陳夢(mèng)閣，李新，張旭，王曉岑，孫智超，張西臣，宮鵬濤，李建華

(吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

新孢子蟲是近年來發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲，主要是犬新孢子蟲(Neosporacaninum)，其可感染多種動(dòng)物，引起牛、羊等中間宿主的生殖障礙等疾病，以及犬科動(dòng)物等終末宿主的神經(jīng)紊亂，導(dǎo)致幼畜運(yùn)動(dòng)障礙、腦膜炎等疾病。新孢子蟲病呈世界性分布，已有40多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)了新孢子蟲，美國、澳大利亞等國奶牛和肉牛新孢子蟲感染率一般為10%～82%，我國奶牛新孢子蟲感染率平均為20%～25%，據(jù)統(tǒng)計(jì)新孢子蟲病每年給世界經(jīng)濟(jì)造成約5.5億美金的損失，其中養(yǎng)牛業(yè)損失最大[1]。新孢子蟲能夠主動(dòng)侵入包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的多種宿主細(xì)胞，具有激活宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體和相應(yīng)通路的保守成分，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。因此，探究新孢子蟲自身成分對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能，有助于找到防控新孢子蟲病的新靶點(diǎn)。

果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-biphosphatase, FBPase)是糖異生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，在生物的代謝及發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用[2]。在寄生蟲FBPase研究方面，曼氏血吸蟲FBPase參與糖異生，為寄生蟲的生長提供能量[3]。利什曼原蟲FBPase通過參與還原型輔酶Ⅱ合成來保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜免受活性氧的侵害[4]。利什曼原蟲FBPase是蟲體的毒力因子，F(xiàn)BPase缺失使利什曼原蟲致病性降低[5]。華支睪吸蟲FBPase聚集在人類肝星狀細(xì)胞LX-2膜上，并促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖和活化，上調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白等關(guān)鍵纖維化因子，導(dǎo)致肝臟纖維化[6]。同時(shí)，F(xiàn)BPase在多種疾病發(fā)生中起關(guān)鍵作用，如在胰腺癌中，F(xiàn)BPase可以通過阻斷IQ結(jié)構(gòu)域三磷酸鳥苷合酶-激活蛋白1-絲裂原活化蛋白激酶(IQGAP1-MAPK)相互作用，抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)激活[7]。然而，關(guān)于新孢子蟲FBPase蛋白的功能及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究尚未見報(bào)道。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得NcFBPase重組蛋白(rNcFBPase)，對(duì)NcFBPase蛋白進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)研究，發(fā)現(xiàn)rNcFBPase通過激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)細(xì)胞因子的分泌，為后續(xù)研究NcFBPase蛋白的免疫功能及宿主抗新孢子蟲免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物

新孢子蟲速殖子Nc-1株、Vero細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室凍存。6～8周齡野生型C57BL/6雌鼠購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

RPIM-1640培養(yǎng)基與胎牛血清，購自Biological公司；青鏈霉素、20×PBS、氨芐青霉素、IPTG誘導(dǎo)劑、PCR產(chǎn)物回收試劑盒，購自上海生物工程有限公司；巰基乙酸培養(yǎng)基，購自BD Biosciences公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Primer star Mix、T4連接酶、EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶，購自TaKaRa公司；pGEX-4T-1表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)室凍存；大腸桿菌感受態(tài)DH-5α、BL21(DE3)和GST蛋白純化填料，購自全式金公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自天根生物公司；Triton X-114、P38/ERK/AKT抑制劑，購自Sigma公司；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，購自GenScript公司；RIPA細(xì)胞裂解液，購自碧云天公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，購自Thermo公司；P-p38、p38、P-ERK1/2、ERK1/2、P-AKT、AKT和GAPDH抗體，購自Abcam公司；羊抗兔IgG-HRP，購自Proteintech公司；小鼠IL-6、IL-12、TNF-α細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，購自Thermo Scientific公司。

1.3 細(xì)胞及新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)

1.3.1 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)

將凍存的Vero細(xì)胞放入37 ℃水浴鍋中使其解凍，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用含5%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待其長滿后進(jìn)行傳代。

1.3.2 新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)

將新孢子蟲接種于Vero細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有2%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基，待新孢子蟲從細(xì)胞中完全逸出后，吸出1 mL進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其余蟲體用Percoll法純化待用。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMs)的分離及培養(yǎng)

用3 mL巰基乙酸培養(yǎng)基對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，3～4 d后安樂處死小鼠，置于75%酒精中浸泡10 min，隨后在無菌條件下進(jìn)行PMs的分離。用10 mL的注射器將適量1×PBS注入小鼠腹腔內(nèi)隨后吸出放于50 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，用1 mL培養(yǎng)基重懸PMs，計(jì)數(shù)后按照需要鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板，用添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 NcFBPase的克隆、表達(dá)和純化

根據(jù)NcFBPase基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，NcFBPase-F:5′-GGAATTCATGGCGACAAATGCACAGC-3′和NcFBPase-R:5′-CCTCGAGCTACGCGTTGTTAGTACCCA-3′，引物由庫美生物科技有限公司合成。以新孢子蟲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增NcFBPase基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對(duì)所擴(kuò)增的NcFBPase基因進(jìn)行純化。將NcFBPase基因的純化產(chǎn)物和pGEX-4T-1質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶進(jìn)行37 ℃酶切20 min，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后利用T4連接酶于4 ℃過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH-5α中，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h后涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)；挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，對(duì)陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切鑒定并送庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將pGEX-4T-1空載質(zhì)粒及pGEX-4T-1-NcFBPase重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于6 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)；菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于300 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值約為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃ 140 r/min誘導(dǎo)表達(dá)5 h；隨后將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液8 000 r/min離心10 min，1×PBS重懸菌體，超聲破碎，再次離心分離沉淀和上清，同時(shí)收集誘導(dǎo)表達(dá)的空載體、未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，菌液經(jīng)制樣后通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行可溶性分析，隨后用GST蛋白純化填料對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。

1.5 rNcFBPase蛋白內(nèi)毒素的去除及含量檢測(cè)

將終濃度為1%的Triton X-114加入到rNcFBPase蛋白液中，劇烈振蕩，冰上放置10 min，隨后37 ℃水浴鍋中放置10 min；然后將樣品12 000 r/min離心10 min，吸取上層水相。將上述過程重復(fù)3次，收集含有蛋白質(zhì)的上層水相。

按照說明書步驟，使用ToxinSensorTM顯色LAL內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)rNcFBPase蛋白中的內(nèi)毒素含量。蛋白經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，取部分測(cè)蛋白濃度，剩余蛋白保存在-80 ℃的冰箱內(nèi)。

1.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的檢測(cè)

將小鼠PMs以1×104的密度鋪于96孔板中培養(yǎng)6 h，分別用PBS和濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL的rNcFBPase刺激PMs 24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后在450 nm波長處測(cè)定吸光值。

1.7 Western blot檢測(cè)

將小鼠PMs以3×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其貼壁后，用PBS、終濃度為50 μg/mL的GST和rNcFBPase孵育細(xì)胞0.5、1、2、4、6 h。收取全細(xì)胞裂解液，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量；每孔上樣30 μg，SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別4 ℃過夜孵育兔抗P-p38(1∶1 000)、兔抗總p38(1∶1 000)、兔抗P-ERK1/2(1∶1 000)、兔抗總ERK1/2(1∶1 000)、兔抗P-AKT(1∶1 000)、兔抗總AKT(1∶1 000)和兔抗GAPDH(1∶1 000)；TBST洗膜4次，10 min/次；羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，10 min/次；膜通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯色后經(jīng)Western blot檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白檢測(cè)，Image J進(jìn)行灰度分析。

1.8 ELISA檢測(cè)

將小鼠PMs以5×105細(xì)胞/孔的密度鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其貼壁后，用p38抑制劑(SB203580，30 mmol/L)、ERK抑制劑(PD98059，40 mmol/L)、AKT抑制劑(IV，10 mmol/L)或DMSO預(yù)處理PMs 1 h，再用rNcFBPase進(jìn)行孵育細(xì)胞24 h，隨后收集上清并用細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-6、IL-12和TNF-α水平。具體操作參照試劑盒中說明書。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，采用SPSS軟件對(duì)組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NcFBPase基因的擴(kuò)增、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示NcFBPase基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 050 bp，與預(yù)期目的基因片段大小相一致(圖1A)。重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物大小與基因預(yù)期大小相符合(圖1B)。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-NcFBPase重組質(zhì)粒。誘導(dǎo)表達(dá)后，考馬斯亮藍(lán)染色顯示rNcFBPase在上清和沉淀均有表達(dá)(圖1C)，并用GST填料純化rNcFBPase，成功獲得大小為65 ku的rNcFBPase(圖1D)。

2.2 rNcFBPase對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)rNcFBPase對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活力的影響，確定其最適刺激濃度。與空白組相比，rNcFBPase組在低于50 μg/mL的濃度下對(duì)細(xì)胞活力無影響(P>0.05)，而在100和200 μg/mL的濃度下，細(xì)胞活力極顯著降低(P<0.01)。因此，rNcFBPase對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作用的適宜濃度為50 μg/mL(圖2)。

2.3 rNcFBPase激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)

為探討NcFBPase能否激活MAPK信號(hào)通路，采用Western blot檢測(cè)p38和ERK的磷酸化水平，并進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，rNcFBPase刺激PMs引起p38和ERK的磷酸化，p38(2 h)和ERK(4 h)的磷酸化水平達(dá)到峰值，之后隨時(shí)間的延長蛋白磷酸化水平恢復(fù)正常(圖3A、3B、3C)，表明rNcFBPase可以激活小鼠巨噬細(xì)胞MAPK信號(hào)通路。

A.PCR產(chǎn)物電泳圖：M.DNA分子量；1.NcFBPasePCR產(chǎn)物；

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下同

為了進(jìn)一步研究rNcFBPase通過MAPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞因子的影響，采用ELISA檢測(cè)IL-6、IL-12和TNF-α細(xì)胞因子的分泌量。結(jié)果顯示，與空白組及DMSO組相比，rNcFBPase組IL-6、IL-12和TNF-α細(xì)胞因子的分泌量顯著升高。與rNcFBPase組相比，SB203580預(yù)處理組IL-6分泌量降低約1.5倍(P<0.01，圖3D)，IL-12的分泌量降低約2倍(P<0.01，圖3E)，TNF-α 的分泌量降低約1.7倍(P<0.001，圖3F)；PD98059預(yù)處理組IL-6分泌量降低約1.5倍(P<0.05，圖3D)，IL-12的分泌量降低約2.2倍(P<0.001，圖3E)，TNF-α的分泌量降低約1.7倍(P<0.001，圖3F)。阻斷MAPK信號(hào)通路后，rNcFBPase介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，表明rNcFBPase通過MAPK信號(hào)通路調(diào)控宿主細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。

2.4 rNcFBPase激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)

為探討NcFBPase是否激活A(yù)KT信號(hào)通路，采用Western blot檢測(cè)rNcFBPase刺激小鼠PMs不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)AKT蛋白的磷酸化水平。如圖所示，AKT自1 h起磷酸化水平升高，4 h達(dá)到峰值，隨后AKT蛋白磷酸化水平隨時(shí)間增加逐漸降低，表明NcFBPase蛋白可以激活A(yù)KT信號(hào)通路(圖4A、4B)。

為了探討rNcFBPase誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌是否與AKT相關(guān)。ELISA結(jié)果顯示，與rNcFBPase組相比，IV預(yù)處理組IL-6分泌量降低約1.8倍(P<0.01，圖4C)，IL-12的分泌量降低約1.9倍(P<0.001,圖4D)，TNF-α的分泌量降低約1.6倍(P<0.001，圖4E)。表明NcFBPase可通過激活A(yù)KT通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌。

3 討論

FBPase參與多種細(xì)胞的代謝和發(fā)育，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、分化和抑制腫瘤細(xì)胞生長等多方面作用。在干細(xì)胞中，F(xiàn)BPase主要用于提供NADPH，對(duì)L-賴氨酸的產(chǎn)生具有重要作用，且外源FBPase的過表達(dá)能加速干細(xì)胞生長[8]。在心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞中，F(xiàn)BPase存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞分化。而在肝細(xì)胞中，F(xiàn)BPase通過調(diào)節(jié)鈣離子參與糖異生[9]。在絲狀真菌中，F(xiàn)BPase的磷酸酶結(jié)構(gòu)域突變引起替代氧化酶的轉(zhuǎn)錄激活和糖異生途徑[10]。對(duì)寄生蟲FBPase研究發(fā)現(xiàn)，曼氏血吸蟲FBPase參與糖異生，與蟲體生長有關(guān)[3]；利什曼原蟲FBPase是蟲體的毒力因子[5]；華支睪吸蟲FBPase是致宿主肝臟纖維化的分子[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)FBPase在多種癌癥發(fā)生中起作用，如在前列腺癌中，F(xiàn)BP1抑制癌細(xì)胞增殖、降低遷移速度和侵襲能力，且siRNA-FBP1通過提高波形蛋白的表達(dá)，激活MAPK信號(hào)通路，從而加速癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型[11]。乳腺癌中FBPase調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin通路[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)新孢子蟲胞外囊泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)新孢子蟲胞外囊泡中存在FBPase[13]，而關(guān)于NcFBPase的功能尚不清楚。本研究確定NcFBPase蛋白調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞因子分泌，表明該蛋白與蟲體誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答有關(guān)。

A.p38和ERK的磷酸化水平；B、C.灰度分析；D.IL-6表達(dá)；E.IL-12表達(dá)；F.TNF-α表達(dá)。B、C圖中僅與對(duì)照組比較差異顯著性

A.AKT的磷酸化水平；B.灰度分析；C.IL-6表達(dá)；D.IL-12表達(dá)；E.TNF-α表達(dá)。B圖中僅與對(duì)照組比較差異顯著性

目前研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲及蟲體蛋白能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。新孢子蟲感染導(dǎo)致了宿主Th細(xì)胞的分化，刺激宿主產(chǎn)生IL-6、IL-12、IFN-γ和INF-α等T淋巴細(xì)胞1(Th1)型細(xì)胞因子反應(yīng)，同時(shí)引起氧自由基、一氧化氮及其代謝物的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子對(duì)新孢子蟲均具有殺傷作用[14]。冷滅活的新孢子蟲能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IL-12、IFN-γ和INF-α的分泌，促使Th1型免疫應(yīng)答，而熱滅活的新孢子蟲無此效應(yīng)[15]。目前已報(bào)道新孢子蟲蟲體蛋白與宿主細(xì)胞因子的分泌相關(guān)。棒狀體蛋白5、棒狀體蛋白16和致密顆粒蛋白7參與調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞IFN-γ的分泌及其下游細(xì)胞免疫因子GBP1的表達(dá)[16-17]。棒狀體蛋白16促進(jìn)新孢子蟲對(duì)宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3的激活[17]。14-3-3蛋白參與調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6、IL-12和INF-α的分泌[13]。新孢子蟲表面蛋白(SRS2)和表面抗原1(SAG1)重組蛋白可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)宿主IFN-γ和IL-4的分泌[18]。本研究發(fā)現(xiàn)rNcFBPase可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞IL-6、IL-12和TNF-α的表達(dá)。

MAPK通路能被多種因子激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育，還能夠調(diào)節(jié)Th1免疫反應(yīng)相關(guān)的炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而影響宿主對(duì)寄生蟲感染的免疫應(yīng)答[19]。在新孢子蟲和弓形蟲感染中，巨噬細(xì)胞通過激活p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生，抑制蟲體增殖[20]。弓形蟲的GRA24蛋白從囊泡運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞核可觸發(fā)宿主細(xì)胞p38 MAPK的磷酸化[21]。新孢子蟲以及蟲體蛋白(全蟲蛋白、分泌抗原和胞外囊泡)能夠激活小鼠PMs中MAPK和NF-κB通路[13]。已報(bào)道胰腺癌和前列腺癌細(xì)胞中的FBPase也參與調(diào)控MAPK信號(hào)通路[7.11]。但NcFBPase是否參與調(diào)控MAPK信號(hào)通路尚無報(bào)道。本研究用rNcFBPase刺激小鼠PMs，發(fā)現(xiàn)p38和ERK均發(fā)生磷酸化。而p38和ERK通路抑制劑預(yù)處理小鼠PMs，能顯著抑制由rNcFBPase誘導(dǎo)的IL-6、IL-12和TNF-α分泌。以上這些結(jié)果說明NcFBPase通過激活MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌。

最近研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲的全蟲蛋白以及胞外囊泡也能激活宿主細(xì)胞AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-6和IL-12產(chǎn)生[13]。但FBPase是否與AKT通路的激活相關(guān)尚無報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)rNcFBPase能誘導(dǎo)小鼠PMs中AKT蛋白的磷酸化。用AKT通路的抑制劑IV預(yù)處理細(xì)胞能顯著降低由rNcFBPase誘導(dǎo)的IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量。以上結(jié)果表明NcFBPase可通過激活A(yù)KT通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。

綜上，本研究表達(dá)rNcFBPase蛋白，并探究rNcFBPase與宿主信號(hào)通路和細(xì)胞因子之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rNcFBPase可以激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的MAPK和AKT信號(hào)通路，并誘導(dǎo)IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，為進(jìn)一步揭示宿主抗新孢子蟲感染免疫應(yīng)答機(jī)制提供依據(jù)。