黃超伯，游朝群△，熊燃華,2，王飛

(1. 中比先進生物醫(yī)學材料國際聯(lián)合實驗室，南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037；2. 根特大學藥學院，根特B-9000，比利時)

石油資源的稀缺和由此導致的石油基材料的逐漸短缺促使當前社會去尋求更多的環(huán)境可持續(xù)性材料資源。其中，可再生材料是一種理想的綠色替代品，可以最大限度地減少廢物的產生[1]。天然多糖是自然界中廣泛存在的一類大分子聚合物，一般由單糖或低聚糖聚合而成，其種類繁多，包括甲殼素及海藻酸、纖維素及其衍生物、淀粉、瓊脂糖、殼聚糖等。天然多糖類聚合物具有結構穩(wěn)定性高、對生物體無毒、生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點[2-4]，在生物體內可實現(xiàn)多種功能化應用，包括機體組成部分[5-7]、能量儲存[8-9]、藥物遞送[10-13]、機體保護[14-15]、蛋白質結構和功能的調控[16-17]、細胞信息傳遞[18]等。隨著學科的交叉融合，天然多糖在生物醫(yī)學領域的應用研究逐漸呈現(xiàn)多元化形式。例如，采用新穎及創(chuàng)造性的方法，利用天然多糖中的木質纖維素材料可有助于生物技術、生物工程和生物經濟的可持續(xù)性發(fā)展[19-21]。該項新技術的應用推廣對于進一步實現(xiàn)天然高分子材料的高值化利用有著重要意義。

1 天然多糖基材料在生物醫(yī)學領域中的傳統(tǒng)應用

在過去的幾十年里，天然多糖由于具有多種保健作用而受到人們越來越多的關注。天然多糖可分為高等植物多糖(如菊糖和果膠)、海洋多糖(如瓊脂、海藻酸、卡拉膠和殼聚糖)和微生物胞外糖(如右旋糖酐、結冷膠、葡聚糖、透明質酸、果聚糖和支鏈淀粉)[22-27]。近年來，以天然多糖材料作為基材在生物醫(yī)學領域進行各種功能化設計已成為科研領域的熱門課題。根據(jù)功能應用的分類，主要應用于包括藥物載體[28-31]、組織工程[32-34]、支架材料[35-36]以及傷口敷料[37-40]等需求缺口較大的領域中。筆者分別介紹各個研究方向的近期代表性研究工作，呈現(xiàn)當前天然多糖基材料在傳統(tǒng)生物醫(yī)學領域中的應用現(xiàn)狀。

1.1 藥物載體

設計控釋系統(tǒng)的目標是提供安全、理想的藥物釋放效果，提高靶向治療的有效性。選用天然多糖作為基材去設計各種藥物緩控釋系統(tǒng)是近年來的研究熱點。盡管纖維素水凝膠被認為是一種很有前途的藥物釋放載體，但其藥物釋放的被動方式和無遠程刺激響應極大地限制了其進一步的應用效果。Lin等[41]報道了一種簡單的單鍋法制備磁性β-環(huán)糊精/纖維素水凝膠珠的方法，該方法在外磁場(EMF)作用下具有快速溶解能力，可遠程控制藥物由被動釋放到逐步釋放。接枝的β-環(huán)糊精使水凝膠具有較高的載藥能力，同時，F(xiàn)e3O4納米粒子的加入通過電磁場誘導三維網絡的快速可逆變形，為藥物的逐步釋放提供了能量。該水凝膠在藥物逐步釋放劑量和速率方面的效率可以通過開關電磁場和調整Fe3O4納米顆粒的含量來進行控制。通過小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3細胞增殖驗證了β-環(huán)糊精/纖維素水凝膠的無毒及生物相容性等優(yōu)點，進一步證實了天然多糖基材料應用于可植入智能藥物遞送載體的可行性。

此外，天然多糖基材料除了具有無毒及生物相容性好等優(yōu)點，基于天然多糖制備的水凝膠同樣具有優(yōu)異的溶脹性能從而在藥物緩釋方面顯示巨大的應用潛力。Lin等[42]以陽離子纖維素納米晶(CNC)和陰離子海藻酸鹽為原料制備了具有雙膜結構的生物相容性水凝膠。該雙膜水凝膠的結構包括外膜由整齊的海藻酸鹽組成，內膜由陽離子CNC和陰離子海藻酸鹽靜電相互作用鞏固。將兩種藥物引入不同的水凝膠膜中，保證了絡合的藥物協(xié)同遞送和不同藥物在兩層膜中的不同釋放行為(外膜藥物快速釋放，內膜藥物延長釋放)。雙膜水凝膠內膜上修飾的改性纖維素納米晶(CCNC)不僅使該新型雙膜結構水凝膠材料具有生物相容性，還可以提供持續(xù)的藥物釋放效果，該設計實現(xiàn)的協(xié)同釋放效應或可能解決生物醫(yī)學應用上的耐藥性問題，突出了天然多糖及材料應用于藥物載體的巨大潛力。

1.2 組織工程

2007年，Bodin等[43]報道了關于納米纖維素在組織工程中的應用，重點研究了細胞黏附介導GRGDS寡肽功能化修飾細菌纖維素納米纖維支架的構建。這些支架在體外增強了人血管內皮細胞的黏附，有望用于血管組織工程。在神經組織工程中，首次發(fā)現(xiàn)神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y在三維細菌納米纖維素(BNC)支架上培養(yǎng)時，有黏附、增殖和向成熟神經元分化的現(xiàn)象，電生理記錄檢測到的功能動作電位顯示了這一現(xiàn)象[44]。Valarmathi等[45]采用靜電紡絲(E-Spin)方法制備了羥基磷灰石/絲纖維/甲基纖維素(HAP/SF/MC)復合材料(圖1)。結果顯示，該電紡復合材料的拉伸強度范圍達到25.39～102.93 MPa，且拉伸強度隨孔隙率(66.24%～90.11%)的增加而增加。體外溶血研究表明，所有的樣品都是非溶血的(<1%)。人成骨細胞增殖結果表明，與未加HAP的SF/MC復合材料相比，表面HAP的存在促進了細胞的黏附、增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性。該研究進一步指出，以質量分數(shù)25%的HAP電紡復合材料制備的SF/MC(質量比為2∶1)在未來的骨科應用中有可能成為一種良好的骨替代品。天然多糖基材料可以互相之間進行復合從而獲得比單一材料更好的力學性能，這些復合材料在組織工程中得到廣泛的應用。

圖1 電紡絲復合材料的制備[45]Fig. 1 Preparation of the electrospun composite

利用生長因子作為生化分子來誘導細胞分化是組織工程中常見的策略。然而，受到與生長因子有關的限制因素，如半衰期短、高有效生理劑量和高成本，促使人們尋找生長因子替代品。Ramos等[46]探索了利用胰島素蛋白作為生化因子，在仿生電紡絲微納米結構支架上幫助肌腱愈合和細胞分化。在該研究中，采用不同體積比例的聚己內酯(PCL)和醋酸纖維素(CA)合成天然共混物制備微納米纖維，以平衡支架在機械強度、親水性和胰島素傳遞等方面的理化性能。結果表明，當PCL和CA的體積比為3∶1時，在促進細胞附著和胰島素固定化方面是最佳的。此外，胰島素固定化纖維基質也顯示骨髓間充質干細胞MSCs的肌腱表型標記表達增加，與胰島素補充培養(yǎng)基的結果類似，表明胰島素生物活性得到了保存。該研究成果突出了天然多糖基功能化支架在肌腱愈合和再生方面有潛在的應用前景。

1.3 支架材料

隨著經濟不斷發(fā)展以及生活質量的提高，人們對生物醫(yī)用材料的需求越來越大，尤其是對關節(jié)、人工牙齒以及心血管等生物醫(yī)用材料的需求量不斷攀升。Nizan等[47]利用冷凍干燥技術成功制備了羥乙基纖維素/聚乙烯醇(HEC/PVA)和羥乙基纖維素/聚乙烯醇/纖維素納米晶(HEC/PVA/CNC)多孔三維支架。結果顯示，將HEC/PVA與CNC結合后，顯示出優(yōu)越的功能，使得平均孔徑從～54.1 μm減小到～33.4 μm；熱研究表明，HEC/PVA/CNC支架的熔點溫度略有升高。此外，實驗結果顯示人SV轉染成骨細胞hFOB能夠在兩種支架上附著和擴散，支持細胞的黏附和增殖。由于天然多糖基材料的生物相容性和生物可降解性，這些新開發(fā)的高孔支架可能為骨組織工程再生提供一種有前途的支架基質。

骨移植是目前臨床的輔助手段。除了傳統(tǒng)的骨移植，還有一種替代方法，即工程骨組織。Aki等[48]利用3D打印技術制備了新型聚乙烯醇/六方氮化硼/細菌纖維素(PVA/hBN/BC)復合材料骨組織支架(圖2)。結果表明，BC的加入降低了支架的抗拉強度，其中PVA/hBN/BC質量分數(shù)比為12∶0.25∶0.5時的斷裂伸長率最高，為93%，且可顯著提高3D支架上的成骨細胞存活率。復合支架上的細胞形態(tài)顯示，細菌纖維素摻雜支架具有黏附性。該研究工作充分表明，多孔結構清晰的細菌纖維素摻雜3D打印支架作為一種適合骨組織工程(BTE)的組織支架具有很大的潛力。

圖2 新型聚乙烯醇(PVA)/六方氮化硼(hBN)/細菌纖維素(BC)復合支架的3D打印示意圖[48]Fig. 2 Schematic diagram of 3D printing of PVA/hexagonal boron nitride/bacterial cellulose composite scaffolds

1.4 傷口敷料

近年來，研究人員對原位快速交聯(lián)水凝膠的制備越來越感興趣，天然多糖分子表面含有大量活性基團可進行功能化修飾，在材料的韌性、強度及疏水性方面都能獲得良好效果，表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。Xu等[49]采用乙烯醚(VE)側鏈在溫和的條件下改性海藻酸鈉(SA)，結合雙交聯(lián)機理制備了一種凝膠性能優(yōu)良的快速交聯(lián)氫鍵水凝膠SA-VE/H2O；基于此機理，在紫外照射下引入巰基烯與二硫蘇糖醇(DTT)發(fā)生點擊化學反應又制備了一種雙交聯(lián)藻酸鹽SA-VE/DTT。實驗結果顯示該水凝膠體系不僅快速凝膠，而且表現(xiàn)出儲能模量高達13 373 Pa和穩(wěn)定性超過1個月等優(yōu)點。兩種水凝膠對小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3均無細胞毒性。此外，在大鼠尾止血實驗中表現(xiàn)出26 s內快速止血行為。天然多糖基水凝膠生物相容性優(yōu)異、溶脹性好、穩(wěn)定性高，在創(chuàng)面敷料中顯示出巨大潛在應用價值。

此外，天然多糖類大分子在傷口護理敷料中的應用也受到越來越多的關注，因為它們具有生物相容性和生物降解性等優(yōu)點。Trevisol等[50]在研究中利用海藻酸鹽和羧甲基纖維素(CMC)制作薄膜作為傷口敷料的應用材料。這些膜分別鑄型為帶有和不帶有雙氯芬酸的單層(ML)和雙層(BL) 結構。結果顯示，雙分子層對負載的藥物分子雙氯芬酸的吸附效率(77.3%)高于單分子層的吸附效率(57.5%)，且兩種膜的形態(tài)結構均質且具有黏性。BLD膜的釋放時間(600 min)比MLD膜的釋放時間(420 min)要慢，這說明無藥層對傳質起到了阻礙作用，降低了爆震效應。該項研究表明，海藻酸鹽和CMC基質有潛力作為藥物傳遞系統(tǒng)應用于傷口敷料。

2 天然多糖基材料在生物醫(yī)學領域中的新型應用

目前，生物基材料的高值化利用是現(xiàn)代林業(yè)發(fā)展的重點內容，憑借自身獨有的無毒、生物相容性好及可生物降解等優(yōu)勢，天然多糖不僅可以在傳統(tǒng)生物醫(yī)學領域大放異彩，還能通過學科交叉跨領域解決技術瓶頸，進一步拓展其應用方向，實現(xiàn)生物質材料的深層次增值增效。筆者以下主要綜述本課題組在細胞共培養(yǎng)、藥品防偽編碼、病毒檢測及仿生自驅動等方面的代表性研究工作，呈現(xiàn)當前天然多糖基材料在生物醫(yī)學領域中的創(chuàng)新性應用研究。

2.1 細胞共培養(yǎng)

目前，有害的有機試劑被用作連續(xù)相的微流體技術導致的細胞毒性仍是一個急需解決的難題。因此，對于微顆粒中三維細胞培養(yǎng)，在無油、無表面活性劑條件下簡單、高通量制備微球是一個理想的策略。Tang等[51]通過微加工技術手段制備芯殼微針頭組件，成功制備一系列木質纖維素基多面異向(MCM) 微球(2～8面各異向微球)；在對 MCM 的形貌、粒徑尺度分布等關鍵性質進行深入研究之后，對木質纖維素聚合物溶液在接收浴中的離子交聯(lián)和不良溶劑固化成球過程進行了系統(tǒng)分析，建立了適用于水相及有機相溶解的木質纖維素基聚合物的新方法。 該研究首次實現(xiàn)了木質纖維素基多尺寸均勻分布(約50～1 400 μm) 的8面各異向微球的可控制備，可應用于細胞封裝。憑借木質纖維素基材料的優(yōu)良特性，所制備的木質纖維素基 MCM 展現(xiàn)出了良好的生物相容性，已被證明可用于8種細胞的3D共培養(yǎng)(圖3)，實現(xiàn)多種細胞的有序組裝和任意編隊，對研究細胞之間的相互作用提供了新思路。

a)負載HepG2細胞的Ca-Alg微球; b)1，4，7 d后Ca-Alg微球的熒光顯微鏡圖像; c)每個微球的細胞簇數(shù); d)1，4，7 d后細胞存活率; e) 1，4，7 d后細胞團簇大小; ***p < 0.001。圖3 一步法制備負載細胞的單面微球[51] Fig. 3 One-step fabrication of the one-faced microspheres carrying cells

2.2 藥品防偽編碼

近年來條形碼引起了廣泛的關注，特別是在醫(yī)學和生物醫(yī)學應用中的多路生物檢測和防偽方面。然而，大多數(shù)條形碼或防偽方法將不可避免地使用化學光引發(fā)劑、交聯(lián)劑、表面活性劑，或美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)未經批準的聚合物，這不利于敏感生物分子或細胞的存在。Tang等[52]提出了一種可實現(xiàn)的氣體剪切方法，通過使用含有不同熒光納米顆粒組合的預凝膠溶液在10面微球中程序化調整每個隔間的顏色，成功制備生成了10面微球條形碼，并對每個隔間的性能進行精確控制(圖4)。在該設計中，采用三原色(紅、綠、藍)獲得多達7種合并熒光色，構成大量編碼信息，能夠有效地實現(xiàn)高通量信息存儲。更重要的是，利用具有生物相容性的海藻酸鈉構建多色微球條形碼，有望推動食品和醫(yī)藥防偽領域的發(fā)展。該研究開辟了利用生物基材料制備藥物編碼防偽體系的新思路，首次將生物基編碼微球應用于藥品防偽這一前沿領域，增加了生物基材料在防偽領域廣闊應用的可能性， 為生物基材料的高值化利用基礎研究奠定了基礎。

圖4 10個面的多分區(qū)微球(a)/記憶微球示意圖(b)[52]Fig. 4 Schematics showing the preparation of 10-faced (a) multicompartmental microspheres and (b) memomicrospheres to store information

2.3 病毒檢測

針對人類免疫缺陷病毒HIV防治過程中的多種局限性，Hua等[53]提出了利用兼具良好生物相容性與 pH 響應型的鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)制備快速響應的纖維素基納米纖維膜的新思路與新方法?；贑AP在結構上超細直徑(納米級)的巨大優(yōu)勢，以及其他諸如高比表面積、高靈敏度和快速響應等優(yōu)點，Hua等[53]利用靜電紡絲工藝制備出了高效負載抗 HIV 藥物(替諾福韋)的超細 pH 響應木質纖維素基納米纖維 (圖5)，測試表明，其對人類精液快速響應，8 s內即完全溶解，快速釋放藥物。該研究建立了利用木質纖維素制備抗 HIV 高靈敏智能響應型木質纖維素基納米纖維的工藝流程，實現(xiàn)了木質纖維素基納米纖維在陰道低 pH 環(huán)境下的結構穩(wěn)定，而少量精液刺激即快速藥物釋放的良好效果。所構建的快速響應型預防 HIV 病毒感染的方法高效簡便，有望在 HIV 防治領域作為新一代的預防產品而得以應用，可產生巨大的社會效益與經濟效益。

a)純CAP纖維的掃描電鏡(SEM)圖像；b) 純PU纖維的SEM圖像；c)PU/CAP同軸纖維的SEM圖像；d)PU/CAP同軸光纖的共具焦圖像(綠色為CAP;紅色為PU);e)PU/CAP同軸纖維的TEM圖像;f)電紡PU/CAP同軸纖維(質量分數(shù)28% PU)、純CAP和純PU纖維的熱重分析;g)分別分散在SVF和PBS中負載羅丹明b的PU/CAP同軸纖維熒光顯微圖像(質量分數(shù)28% PU)。標尺: 50 μm。 圖5 纖維的結構表征[53]Fig. 5 Characterization of the structure of the fibers

2.4 仿生自驅動

受天然微生物游動行為的啟發(fā)，設計開發(fā)人造微/納米馬達模擬這些特征自然生物的行為去實現(xiàn)各種功能化應用越來越受到關注。目前在開發(fā)功能性微型馬達方面盡管投入了大量精力，但是受限于有機溶劑、紫外線照射及細胞毒性試劑的不可避免的使用，將它們應用于生物相關介質受到了很大的阻礙。Tang等[54]采用簡單、靈活、生物相容性和高通量的氣體剪切策略，以具有生物相容性的海藻酸鈉(Na-Alg)構建了仿生自驅動微球(圖6)。通過巧妙設計磁性納米顆粒和過氧化氫酶在多室微球特定腔室中的空間分布，成功實現(xiàn)了自驅動微球的雙重驅動，設計獲得多種復雜運動。該研究首次建立了一系列以生物基材料組成的多功能雙驅動微球，為了確保設計的生物相容性，采用美國FDA批準的生物基材料和生物催化過氧化氫酶或生物相容性Fe3O4納米顆粒為微電機提供推進運動，最大化地實現(xiàn)了驅動微球的生物可相容性。鑒于這種氣體輔助策略制備的自驅動微球可用于裝載兩種或多種不同類型的功能性納米顆粒或酶，這為將來設計其他軟質和生物相容性微馬達提供了相當大的潛力，為自驅動微馬達在生物醫(yī)藥領域的應用提供了更多的可能性。

a)基于四氧化三鐵納米粒子和過氧化氫酶獲得的微球制造Janus微型馬達的示意圖;b)磁石引導的微型馬達圖解和延時拍攝照片; c)微型電機浸在4%H2O2中并由磁鐵引導的原理圖和延時拍攝照片。圖6 仿生自驅動微球[54] Fig. 6 Biomimetic self-driving microspheres

3 展 望

筆者主要綜述了纖維素及其衍生物等常見天然多糖分子在藥物遞送、組織工程、支架材料及傷口敷料等傳統(tǒng)生物醫(yī)學領域方面的研究進展及其通過學科交叉進一步拓展的應用領域，包括在細胞共培養(yǎng)、藥品防偽編碼、病毒檢測及仿生自驅動等新型應用領域的研究進展。開發(fā)具有優(yōu)異結構與性能的新型生物醫(yī)用材料是當今科學界研究的熱點。相對于無機高分子，天然高分子材料的化學組成、分子結構和物理化學性質與生命體更為接近，因此更多地用來制備生物醫(yī)用材料，也一直是當今高分子科學研究的前沿。然而，天然多糖基功能材料在生物醫(yī)學領域的應用目前大部分設計還處于科學研究階段，在臨床轉化前其生物安全性需要得到有效評估。為了增強天然多糖基材料的功能，使其更好地應用于生物醫(yī)學跨領域，未來對天然多糖基材料的研究可以從以下方面進行思考：

1)傳統(tǒng)的材料加工方法不可避免使用化學光引發(fā)劑、交聯(lián)劑、表面活性劑，或FDA未經批準的聚合物等對生物體有毒害的物質，開發(fā)新型綠色無溶劑的材料制備方法是天然多糖基材料應用于生物醫(yī)學領域的關鍵一步。

2)生物基材料的高值化利用是現(xiàn)代林業(yè)發(fā)展的重點內容，可通過學科交叉將天然多糖基材料的應用拓展到病毒檢測、異向材料及人工細胞等新興領域。