董國(guó)文,陳 飄,任國(guó)平,王 超,金曙光,葉 捷*,周順桂

碳化硼促進(jìn)A1501電催化固氮產(chǎn)氨及機(jī)制

董國(guó)文1,2,陳 飄1,任國(guó)平1,王 超1,金曙光3,葉 捷1*,周順桂1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,福建省土壤健康與調(diào)查重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004；3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085)

以() A1501為模式固氮菌株、碳化硼(B4C)為典型電子傳遞載體構(gòu)建電催化氮還原體系,探究B4C添加對(duì)該體系固氮產(chǎn)氨性能的影響.結(jié)果表明,B4C能夠顯著提高A1501介導(dǎo)的電催化氮還原體系的產(chǎn)氨性能.在0.4g/L投加量條件下,900℃煅燒溫度下制備的B4C(B4C900)的添加能夠使電催化體系氨累積量提高117%,這是由于B4C900表面豐富的活化位點(diǎn)能夠促進(jìn)N2吸附與活化.此外,電化學(xué)和光譜學(xué)譜圖表明,B4C900的添加不僅能夠促使A1501分泌更多的氧化還原活性物質(zhì),而且驅(qū)動(dòng)高活性陰極生物膜的形成,進(jìn)而強(qiáng)化電極電子的長(zhǎng)距離傳遞及利用.

A1501；B4C；電催化；生物固氮

氮是構(gòu)成生物的最主要元素之一,其在自然界中主要以氮?dú)?N2)的形式存在[1].由于N2鍵能較高、活化困難,只有將N2有效轉(zhuǎn)化為氨時(shí),才能被生物體有效吸收和利用,因此固氮產(chǎn)氨過(guò)程在生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用[2].傳統(tǒng)的Haber- Bosch工藝能夠利用鐵基催化劑將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)化為氨,但是該過(guò)程存在反應(yīng)條件苛刻(105.1× 105～303×105Pa,300～550℃)、能耗高(14kW×h/kg NH3)、產(chǎn)生大量溫室氣體等問(wèn)題[3].為克服Haber- Bosch工藝存在的缺陷,有研究學(xué)者以鉬、鐵、鈷基過(guò)渡金屬絡(luò)合物作為催化劑驅(qū)動(dòng)溫和條件下的固氮產(chǎn)氨過(guò)程[4],但這些過(guò)渡金屬絡(luò)合物為均相催化劑,難以回收利用,且需要額外添加還原劑等物質(zhì),導(dǎo)致該技術(shù)的實(shí)用性不強(qiáng).因此,開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易高效的固氮產(chǎn)氨工藝是目前研究的熱點(diǎn).

電催化氮還原為近年來(lái)興起的研究方向,該工藝具有常溫常壓操作和反應(yīng)速率可控等明顯優(yōu)勢(shì),可為綠色、持續(xù)地固氮產(chǎn)氨提供有效途徑[5].不同催化劑包括Mo2N、pAu/NF、TiO2等被廣泛應(yīng)用于電催化氮還原體系中[6],但是該過(guò)程仍然存在產(chǎn)物合成效率低及選擇性差等缺點(diǎn).雖然固氮酶的存在被證實(shí)能夠有效克服傳統(tǒng)電催化氮還原體系存在的問(wèn)題[7],但由于其缺乏自我復(fù)制能力且耐氧性弱,因此限制了固氮酶介導(dǎo)的電催化氮還原體系的大規(guī)模推廣應(yīng)用[8].將固氮微生物與傳統(tǒng)電催化氮還原體系相結(jié)合目前受到了廣泛關(guān)注[9].相比于固氮酶,固氮微生物更能夠適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境,從而為實(shí)現(xiàn)氨的綠色合成帶來(lái)了契機(jī).但是目前對(duì)于固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系的研究還處于起步階段,僅有的研究結(jié)果顯示該體系的固氮產(chǎn)氨效率較低[10],需要進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn).

提高固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系產(chǎn)氨性能的核心是強(qiáng)化固氮微生物與電催化陰極微界面的相互作用,即促進(jìn)電催化陰極電子的傳遞及利用[11].研究表明,固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系中,陰極生物膜成膜是一個(gè)艱難且緩慢的過(guò)程,這主要是由于陰極作為電子供體,其表面所聚集的負(fù)電荷會(huì)對(duì)表面同樣帶負(fù)電的微生物產(chǎn)生排斥作用,進(jìn)而影響固氮微生物附著于陰極表面接收電子[12].此外,還有研究顯示,與陰極直接接觸的生物膜的活性會(huì)隨著代謝終產(chǎn)物的積累而顯著降低,從而影響電極電子向生物膜外層及溶液中傳輸[13],進(jìn)而降低固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系產(chǎn)氨性能.相比于電極材料改性、微生物基因修飾/改造等手段,電子傳遞載體的添加被證實(shí)能夠有效促進(jìn)電極電子的傳遞與利用[14].目前常用的電子傳遞載體包括甲基紫精、銪(Ⅲ/Ⅱ)基配合物、鈷鈰陽(yáng)離子絡(luò)合物等[15].但是這些電子傳遞載體的制備方法較為復(fù)雜且價(jià)格昂貴,不利于規(guī)?；茝V應(yīng)用.相比較下,碳化硼(B4C)由于具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、(電)化學(xué)穩(wěn)定性及導(dǎo)電性而引起研究者的廣泛關(guān)注[16].Qiu等[17]研究顯示,B4C表面存在不同的活性位點(diǎn),能夠有效促進(jìn)N2吸附.Yu等[18]證實(shí),碳基骨架的硼摻雜能夠促進(jìn)電子密度的重新分布,進(jìn)而增強(qiáng)其與電子及N2結(jié)合能力.與此同時(shí),B4C雖然在高溫下制備,但其克服了傳統(tǒng)工藝中的高壓、使用高純N2和H2作為載流體等問(wèn)題.并且傳統(tǒng)工藝制備的材料多以鐵或釕基金屬為主,而碳化硼可以有效避免金屬離子的排放,在一定程度上減少對(duì)環(huán)境造成污染的風(fēng)險(xiǎn).但是目前尚未有研究將B4C應(yīng)用于固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系,其對(duì)該體系固氮產(chǎn)氨性能的影響及作用機(jī)制也不明確.

A1501是我國(guó)從水稻根際分離出的一株內(nèi)生固氮菌,在微好氧條件下具有較強(qiáng)的生物固氮能力[19].已有研究證明該菌株能夠接收胞外電子驅(qū)動(dòng)自身代謝[20],且在缺乏碳源時(shí),代謝合成的NH3難以被同化利用而分泌到胞外[21].因此,本研究以A1501為模式固氮菌株、B4C為典型電子傳遞載體構(gòu)建固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系,探究不同條件下該體系產(chǎn)氨性能,分析B4C的添加對(duì)反應(yīng)體系浮游微生物及陰極生物膜分布及氧化還原活性的影響,闡明相關(guān)電子傳遞機(jī)制,以期為構(gòu)建高效的電催化固氮產(chǎn)氨體系提供新的見(jiàn)解.

1 材料與方法

1.1 B4C的合成及P. stutzeri A1501的培養(yǎng)

將硼酸和可溶性淀粉以1:5的質(zhì)量比在瑪瑙研缽中充分研磨以制備B4C的混合前驅(qū)體.隨后將制備好的混合前驅(qū)體置于合肥科晶材料技術(shù)有限公司GSL-1100X-S氣氛管式電阻爐中,設(shè)置煅燒溫度分別為500, 700, 900, 1100℃,在氬氣條件下煅燒3h.待冷卻后將所得產(chǎn)物用0.1mol/L HCl洗滌3次,再用去離子水反復(fù)沖洗3次,隨后將所有樣品置于德國(guó)Alpha 1-4LDplusde凍干機(jī)冷凍干燥備用[18].最終得到的樣品標(biāo)記為B4C,其中為煅燒溫度.

A1501由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院林敏研究員提供.將獲得的A1501接入LB培養(yǎng)基中,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),收集對(duì)數(shù)期的菌液(OD600≈0.6),4℃保存作為原始菌液.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的菌液是將原始菌液按5%接種量進(jìn)行二次培養(yǎng)所獲得的對(duì)數(shù)期菌液(OD600≈0.6).然后取1000mL對(duì)數(shù)期菌液,在6000r/min條件下離心5min,去掉上清液,用等量0.9%生理鹽水重懸浮,重復(fù)3次,然后加入10mL的生理鹽水備用.

1.2 電催化體系的構(gòu)建及固氮產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建H型雙室電催化反應(yīng)器[22],各室總體積為150mL,中間以Nafion 117質(zhì)子交換膜分隔[23].將改良后的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基(去除乳酸和氯化銨)和一定量的B4C接入陰極室(100mL,pH=6.8),陽(yáng)極室接入磷酸鹽緩沖溶液(110mL,pH=7).將反應(yīng)器置于高溫滅菌鍋121℃滅菌30min,冷卻后曝氮?dú)?h去除2個(gè)室的氧氣.然后將1mL準(zhǔn)備好的A1501菌液接入陰極室中.最后將反應(yīng)器接入辰華CHI1000C電化學(xué)工作站,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)反應(yīng).反應(yīng)器工作電極和對(duì)電極均采用石墨板(30mm×20mm×3mm),參比電極為飽和甘汞電極(SCE).設(shè)置一定電壓,每60s記錄電流1次,每隔24h測(cè)定反應(yīng)器中氨的累積量.

為探究不同操作條件對(duì)A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨性能的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同處理,包括不同煅燒溫度(B4C500、B4C700、B4C900、B4C1100)、投加量(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8g/L)及電壓條件(-0.3, -0.5, -0.7, -0.9V).通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)評(píng)估驅(qū)動(dòng)電催化體系固氮產(chǎn)氨的關(guān)鍵因素.此外,為了分析所產(chǎn)生氨中N元素的來(lái)源,將20mL15N標(biāo)記的N2注入反應(yīng)器中,反應(yīng)16d后利用賽默飛253plus同位素質(zhì)譜儀測(cè)定15N(/= 29)/14N(/=28)的比率.所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組重復(fù).

1.3 分析方法

采用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行NH4+濃度測(cè)定[24].采用賽默飛IS 50FTIR傅里葉紅外光譜分析儀分析B4C官能團(tuán)[25].采用美國(guó)康塔儀器公司AutoChem II2920全自動(dòng)程序升溫化學(xué)吸附儀(TPD)研究B4C對(duì)N2的吸附能力[26].采用辰華CHI 660E電化學(xué)工作站進(jìn)行B4C接受電子能力(EAC)和提供電子能力(EDC)及循環(huán)伏安(CV)測(cè)定[27-28].采用阿美特克VersaSCAN SECM進(jìn)行SECM光譜掃描,掃描速率為200 μm/s[29].采用賽默飛原位電化學(xué)-傅里葉紅外變換光譜儀(FTIR)對(duì)樣品進(jìn)行表征[30].采用賽默飛LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit試劑盒測(cè)定細(xì)胞活/死比率[31].使用德國(guó)卡爾蔡司公司Zeiss Sigma 300場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)樣品形貌進(jìn)行表征.

通過(guò)ART Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定.用于qRT-PCR的引物對(duì)RT、RT、RT、RT的序列參照于Zhan 等[32].擴(kuò)增和檢測(cè)特異性產(chǎn)物方法為:95℃10min;95℃30s,40個(gè)循環(huán);55℃1min;72℃30s,然后進(jìn)行解離曲線分析.以16sRNA作為內(nèi)參基因,相對(duì)基因表達(dá)量用2-??CT計(jì)算[33].

采用origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并利用SPSS 22.0軟件中的檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,當(dāng)< 0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 B4C表征

a: FTIR光譜圖;b: N2-TPD圖;c: EAC圖;d: EDC圖

對(duì)不同溫度制備的B4C材料進(jìn)行傅里葉紅外光譜表征,結(jié)果如圖1a所示.在所制備樣品中,以3437和1583cm-1為中心的特征峰分別歸因于O-H鍵的拉伸振動(dòng)及C=C鍵的拉伸振動(dòng)[18].此外,在1285和1032cm-1處出現(xiàn)了2個(gè)明顯的特征峰,分別為B-O鍵和B-C鍵的拉伸振動(dòng)[18].這表明成功制備了B4C材料,其中B4C900具有最強(qiáng)的紅外響應(yīng).通過(guò)程序升溫脫附實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定B4C材料對(duì)N2的吸附性能.如圖1b所示,不同溫度制備的B4C材料具有不同的N2物理吸附的解吸峰.相比于B4C500和B4C700而言,B4C900存在更高的N2解吸溫度且峰面積更大,這意味著適當(dāng)提高煅燒溫度能夠有效活化材料表面的吸附位點(diǎn),促進(jìn)N2吸附[34].但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),容易導(dǎo)致材料結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而減少其表面有效N2吸附位點(diǎn)(B4C1100).此外,由EAC及EDC組成的電子交換容量是表征材料氧化還原活性的重要指標(biāo)[35].研究結(jié)果顯示(圖1c、d),隨著B(niǎo)4C懸浮液的加入,EAC及EDC均出現(xiàn)了明顯的電流響應(yīng),證實(shí)B4C具有接收及提供電子能力,這可能是歸因于碳主鏈之間快速的電子傳遞動(dòng)力學(xué)特性[36].這其中B4C900的電流峰面積最大,意味著其所轉(zhuǎn)移的電子數(shù)最多.本研究還發(fā)現(xiàn)B4C900的EAC值明顯高于其EDC值,說(shuō)明B4C900表面的氧化還原基團(tuán)主要處于氧化狀態(tài),這有利于其從電極表面接收電子[37].

2.2 B4C促進(jìn)電催化體系固氮產(chǎn)氨性能

不同煅燒溫度對(duì)B4C-A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨性能的影響如圖2a所示.雖然添加不同B4C(B4C500、B4C700、B4C900、B4C1100)體系中均能檢測(cè)到氨的持續(xù)產(chǎn)生,但是從第2d開(kāi)始, B4C900體系中氨的累積量逐漸高于其它反應(yīng)體系.第14d時(shí)B4C900體系中氨累積量達(dá)到(1.192±0.08) mg/L,比B4C500、B4C700、B4C1100分別提高了71.42%、53.19%、26.31%.這些結(jié)果表明,900℃是制備B4C的最佳煅燒溫度.

不同B4C900投加量對(duì)B4C900-A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨性能的影響如圖2b所示.隨著B(niǎo)4C900投加量的增加,反應(yīng)器產(chǎn)氨性能逐漸增強(qiáng),在投加量為0.4g/L條件下氨的累積量達(dá)到最大值.此后,隨著B(niǎo)4C900投加量的繼續(xù)增加,氨累積量卻呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì).這可能是由于過(guò)多的B4C900會(huì)導(dǎo)致彼此之間聚集而沉淀,不僅造成表面有效N2吸附位點(diǎn)的減少,而且影響B(tài)4C900對(duì)電極電子的捕獲及利用.

不同電壓對(duì)B4C900-A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨性能的影響如圖2c所示.當(dāng)電壓從-0.3V增加到-0.9V時(shí),反應(yīng)器中氨累積量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì).當(dāng)電壓為-0.5V時(shí),反應(yīng)器的氨累積量達(dá)到最大值.這可能是因?yàn)檫^(guò)低的電勢(shì)不足以提供足夠的電子驅(qū)動(dòng)N2還原,而電勢(shì)過(guò)高不僅會(huì)加劇競(jìng)爭(zhēng)性析氫反應(yīng)的進(jìn)行,而且會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)外氧化還原電位,進(jìn)而可能造成微生物的死亡[38].

如圖2d所示,在僅有A1501的條件下,經(jīng)過(guò)2d的培養(yǎng)僅有少量氨生成((0.015±0.03)mg/L),這可能是由于A1501二次培養(yǎng)過(guò)程中殘留的代謝產(chǎn)物而引起.而在沒(méi)有電極的條件下,各系統(tǒng)的固氮產(chǎn)氨性能均較低,這說(shuō)明電極作為電子供體是該體系固氮產(chǎn)氨過(guò)程的重要因素之一.相比較之下,當(dāng)沒(méi)有B4C900的條件下,A1501能夠接收電極電子進(jìn)行固氮產(chǎn)氨過(guò)程,其氨累積量達(dá)到了(0.43±0.05)mg/L.而隨著B(niǎo)4C900的添加,氨累積量提高了117%,這說(shuō)明B4C900顯著提高了生物電催化體系固氮產(chǎn)氨性能.

a:不同溫度制備的B4C材料的氨累積量;b:不同B4C900材料投加量的氨累積量;c:不同電壓下的氨累積量;d:純材料、純菌及不加電體系的氨累積量;e:對(duì)照組A15+(-0.5V)的15N/14N和14N/14N同位素比質(zhì)譜圖;f:實(shí)驗(yàn)組A15+B4C900+(-0.5V)的15N/14N和14N/14N同位素比質(zhì)譜圖;g:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度

利用元素分析儀-同位素質(zhì)譜法分析對(duì)照組(圖2e)和實(shí)驗(yàn)組(圖2f)δ15N信號(hào).結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組具有更高的15N/14N比率,因此證實(shí)在B4C900存在的條件下,A1501具有更強(qiáng)的固氮能力[34].A1501主要通過(guò)胞內(nèi)固氮酶的復(fù)合物實(shí)現(xiàn)N2還原產(chǎn)氨[39].這些胞內(nèi)固氮酶復(fù)合物主要是由及等基因編碼組成[32,40].為了探究B4C900-A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨量增加的原因,對(duì)不同體系的固氮酶基因表達(dá)進(jìn)行定量PCR檢測(cè).結(jié)果表明(圖2g),在實(shí)驗(yàn)組(A1501+B4C900+(-0.5V))體系中,A1501固氮酶的4個(gè)關(guān)鍵基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度都比對(duì)照組(A1501+(-0.5V))高出4倍以上,這為B4C900-A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨提供了有力證據(jù).

2.3 B4C900提高溶液氧化還原活性

如圖3a、b所示,相比于對(duì)照組(A1501+(-0.5V)),A1501 +(-0.5V)+ B4C900反應(yīng)器中添加的B4C900與A1501有較緊密的結(jié)合,這可能是歸因于B4C900較大的比表面積能夠?yàn)槲⑸锏母患峁┹d體,從而驅(qū)動(dòng)二者之間進(jìn)行電子傳遞與交換.

利用循環(huán)伏安法(CV)進(jìn)一步評(píng)估B4C900添加對(duì)溶液氧化還原活性的影響.圖3c～d為實(shí)驗(yàn)組(A1501 +(-0.5V)+ B4C900)和對(duì)照組(A1501+(-0.5V))溶液樣品在第0d和第14d循環(huán)伏安圖譜和相應(yīng)的CV基線處理圖譜.CV曲線形狀越接近矩形,表明電容性越好[41].由圖4c可知,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,兩個(gè)體系的電容都逐漸增加,且B4C900實(shí)驗(yàn)組的電容大于對(duì)照組.電容計(jì)算結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在第14d時(shí)電容分別為15.39及9.77mF/cm2,這說(shuō)明B4C900的添加可以有效提高電催化體系的氧化還原活性.此外,不同電位的特征峰表征不同的氧化還原活性物質(zhì),其能夠有效介導(dǎo)電子傳遞過(guò)程[42].如圖3d所示,隨著反應(yīng)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都出現(xiàn)了不同的特征峰,且實(shí)驗(yàn)組的特征峰峰值電流明顯比對(duì)照組高.有研究表明,峰值與細(xì)胞表面的氧化還原活性物質(zhì)含量呈正相關(guān)[43].因此,B4C900的添加可促使溶液A1501分泌更多的氧化還原活性物質(zhì),從而驅(qū)動(dòng)固氮產(chǎn)氨過(guò)程.雖然尚不清楚這些氧化還原物質(zhì)如何參與電子轉(zhuǎn)移,但是暗示A1501可通過(guò)不同的電子轉(zhuǎn)移途徑從電極獲取電子.需要指出的是,在體系中加入B4C900后,實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)了新的氧化還原峰(-0.03V(1)和-0.01V(2)),有研究表明該特征峰處的物質(zhì)接近于細(xì)胞色素C-500[20].

圖3 對(duì)照組P. stutzeri A1501+(-0.5V)與實(shí)驗(yàn)組P. stutzeri A1501+B4C900+(-0.5V)生物掃描電鏡圖(SEM)和循環(huán)伏安(CV)表征

a:對(duì)照組的掃描電子顯微鏡圖(內(nèi)插圖為SEM放大圖);b:實(shí)驗(yàn)組的掃描電子顯微鏡圖(內(nèi)插圖為SEM放大圖);c:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的第0d, 第14d的CV圖;d:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的第0d、第14d CV基線處理圖

如圖4a所示,未添加B4C900的對(duì)照組(A1501+(-0.5V))分別在1205, 1400, 1457, 1552和1643cm-1處出現(xiàn)5個(gè)紅外吸收峰.1643cm-1的吸收峰可能與細(xì)胞色素中的氨基I或氨基II伸縮振動(dòng)有關(guān)[44].1552cm-1的吸收峰可能是由于酰胺II鍵的C=N伸縮振動(dòng)引起[45].1457和1400cm-1處的吸收峰可能是與多糖有關(guān)的C-OH、C-H2、C-H3變形振動(dòng)和血紅素相關(guān)的O-H變形振動(dòng)引起[46].1205cm-1的信號(hào)主要來(lái)自于核酸[48].與對(duì)照組相比,B4C900的添加導(dǎo)致位于1205cm-1處的特征峰消失,同時(shí),在1737, 1335, 1245和1168cm-1處出現(xiàn)了新的特征峰.隨著電勢(shì)從-0.8V增加到+0.4V,這些特征峰的吸收峰值也隨之變化,證明這些氧化還原基團(tuán)位于A1501生物膜[47].以上結(jié)果表明,在體系中添加B4C900會(huì)使A1501出現(xiàn)更多氧化還原活性基團(tuán),這可能對(duì)促進(jìn)胞外電子傳遞和產(chǎn)氨效率有積極的作用.

利用2DCOS進(jìn)一步分析B4C900的添加對(duì)氧化還原基團(tuán)結(jié)構(gòu)的影響.交叉峰的正負(fù)值不僅可以表征構(gòu)型變化方向的異同,還可以分析不同氧化還原基團(tuán)的變換順序[44].表1列出實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)交叉峰所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)波數(shù)和符號(hào).其中,1737和1643cm-1、1457和1400cm-1、1400和1335cm-1、1245和1168cm-1交叉峰為正,表明構(gòu)型變化方向相同;1552和1457cm-1、1335和1245cm-1交叉峰為負(fù),表明構(gòu)型變化方向相反.根據(jù)Noda’s的規(guī)則,基團(tuán)變化順序?yàn)?羧基C=O伸縮振動(dòng)→酰胺II鍵C=N伸縮振動(dòng)→細(xì)胞細(xì)胞色素中的氨基I或氨基II伸縮振動(dòng)→與磷酸化蛋白相關(guān)的P-O伸縮振動(dòng)→與多糖有關(guān)的C-OH、C-H2、C-H3變形振動(dòng)→與血紅素相關(guān)C-O伸縮振動(dòng)→與血紅素相關(guān)O-H變形振動(dòng)→與脂肪質(zhì)相關(guān)的C-H變形振動(dòng)(表1).

表1 實(shí)驗(yàn)組P. stutzeri A1501+B4C900+(-0.5V) 從- 0.8V到+ 0.4V的2DCOS同步和異步圖分析

注:+/-表示同步圖對(duì)應(yīng)峰的正負(fù); (+)/(-)表示異步圖對(duì)應(yīng)峰的正負(fù).

2.4 B4C900促進(jìn)高活性陰極生物膜形成

陰極生物膜的組成和活性對(duì)電極電子的遠(yuǎn)距離傳輸及利用有著重要影響[14].通過(guò)SEM可以直觀觀察A1501在陰極的成膜狀況.如圖5a、b所示, B4C900的添加能夠有效促進(jìn)A1501在陰極表面的附著,這有利于i A1501直接接收電極電子進(jìn)行產(chǎn)氨.此外,還發(fā)現(xiàn)B4C900的添加能夠驅(qū)動(dòng)A1501在電極表面分泌類(lèi)似于納米導(dǎo)線的物質(zhì),雖然這些物質(zhì)的產(chǎn)生及作用機(jī)制尚未被證實(shí),但值得進(jìn)一步深入研究.為了進(jìn)一步觀察B4C900添加對(duì)A1501生物膜活性的影響,對(duì)運(yùn)行第10d的陰極生物膜進(jìn)行活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示,對(duì)照組(A1501+(-0.5V))電極表面的生物膜主要由死菌組成,這將抑制生物膜中化學(xué)物質(zhì)的傳輸及電極電子的長(zhǎng)距離傳遞[46],從而影響體系的固氮產(chǎn)氨性能.B4C900的添加不僅能夠促進(jìn)電極表面生物膜厚度顯著增加,而且導(dǎo)致活/死細(xì)胞比例也從10.2%提高到了80.6%,這可能是由于陰極生物膜中的B4C900能夠作為導(dǎo)體促進(jìn)電極電子從電極表面?zhèn)鬏斨吝h(yuǎn)離電極的浮游微生物,從而有利于維持電極表面的微環(huán)境(合適的pH值等)[48];此外,B4C900存在能夠?qū)е虏痪鶆蛏锬さ男纬?這有利于降低氣體在生物膜內(nèi)聚集從而影響A1501的活性[49].

微區(qū)掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)是一種新穎的掃描探針技術(shù),可了解電極上不同類(lèi)型的電化學(xué)底物濃度和空間分布狀態(tài),并記錄電流響應(yīng)[50].從圖6c、d中可以看出添加B4C900反應(yīng)器比未添加B4C900的反應(yīng)器出現(xiàn)更多的電流高峰,表明在微米尺度上的電極表面具有更高的氧化還原活性且導(dǎo)電小分子濃度更高[51],其最高電流峰值達(dá)到-0.59mA.以上結(jié)果表明,添加B4C900會(huì)促進(jìn)陰極表面氧化還原活性小分子的生成,這為A1501從電極獲得電子進(jìn)行固氮產(chǎn)氨提供了有力證據(jù).

綜上所述,在反應(yīng)器溶液中,B4C900可以接收電極電子以及傳遞電子(圖7),有效地縮短溶液中電極電子到A1501的距離,且可促使溶液中的A1501分泌更多的氧化還原活性物質(zhì),從而驅(qū)動(dòng)固氮產(chǎn)氨過(guò)程.同時(shí),B4C900的添加能夠有效促進(jìn)A1501在陰極表面的附著,這有利于i A1501接收電極電子進(jìn)行產(chǎn)氨.此外,碳化硼促進(jìn)A1501電催化固氮產(chǎn)氨工藝有效克服了傳統(tǒng)固氮產(chǎn)氨工藝需要高壓條件、且使用高純N2和H2作為載流體等問(wèn)題,并且無(wú)需使用金屬催化劑,從而有效避免金屬離子的排放,在一定程度上減少了環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn).但是該工藝也存在一些問(wèn)題有待改進(jìn).比如:(1)盡管B4C900的添加能夠有效改善該體系的產(chǎn)氨效率,但該工藝的法拉第效率較低,這可能是由于陰極發(fā)生析氫反應(yīng),進(jìn)而與固氮反應(yīng)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系爭(zhēng)奪氫離子,從而降低該體系的固氮產(chǎn)氨效率;(2)所使用的B4C900是在900℃下煅燒而成,較高的溫度限制了該工藝在實(shí)際過(guò)程中的應(yīng)用與推廣.因此,在接下來(lái)的研究中需要對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)一步探索.

圖6 陰極表面的微區(qū)掃描電子顯微鏡圖(SECM)

a: 對(duì)照組A1501+(-0.5V)第0d SECM圖;b: 對(duì)照組第10d SECM圖;c: 實(shí)驗(yàn)組A1501+B4C900+(-0.5V)第0d SECM圖;d: 實(shí)驗(yàn)組第10d SECM圖

圖7 B4C900驅(qū)動(dòng)生物電催化體系固氮產(chǎn)氨的機(jī)理

3 結(jié)論

3.1 B4C可以有效強(qiáng)化A1501介導(dǎo)的電催化體系固氮產(chǎn)氨性能.在0.4g/L投加量條件下, 900 ℃煅燒溫度下制備的B4C(B4C900)的添加促使電催化體系氨的累積量提高117%.

3.2 B4C900表面豐富的活性位點(diǎn)能夠有效促進(jìn)N2吸附與活化,較大的比表面積能夠?yàn)槲⑸锏母患峁┹d體,并且促使溶液中A1501分泌更多的氧化還原活性物質(zhì).

3.3 B4C900的添加可以有效驅(qū)動(dòng)高活性陰極生物膜的形成,它能夠作為導(dǎo)體強(qiáng)化電極電子的長(zhǎng)距離傳遞及利用.本研究結(jié)果為固氮微生物介導(dǎo)的電催化氮還原體系的實(shí)際應(yīng)用提供了新的見(jiàn)解.

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Boron carbide promotes the ammonia production by electrocatalytic nitrogen fixation withA1501.

DONG Guo-wen1,2, CHEN Piao1, REN Guo-ping1, WANG Chao1, JIN Shu-guang3, YE Jie1*, ZHOU Shun-gui1

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Soil Environmental Health and Regulation, College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2.College of Resources and Chemical Engineering, Sanming University, Sanming 365004, China；3.Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)., 2021,41(5)：2449～2458

() A1501was used as a model nitrogen-fixing strain and boron carbide (B4C) was selected as a typical electron transfer carrier to construct an electrocatalytic nitrogen reduction system. The effect of B4C addition on the ammonia production under different conditions was explored. The results showed that B4C significantly enhanced the ammonia production of the electrocatalytic nitrogen reduction system mediated byA1501. With the dosage of 0.4g/L, the addition of B4C (B4C900) prepared at 900 ℃ calcination temperature improved the ammonia yield by 117%. This was because the abundant activation sites on the surface of B4C900promote N2adsorption and activation. In addition, the electrochemical and spectroscopic spectrograms showed that the addition of B4C900not only triggeredA1501 to secrete more redox active substances, but also drove the construction of highly active cathode biofilms, thereby enhancing the long-distance transfer and utilization of electrode electrons.

A1501；B4C；electrocatalysis；biological nitrogen fixation

X172

A

1000-6923(2021)05-2449-10

董國(guó)文(1981-),男,安徽宿松人,副教授,博士,主要從事污染環(huán)境生物修復(fù).發(fā)表論文30余篇.

2020-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41977281)

* 責(zé)任作者, 副教授, jieye@fafu.edu.cn