量為20 μg/只，免疫后7 d加強免疫1次，二免后14 d檢測血清抗體并與對照組同時口服攻毒，攻毒劑量為104.0ELD50，攻毒后觀察免疫攻毒組和對照攻毒組的臨床癥狀，并在攻毒后3、5和7 d采集肛拭子和血清，攻毒后4和7 d采集組織樣品進行相應的抗體和排毒檢測。熒光定量PCR反應，引物參考文獻[7]，按TaKaRa PremixExTaqTM(Probe qPCR)試劑盒操作，其中20 μL反應體系包含PremixExTaq10 μL，上下游引物各0.4 μL，探針(Probe)0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，模板2 μL，RNase Free dH2O 6.2 μL。反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共計45個循環(huán)。

1.5.6 統(tǒng)計與分析

用Graphpad prism 5.0 和SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行作圖和統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP2基因的擴增

對分離株IBDV-20152010進行核酸提取，通過特異性引物對目的產(chǎn)物進行PCR擴增，得到目的條帶長度約為1 356 bp，與預期擴增的基因片段大小相符(圖1)。

M. DL2000 Marker；1、2. VP2基因

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pSYno-1-VP2分別用SacⅠ/XhoⅠ進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示2條條帶，其中目的基因片段約為1 300 bp，與預期條帶大小相符(圖2)。

2.3 重組蛋白的表達

將重組質(zhì)粒pSYno-1 -VP2轉(zhuǎn)化表達菌BL21(DE3)中，加入IPTG過夜誘導表達，通過SDS-PAGE分析，IPTG誘導后蛋白明顯表達，分子量為105 ku，同時通過可溶性分析，上清和沉淀中均有表達(圖3)。

M.DL5000 Marker；1. T-VP2雙酶切產(chǎn)物；2. T-VP2質(zhì)粒

M.蛋白Marker；1. Psyno-1-VP2誘導前菌體蛋白；2. Psyno-1-VP2誘導后菌體蛋白；3. Psyno-1-VP2超聲破碎后菌體；4. Psyno-1-VP2破碎后上清液；5. Psyno-1-VP2破碎后沉淀

2.4 重組蛋白TEV酶切

將上清中的蛋白加入含有NI-NTA填料的柱子進行純化，用TEV酶進行酶切，酶切后的產(chǎn)物通過SDS-PAGE鑒定后，再用NI-NTA親和層析純化。結(jié)果顯示，大約90%的VP2重組蛋白通過TEV蛋白酶被切開，得到不含His-MBP標簽的VP2目的蛋白，由于二次純化對目的蛋白損失較大，最終得到的蛋白濃度較低(約0.1 mg/mL)(圖4)。

M.蛋白Marker；1.Psyno-1 -VP2鎳柱純化前菌體總蛋白；2.Psyno-1 -VP2過鎳柱后菌體總蛋白；3.Psyno-1 -VP2過鎳柱后菌體雜蛋白；4.Psyno-1-VP2過鎳柱后目的蛋白；5.TEV酶切后的Psyno-1-VP2蛋白；6.VP2目的蛋白；7.濃縮后的VP2目的蛋白

2.5 電鏡檢測

對目的蛋白VP2進行濃縮，得到更高純度(1.0 mg/mL)的蛋白，通過透射電鏡觀察，鏡檢結(jié)果顯示形成了明顯的病毒樣結(jié)構(gòu)以及納米顆粒狀，且結(jié)構(gòu)、大小和形狀與預期相符(圖5)。

2.6 VLP免疫原性試驗

免疫后21 d，免疫組抗體水平明顯高于非免疫組(圖6A)。攻毒后4 d，非免疫組死亡3只，剖檢觀察到腿部肌肉有出血點、脾臟腫大、胸腺出血、法氏囊出血等癥狀；免疫組無死亡，剖檢觀察腿肌和胸腺無明顯臨床癥狀。攻毒后4 d，非免疫組病理組織學觀察到脾臟淋巴細胞缺失，內(nèi)皮細胞裸露和嚴重壞死，法氏囊囊泡內(nèi)幾乎所有的淋巴細胞均壞死；免疫組病理組織學觀察到脾和法氏囊組織結(jié)構(gòu)接近正常，未見明顯病理變化(圖6B)。從拭子檢測結(jié)果來看，攻毒后3 d，非免疫組陽性率100%(6/6)，免疫組陽性率16.7%(1/6)；攻毒后5 d，非免疫組陽性率16.7%(1/6)，免疫組無排毒(0/6)；攻毒后7 d，非免疫和免疫組均無排毒(0/6)。

圖5 VP2重組蛋白納米顆粒透射型電子顯微圖像

A.免疫后14 d抗體水平；B.攻毒后4 d病理學組織切片檢測(200×)

攻毒后4 d，與免疫組相比，非免疫組脾體比和囊體比均高于免疫組，且差異顯著(P<0.05)(圖7A)。攻毒后7 d，與免疫組相比，非免疫組脾體比高于免疫組，且差異顯著(P<0.05)，囊體比低于免疫組，且差異極顯著(P<0.01)(圖7B)；血清qPCR結(jié)果顯示，攻毒后3 d，與非免疫組相比，免疫組血清病毒載量極顯著降低(P<0.01)(圖7C)；從組織qPCR結(jié)果顯示，攻毒后4 d，與非免疫組相比，免疫組脾臟和法氏囊病毒載量極顯著降低(P<0.01)(圖7D)；攻毒后7 d，與非免疫組相比，免疫組法氏囊病毒載量極顯著降低(P<0.01)(圖7E)。

3 討論

目前預防IBDV的主要措施有免疫載體疫苗、滅活疫苗、弱毒疫苗，但載體疫苗產(chǎn)生抗體較慢，滅活疫苗生產(chǎn)成本高，而弱毒疫苗生物安全風險較大。為了解決這一難題，開發(fā)了VLP疫苗，通過純化后的蛋白自我組裝成病毒樣顆粒，同時具有與真正的病毒粒子相似的空間立體結(jié)構(gòu)，這些VLP既可以誘導B細胞免疫蛋白受體的交聯(lián)，還參與特異效應B細胞的活化和體液免疫，還可通過CD8+T細胞誘導機體的特異性細胞免疫。正是通過這種方式，使機體產(chǎn)生廣泛而強烈的免疫反應，相較于傳統(tǒng)疫苗具有更明顯的優(yōu)勢，VLP已經(jīng)成為一種很有前途的疫苗平臺[8]。

基于VLP的疫苗已廣泛用于疫苗研究，包括乙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒和豬圓環(huán)病毒2型等等，IBDV VLP疫苗也有相關(guān)報道，Rogel等[9]將目的基因插入大腸桿菌表達載體pET-21a中，純化后的蛋白電鏡可觀察到VLP，免疫后能夠產(chǎn)生抗體；Kibenge等[10]通過桿狀病毒表達IBDV目的蛋白，同樣可以自動組裝成VLP。VLP疫苗的生產(chǎn)、純化和儲存對開發(fā)基于VLP的疫苗具有重要意義[11]。本研究旨在評價IBDV VLP疫苗的免疫原性。

目前在蛋白表達系統(tǒng)中，有大腸桿菌、酵母和真核細胞等多種表達系統(tǒng)，其中大腸桿菌表達系統(tǒng)在目前蛋白表達中較為廣泛，因其具有操作簡便、轉(zhuǎn)化利用率高和價格成本低等優(yōu)點[12]。本研究使用pSYno-1載體通過原核表達系統(tǒng)對實驗室分離的強毒株VP2蛋白進行表達，pSYno-1載體含有His和MBP標簽，MBP標簽對于蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達有促進作用[6]，同時在融合標簽與VP2之間設(shè)有TEV蛋白酶切位點，可以特異性除去標簽蛋白。

本研究構(gòu)建了pSYno-1-VP2重組表達載體，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，成功表達了融合蛋白，且可溶性蛋白表達量約為50%，通過TEV蛋白酶切后獲得目的蛋白，分子質(zhì)量約為48 ku，與預期蛋白大小一致。電鏡結(jié)果顯示，蛋白在電子顯微成像中能夠自我組裝成病毒樣顆粒。由于TEV蛋白酶切割后進行二次純化中蛋白損失過大，我們選用TEV蛋白酶切開后的蛋白溶液對SPF雞進行皮下免疫試驗。結(jié)果表明，與非免疫組相比，免疫組在SPF雞皮下接種21 d后產(chǎn)生高水平的抗體，初步證實VP2蛋白VLP疫苗具有很好的免疫原性。攻毒保護試驗結(jié)果顯示，攻毒后4和7 d，非免疫組脾體比大于免疫組，表明非免疫組脾臟組織已經(jīng)發(fā)生腫大；攻毒后4 d，非免疫組囊體比大于免疫組，而攻毒后7 d，非免疫組囊體比小于免疫組，這可能是非免疫組在攻毒后4 d法氏囊受損導致成長停滯不前的原因。與非免疫組相比，免疫組拭子、血清和組織的排毒量顯著低于非免疫組，從而進一步證明VP2蛋白VLP疫苗能有效刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應答，這為研制新型的IBD基因工程疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。