張路捷，高雁怩，夏婷婷，白娟，姜平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)可引起豬嚴(yán)重疫病，呈現(xiàn)高發(fā)病率和死亡率，高熱和全身出血等特征，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，至今尚無有效的商品化疫苗和治療方法，早期診斷是控制該病的重要方法之一[1]。

ASFV是一個(gè)復(fù)雜的二十面體雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為170～190 kb，共編碼50多種結(jié)構(gòu)蛋白，其中p72、p54和p30蛋白具有較好的抗原性和免疫原性，可用于ASFV血清學(xué)診斷[2-6]。ASFV p30蛋白由CP204L基因編碼，屬于病毒的早期蛋白，主要參與病毒入侵過程[7]，能夠誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[8]。本研究根據(jù)ASFV Pig/HLJ/2018毒株序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CP204L(p30)基因，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得ASFV重組p30蛋白，制備出2株針對(duì)p30蛋白的單克隆抗體，為ASFV診斷和生物學(xué)特性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ASFV陽(yáng)性病料、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)和pET-32a (+)載體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬塞內(nèi)卡病毒A(SVA)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(6～12周齡)購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞玻片和滅活病毒液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所制備提供。

DH5α及BL21(DE3)，購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；2 × Phanta Max Master Mix和180 kDa Prestained Protein Marker，購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗鼠IgG、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，購(gòu)自Proteintech生物科技有限公司；TanonTM High-sig ECL Western blot底物試劑盒，購(gòu)自天能科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank MK333180)毒株的CP204L(p30)基因序列設(shè)計(jì)引物，p30-F:5′- GCGGAATTCAT-GGATTTTATTTTAAATATA -3′，含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)；p30-R:5′- CGCCTCGAGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAAT-3′，含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)，用于擴(kuò)增CP204L(p30)基因，大小為582 bp。病毒DNA由ASFV陽(yáng)性病料中提取。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。將目的片段和pET-32a(+)載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定正確后送通用生物系統(tǒng)公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET-32a-p30并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組p30蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-p30轉(zhuǎn)化至BL21，于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。將誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行超聲波破碎后于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，分別收集沉淀和上清，通過SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達(dá)形式。用尿素透析法純化目的蛋白[9-10]，利用BCA法測(cè)定目的蛋白濃度，通過Western blot試驗(yàn)(用ASFV陽(yáng)性血清)鑒定重組p30蛋白抗原性。重組p30蛋白置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組p30蛋白單克隆抗體制備

1.4.1 動(dòng)物免疫

取5只6～8周齡雌性BALB/c小鼠分別命名為鼠1～5，將純化的重組p30蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化，通過皮下多點(diǎn)注射方式免疫小鼠，免疫劑量為50 μg/只。二免、三免用弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫間隔2周，第3次免疫后1周對(duì)小鼠進(jìn)行尾部采血，分離血清，用間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)；融合前3 d選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，腹腔注射100 μg重組蛋白

1.4.2 單克隆抗體制備

沖擊免疫后3 d將小鼠安樂死并分離脾細(xì)胞，在PEG4000作用下與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞按照7∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞鋪至含有HAT選擇培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。細(xì)胞融合7 d后，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞需進(jìn)行2～3次亞克隆直至抗體陽(yáng)性率達(dá)100%。將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存于液氮中長(zhǎng)期保存。

1.4.3 間接ELISA方法

將重組p30蛋白用碳酸鹽抗原包被液稀釋至2 μg/mL包被酶標(biāo)板，于4 ℃包被過夜并用5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，加入酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照；用PBST洗滌3次后加入100 μL羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(1∶1 000稀釋)于37 ℃反應(yīng)45 min；洗滌同上，每孔加入100 μL TMB顯色液于37 ℃避光顯色10 min；加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(S/N)>2.1判定為陽(yáng)性。

1.4.4 腹水制備

選取12周齡雌性BALB/c小鼠，向小鼠腹腔內(nèi)注射500 μL無菌液體石蠟。7 d后，向小鼠腹腔中注射3 × 106～4 × 106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。5～7 d后，小鼠的腹部會(huì)變大，觸之有波動(dòng)感、行動(dòng)不敏捷、被毛粗糙時(shí)收集腹水，于4 000 r/min離心5 min，取中間層液體，于-80 ℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體分泌穩(wěn)定性及亞型測(cè)定

將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，每隔5代凍存一批細(xì)胞，測(cè)定不同代次的細(xì)胞上清中ELISA抗體效價(jià)。按照小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書鑒定其亞型。

1.5.2 Western blot反應(yīng)性鑒定

取重組p30蛋白及豬肺泡巨噬細(xì)胞上增殖的ASFV滅活病毒液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上。以雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)性鑒定，同時(shí)設(shè)立空載誘導(dǎo)菌體和豬肺泡巨噬細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.5.3 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)反應(yīng)性鑒定

取ASFV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞及其玻片(4%多聚甲醛固定)，用PBS(pH = 7.2)洗滌3次后每孔加入200 μL含有2% 牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液，于37 ℃封閉2 h；洗滌同上，每孔加入200 μL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，于37 ℃反應(yīng)1 h；洗滌同上，每孔加入200 μL FITC-羊抗鼠IgG(用PBST進(jìn)行1∶200稀釋)，37 ℃ 反應(yīng)1 h后，用PBST重復(fù)洗滌3次，將玻片置于在熒光顯微鏡下觀察，使用EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)拍攝照片并保存。

1.5.4 單克隆抗體特異性鑒定

取PRRSV、PRV、SVA、PEDV和ASFV滅活病毒液進(jìn)行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)印至NC膜上。以雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)性鑒定，同時(shí)設(shè)立豬肺泡巨噬細(xì)胞作為陰性對(duì)照。驗(yàn)證單克隆抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的p30目的基因片段大小為582 bp，與預(yù)期相符。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-p30進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后的目的片段與目的基因大小一致并且基因測(cè)序結(jié)果完全正確(圖1)。

M. DL5000 DNA Marker；1. pET-32a-p30雙酶切產(chǎn)物；2. p30基因PCR產(chǎn)物；3. pET-32a-p30重組質(zhì)粒

2.2 重組p30蛋白表達(dá)、純化及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組菌BL21-p30經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在50 kDa處有明顯條帶，與預(yù)期大小相符，且為不溶性表達(dá)。重組p30蛋白通過尿素透析法純化后在處出現(xiàn)單一條帶(圖2A)。Western blot結(jié)果表明，ASFV陽(yáng)性血清能與重組p30蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，證明該蛋白具有良好的抗原性(圖2B)。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后上清；2. 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后沉淀；3、5. 純化的重組p30蛋白；4、6. 空載體誘導(dǎo)全菌蛋白

2.3 小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定

小鼠3次免疫后1周，用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。與陰性小鼠相比，免疫組內(nèi)的所有小鼠均表現(xiàn)出具有較高水平的p30蛋白抗體效價(jià)，血清抗體效價(jià)均大于1∶25 800。

2.4 單克隆抗體制備及效價(jià)測(cè)定

采用本研究建立的間接ELISA方法篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗ASFV p30蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2B9和8B9。將2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代至20代，細(xì)胞上清ELISA抗體效價(jià)穩(wěn)定，用2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備小鼠腹水，抗體效價(jià)較高(表1)。

表1 雜交瘤細(xì)胞上清和腹水ELISA抗體效價(jià)測(cè)定

2.5 單克隆抗體亞型鑒定

結(jié)果見如表2，2株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型。

表2 單克隆抗體亞型鑒定

2.6 單克隆抗體Western blot反應(yīng)性鑒定

Western blot結(jié)果顯示(圖3)，2株單克隆抗體均能與重組蛋白以及ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，而與空載誘導(dǎo)全菌和豬肺泡巨噬細(xì)胞不反應(yīng)。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. ASFV 感染后24 h滅活病毒液；2. 非感染細(xì)胞對(duì)照；3. 重組p30蛋白；4. 空載誘導(dǎo)全菌蛋白

2.7 單克隆抗體IFA反應(yīng)特性鑒定

IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，單克隆抗體制備2B9和8B9均能與ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的綠色熒光。

2.8 單克隆抗體特異性鑒定

Western blot結(jié)果顯示(圖5)，2株單克隆抗體只能與ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，而與PRRSV、PRV、SVA和PEDV不發(fā)生反應(yīng)。

圖4 抗p30蛋白單克隆抗體與ASFV的IFA反應(yīng)

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. PRRSV；2. PRV；3. SVA；4. PEDV；5. ASFV；6. 非感染細(xì)胞對(duì)照

3 討論

2018年至今非洲豬瘟對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。目前關(guān)于ASFV致病機(jī)理以及編碼蛋白的功能研究較少，然而單克隆抗體能夠在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮重要作用。ASFV單克隆抗體研制主要集中在p72、p54、p30蛋白上[12-15]。p30蛋白在病毒感染早期能促進(jìn)病毒的內(nèi)化[16]。相關(guān)研究表明，ASFV感染宿主細(xì)胞4 h后Western blot能夠檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)，隨后在整個(gè)病毒復(fù)制周期中持續(xù)存在[17]。Oviedo等[18]發(fā)現(xiàn)p30蛋白適合用于ELISA抗體檢測(cè)，并且p30和p54蛋白的聯(lián)合應(yīng)用可提高方法ELISA方法的敏感性。研究p30蛋白單克隆抗體有助于ASFV致病機(jī)制的研究以及血清學(xué)檢測(cè)方法的建立。本研究通過原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)重組p30蛋白，Western blot證明該蛋白具有良好的抗原性。將重組p30蛋白免疫BALB/c小鼠，利用間接ELISA方法篩選出2株針對(duì)p30蛋白的單克隆抗體，分別為2B9和8B9，為該病毒檢測(cè)和生物學(xué)功能研究提供了有用材料。

單克隆抗體反應(yīng)特性是決定其應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)。Wu等[15]采用桿狀病毒表達(dá)重組p30(24～188 aa)蛋白，制備了21株p30蛋白單克隆抗體，并鑒定了4種抗原表位，對(duì)ASFV感染的早期診斷具有重大意義。本研究分別測(cè)定了2B9和8B9雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性、抗體效價(jià)、Ig亞型、Western blot和IFA反應(yīng)性，結(jié)果表明2B9和8B9單克隆抗體從P10代開始穩(wěn)定分泌抗體，腹水抗體效價(jià)分別為1∶512 000和1∶128 000，2株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型。Western blot反應(yīng)性鑒定試驗(yàn)顯示，2株單克隆抗體均能與ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，在32 kDa處出現(xiàn)預(yù)期的條帶。IFA反應(yīng)性鑒定試驗(yàn)顯示，2株單克隆抗體均能夠識(shí)別ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞，證明該2株單抗具有重要應(yīng)用價(jià)值，但其針對(duì)的ASFV p30蛋白抗原表位尚需要進(jìn)一步研究。