張毅，陳斌，梁璐琪，邵靚，周明忠，裴超信，陳弟詩，丁夢蝶，陳冬

(四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041)

戊型肝炎是一種人畜共患傳染病，由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)引起，人的發(fā)病以青壯年為主，病程4～6 周，死亡率0.5%～3%，臨床可表現(xiàn)從亞臨床感染到重度肝炎，對妊娠、慢性肝病、免疫缺陷、器官移植等特殊人群威脅重大[1]。對人易感的HEV僅有1個血清型，4個基因型[2]，其中基因1型、2型僅感染人，基因3型、4型則可感染人和豬、鼠等多種動物。豬是HEV主要的儲存宿主和傳染源，其感染HEV時不產(chǎn)生明顯臨床癥狀和病變，豬源HEV可能通過食用未煮熟的豬肉產(chǎn)品[3]、長期的職業(yè)暴露(屠宰場工人[4]、獸醫(yī)[5])等途徑傳播給人，對于公共衛(wèi)生安全是一種嚴(yán)重的潛在威脅。

HEV基因組全長約7.2 kb，目前已發(fā)現(xiàn)4個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1主要編碼復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2和ORF3由病毒亞基因組的可選閱讀框產(chǎn)生，分別編碼衣殼蛋白和小免疫磷蛋白，ORF2編碼的衣殼蛋白含有重要免疫表位，后者與細(xì)胞骨架相關(guān)；ORF4只在基因1型中發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)位于ORF1內(nèi)部，編碼蛋白通過形成蛋白復(fù)合物參與病毒的復(fù)制[6]。

為了解四川豬源HEV流行特征，本研究對四川部分地區(qū)的屠宰場生豬進(jìn)行HEV監(jiān)測，并對HEV編碼衣殼蛋白的ORF2部分序列進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為HEV的防控策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年在四川省13個地區(qū)屠宰場采集的豬組織樣品(淋巴結(jié)、肝)358份，-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit總核酸提取試劑盒，購自Thermo Fisher Scientific 公司; One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Tks GflexTMDNA Polymerase、DL2000 DNA Marker等，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計與合成

熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：參照文獻(xiàn)[7]建立的方法進(jìn)行。

套式RT-PCR(RT-nPCR)：根據(jù)GenBank中3型與4型HEV基因組序列，進(jìn)行核苷酸比對分析，在HEV ORF2的保守區(qū)設(shè)計2對套式PCR引物HEV-out-F和HEV-out-R、HEV-in-F和HEV-in-R，終產(chǎn)物為ORF2 5′端長度為1 020 nt的部分序列(去除兩端引物后為977 nt)。引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳見表1。

表1 HEV檢測和序列擴(kuò)增所用引物、探針

1.4 樣品前處理

將每份樣品的淋巴結(jié)、肝各剪取約0.01 g，混合后放入裂解介質(zhì)管，加入800 μL PBS，使用組織勻漿儀勻漿1 min，8 000 r/min 離心2 min，取組織上清液200 μL進(jìn)行總核酸提取。

1.5 核酸提取

使用MagMAXTMPathogen RNA/DNA Kit總核酸提取試劑盒，配合自動核酸提取儀提取組織上清液中的總核酸?？偤怂嶂?70 ℃保存。

1.6 HEV的qRT-PCR檢測

使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系為：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，2×buffer 10 μL，反轉(zhuǎn)錄酶0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，總核酸 2 μL，無核酸酶水4.7 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃，5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線的樣品判定為陽性。

1.7 HEV ORF2部分序列的擴(kuò)增

選出qRT-PCR陽性樣品的總核酸，使用設(shè)計的RT-nPCR方法分兩步進(jìn)行擴(kuò)增。首先使用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2進(jìn)行一步法RT-PCR，反應(yīng)體系為：10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，RT-PCR反應(yīng)液10 μL，酶混合物0.8 μL，總核酸 2 μL，無核酸酶水5.2 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃，30 min；94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35個循環(huán)。隨后用無核酸酶水對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋，作為第2輪擴(kuò)增DNA模板。使用Tks Gflex DNA Polymerase進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10 μmol/L上游引物2.5 μL，10 μmol/L下游引物2.5 μL，Gflex反應(yīng)液25 μL，Gflex DNA聚合酶1 μL，DNA模板2 μL，無核酸酶水17 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s，30個循環(huán)。取第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功獲得目的片段的樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆測序。

1.8 HEV ORF2部分序列分析

將獲得的HEV ORF2部分序列提交GenBank，從GenBank中獲取禽源HEV 1株，HEV基因1、2、3、4型代表株26株，BLAST相似率最高的HEV毒株11株，共計38條HEV ORF2部分序列作為參考，使用Lasergene 7.0 的 MegAlign 模塊的Clustal W方法進(jìn)行核苷酸比對分析(不包括禽源HEV)，使用MEGA 7.0進(jìn)行Neighbor-Joining法系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場HEV核酸檢測

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，屠宰場豬組織樣品HEV總陽性率為4.75%(17/358)，61.54%(8/13)的地區(qū)有HEV陽性樣品檢出，不同地區(qū)陽性率為4.35%～44.44%。各地區(qū)檢測結(jié)果見表2。

表2 HEV檢測結(jié)果、陽性樣品的毒株命名及GenBank登錄號

2.2 ORF2部分序列RT-nPCR擴(kuò)增

使用建立的RT-nPCR方法，17份陽性樣品的ORF2部分序列均成功擴(kuò)增，見圖1。

2.3 HEV ORF2部分序列分析

2.3.1 同源性分析

17個四川HEV毒株的ORF2部分序列均長977 nt，與參考序列相比，未發(fā)生缺失和插入。提交GenBank，序列號為MT263364-MT263380。核苷酸比對分析發(fā)現(xiàn)，17個毒株序列之間同源率存在較大差異(85.4%～99.4%)。一些來自相同地區(qū)的毒株高度同源，如3個資陽株swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4之間同源率高達(dá)99%～99.4%；但多數(shù)地區(qū)存在差異較大的毒株，如3個雅安株之間、資陽株swSCzy1和其他3個資陽株之間，同源性分別只有85.37%～87.5%和87.1%～87.4%。

M.DL2000 Marker；1～17.HEV陽性樣品的ORF2產(chǎn)物

將17個四川毒株與37個參考序列比較，同源率為76.4%～97%，其中swSCcd1與基因4d型的中國豬源毒株CHN-SD-sHEV同源率最高為97%，swSCbz1、swSCnc1均與基因1型的印度人源毒株IND-HEV-AVH5-2010同源率最低為76.5%。swSCnj1等8個毒株與4a亞型代表株JKO-ChiSai98C同源率較高(91.6%～92.6%)，swSCya2等3個毒株與4b亞型代表株CVS-Sie10同源率較高(94.6%～95.6%)，swSCcd1等6個毒株與4d亞型代表株CH-YT-1同源率較高(94.7%～95.9%)。17個毒株中，有10株與人源毒株同源率超過95%，有6株與人源毒株同源率高于豬源毒株，同源率在94.6%～96%之間，與豬源毒株同源率更高的有11株，同源率在94%～97%之間，詳見表3。

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖2所示，HEV基因1～4型形成4個主要的進(jìn)化分支，1型和2型由人源HEV毒株組成，3型和4型由人源、猴源、豬源、藏豬源等毒株組成，17個四川毒株的ORF2部分序列分別處于基因4型中的4a、4b和4d亞分支，3個亞分支均同時包含人源、豬源HEV毒株。其中swSCnj1、swSCnj2、swSCzy2、swSCzy3、swSCzy4、swSCya3、swSClz1、swSCnj3等8株，與4a亞型代表株JKO-ChiSai98C處于同一亞分支，劃為4a亞型；swSCya2、swSCbz2、swSCzy1等3株與4b亞型代表株CVS-Sie10處于同一亞分支，劃為4b亞型； swSCcd1、swSCnc1、swSCbz1、swSCpzh1、swSCcd2、swSCya1等6株與4d亞型代表株CH-YT-1處于同一亞分支，劃為4d亞型。

表3 四川豬源HEV毒株同源性最高的豬源及人源HEV毒株

▲為本研究測定的毒株序列

3 討論

我國是戊型肝炎高發(fā)地區(qū)，自2001年以來，人感染戊型肝炎呈上升趨勢[8]。生豬是HEV的主要動物宿主和傳染源之一，四川地區(qū)一些屠宰場設(shè)施自動化程度、生物安全水平較低，人感染HEV的風(fēng)險需要評估。因此，有必要對生豬的帶毒情況進(jìn)行監(jiān)測。由于抗體水平無法實時反映帶毒情況，本研究采用敏感性高的熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明四川13個地區(qū)中有8個地區(qū)的豬群存在HEV感染，地區(qū)分布較廣，總陽性率為4.21%。與中國不同地區(qū)豬群HEV陽性率差異較大(2.25%～46.7%)[9-13]的情況相似，四川省也表現(xiàn)出地區(qū)間陽性率差異大的特征，為0～44.44%。其中陽性率在前位的資陽市、成都市、內(nèi)江市均是四川省生豬交易頻繁的地區(qū)，HEV陽性率可能與生豬流動頻率相關(guān)，但還需進(jìn)一步收集證據(jù)。

我國豬群主要流行HEV基因4型，其中4a和4d占主導(dǎo)地位，基因3型和基因4型的其他亞型也有報道。對17株HEV ORF2部分序列進(jìn)行分析，核苷酸同源性為85.4%～99.4%，均為基因4型，其中4a亞型8株，4b亞型3株，4d亞型6株，與中國現(xiàn)在流行趨勢一致[14-15]，而4b亞型也是四川[16]、廣西[10]、廣東[17]地區(qū)的優(yōu)勢基因亞型。本研究發(fā)現(xiàn)的4a和4d亞型毒株與四川甘孜藏豬源HEV毒株有較高同源性，表明豬源HEV遺傳有較強(qiáng)的地域性特征。

目前已通過動物試驗證實，豬源基因3型、4型HEV可感染非人靈長類，人源基因3型、4型HEV也可感染豬。從人醫(yī)臨床上看，歐洲、美國等國家主要流行基因1、3型[18]；我國主要流行基因1、4型，其中4型又以4a、4d、4h亞型為主[19]，四川豬源HEV優(yōu)勢亞型中的4a、4d與人源毒株亞型一致。本研究發(fā)現(xiàn)，17個四川豬源毒株中有10株與人源毒株同源率超過95%，有6株與人源HEV的同源率高于豬源，表明四川豬源HEV與我國主要流行的人源HEV遺傳關(guān)系密切，具有較大的人畜共患風(fēng)險，應(yīng)提高防范意識，有針對性、系統(tǒng)性地進(jìn)行預(yù)防和控制。