張翔，史亞興，盧柏山，武瑩，劉亞，王元東，楊進(jìn)孝，趙久然

北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

0 引言

【研究意義】隨著消費(fèi)水平的提高，香味這一品質(zhì)性狀深受消費(fèi)者的青睞。例如香米，由于其所具有的獨(dú)特香味，表現(xiàn)出更高的商品價(jià)值。玉米是中國(guó)第一大作物，但具有獨(dú)特香味的香型玉米品種或種質(zhì)卻鮮有報(bào)道。因此，香型玉米品種的培育還有待進(jìn)一步加強(qiáng)，發(fā)掘和創(chuàng)制新型優(yōu)質(zhì)香型玉米種質(zhì)資源是其重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2-AP是重要的香味物質(zhì)。已有研究表明，水稻香味基因位于第8染色體上，由1個(gè)隱性基因控制。BRADBURY等[1]研究最先發(fā)現(xiàn)，水稻香味是由編碼甜菜堿脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）的OsBADH2突變引起的。OsBADH2由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，其蛋白包含503個(gè)氨基酸。在香米中，該基因在第7個(gè)外顯子產(chǎn)生了8 bp的缺失和3個(gè)SNP（此基因型被命名為badh2.1）。badh2.1的蛋白發(fā)生提前終止，OsBADH2原有功能喪失[1]。BADH2影響2-AP合成的機(jī)制雖然還沒有得到非常明確的解析，但一般認(rèn)為，OsBADH2正常情況下會(huì)抑制2-AP的合成。這種抑制作用是通過消耗2-AP合成前體γ-氨基丁醛（γ-amino butyraldehyde，GABald）實(shí)現(xiàn)的。OsBADH2可以將 GABald轉(zhuǎn)化為 γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）。當(dāng)OsBADH2無法發(fā)揮正常功能時(shí)，2-AP合成前體GABald發(fā)生積累，從而引起水稻體內(nèi)2-AP的含量增加，使稻米具有香味[2-3]。除了水稻外，在大豆、高粱和黃瓜中，均發(fā)現(xiàn)了BADH2同源基因突變能夠產(chǎn)生的香型品種。香型大豆和黃瓜的BADH2由于SNP導(dǎo)致氨基酸變化[4-6]；香型高粱的BADH2發(fā)生1 444 bp的片段缺失[7]。在明確香味基因的基礎(chǔ)上，科研人員開始利用RNAi方法或基因組編輯技術(shù)抑制水稻BADH2的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)香型種質(zhì)的創(chuàng)制，大大提高了育種效率[8-10]。基因組編輯技術(shù)主要依賴人工內(nèi)切核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs）及一系列功能模塊，在目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行堿基或DNA片段的缺失、插入及堿基替換等操作。繼鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）之后，CRISPR/Cas9核酸酶作為新一代基因編輯技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)，迅速被成功應(yīng)用于動(dòng)物和植物中。DONG等[11]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)玉米Sh2和Wx進(jìn)行同時(shí)敲除，證明此方法可快速育成甜糯玉米品種；SHI等[12]利用CRISPR/Cas9對(duì)玉米內(nèi)源基因ARGOS8的啟動(dòng)子進(jìn)行了編輯，提高了該基因的表達(dá)量，進(jìn)而增加了玉米的耐旱性；ZHANG等[13]利用基因編輯技術(shù)敲除了玉米SD1，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米株高的調(diào)節(jié)；SVITASHEV等[14]通過對(duì)玉米MS26和MS45的定點(diǎn)編輯，快速育成了玉米雄性不育材料。SHAN等[15]利用TALEN技術(shù)定點(diǎn)敲除OsBADH2，使稻米獲得香味性狀，實(shí)現(xiàn)了香米的快速精準(zhǔn)創(chuàng)制。這些成功的基因編輯育種成果，充分證明了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在玉米和水稻定向遺傳改良中的高效性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在玉米中尚未發(fā)現(xiàn)由BADH2突變產(chǎn)生的香型玉米材料。篩選自然變異及傳統(tǒng)的誘變方法存在不可預(yù)期性高、效率低及篩選工作量大等不足?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心自主選育而成的優(yōu)良自交系京 724為研究材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除玉米2個(gè)BADH2同源基因，進(jìn)而獲得2-AP含量顯著升高的雙基因敲除突變株系，為香型玉米品種開發(fā)提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米自交系京 724[16]，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心自主選育而成，為玉米雜交品種京科968的母本。B104自交系由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心保存。

1.2 BADH家族成員進(jìn)化分析

利用Ensembl在線BLAST工具，將水稻OsBADH2（Os08g0424500）蛋白序列與擬南芥、水稻和玉米的蛋白序列庫進(jìn)行比對(duì)。使用Clustal W對(duì)獲得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。從 UniProt數(shù)據(jù)庫獲得OsBADH2蛋白的結(jié)構(gòu)域信息（UniProt ID：Q84LK3），結(jié)合多序列比對(duì)結(jié)果，剔除缺失BADH重要結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。最后，使用MEGA7進(jìn)行進(jìn)化分析。進(jìn)化樹使用Neighbor-joining方法，檢驗(yàn)方法選擇 bootstrap method，重復(fù)1 000次，置換模型選擇poisson model。

1.3 載體構(gòu)建

骨架載體見電子附圖 1，在 WU等[17]報(bào)道的SpCas9n-pBE基礎(chǔ)骨架之上進(jìn)行如下改造：（1）使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ將該骨架的表達(dá)盒1替換成prZmU6-2+tRNA+esgRNA+polyT（此序列由南京金斯瑞公司合成）。序列的兩端分別含有KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，可從合成質(zhì)粒直接酶切獲得該片段；esgRNA前含有2個(gè)相鄰的BsaⅠ酶切位點(diǎn)，后期用于連接靶點(diǎn)序列；（2）使用限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和AscⅠ將表達(dá)盒 2中的 Cas9n&PmCDA1&UGI+t35s替換為Cas9+t35s，其中Cas9以Cas9n為模板，引入堿基突變，將氨基酸10A突變?yōu)?0D；（3）使用限制性內(nèi)切酶AscⅠ和AvrⅡ?qū)⒈磉_(dá)盒3的prZmUbi1+hpt+ t35s替換為 prZmUbi1+PMI+tNos（PMI+tNos由南京金斯瑞公司合成）。載體構(gòu)建所用引物見電子附表1。

利用CRISPR-GE[18]在線工具（http://skl.scau.edu.cn/）進(jìn)行靶點(diǎn)設(shè)計(jì)。單靶點(diǎn)序列使用正反向引物退火、互補(bǔ)結(jié)合，使用T4連接酶連接到經(jīng)BsaⅠ酶切的敲除骨架載體上，獲得最終的CRISPR/Cas9敲除載體，通過測(cè)序驗(yàn)證后用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化。

1.4 轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得

使用構(gòu)建好的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EAH105，使用PMI特異引物PMI-F/PMI-R（電子附表 1）鑒定轉(zhuǎn)化陽性克隆。陽性農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化玉米自交系京724的愈傷組織[19]，用PMI篩選得到的再生組織培養(yǎng)玉米幼苗，即為T0植株。提取 T0植株的基因組DNA，用PMI特異引物PMI-F/PMI-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出1.2 kb目的片段的植株即為T0轉(zhuǎn)基因陽性植株。所有T0轉(zhuǎn)基因陽性植株自交獲得T1種子。

1.5 靶位點(diǎn)突變檢測(cè)

為檢測(cè)靶位點(diǎn)的突變情況，分別在ZmBADH2-1及ZmBADH2-2的靶點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)，對(duì)T0轉(zhuǎn)基因陽性植株基因組 DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。ZmBADH2-1靶點(diǎn)擴(kuò)增引物為BH2-1-F/BH2-1-R；ZmBADH2-2靶點(diǎn)擴(kuò)增引物為 BH2-2-F/BH2-2-R（電子附表 1）。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收后進(jìn)行 Sanger測(cè)序。測(cè)序峰圖在靶點(diǎn)附近位置出現(xiàn)雙峰的植株即為T0突變植株。使用R語言工具TIDE[20]對(duì)測(cè)序峰圖ab1文件進(jìn)行分析，可獲得突變體植株靶點(diǎn)的突變類型（插入/缺失的堿基數(shù)量）；進(jìn)一步使用 CRISPR-GE[18]中的DSDecodeM在線工具和R語言工具sangerseqR[21]可分析獲得突變體植株靶點(diǎn)具體的突變基因型。

1.6 香味物質(zhì)2-AP含量測(cè)定

參照SHAN等[15]研究，分別取野生型對(duì)照京724和基因編輯突變體成熟種子各3 g，水稻品種日本晴和稻花香種子各2 g，碾磨成粉后測(cè)定香味物質(zhì)2-AP含量。以 2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)，每個(gè)材料 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。測(cè)定試驗(yàn)由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所代謝組學(xué)平臺(tái)完成。使用R語言對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，使用LSD進(jìn)行多重比較，Bonferroni法進(jìn)行P值校正。

2 結(jié)果

2.1 玉米基因組中含有2個(gè)BADH2同源基因

使用OsBADH2蛋白序列，與擬南芥、水稻和玉米的蛋白質(zhì)序列庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)所獲得的基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖1），結(jié)果顯示，玉米中有2個(gè)基因與水稻OsBADH2位于同一進(jìn)化分支中，它們是Zm00001d050339和Zm00001d032257，在蛋白序列上分別與OsBADH2有90%和89%的同源性。將這兩個(gè)基因分別命名為ZmBADH2-1（Zm00001d050339）和ZmBADH2-2（Zm00001d032257）。ZmBADH2-1位于第4染色體，由15個(gè)外顯子組成，編碼505個(gè)氨基酸；ZmBADH2-2位于第1染色體，同樣具有15個(gè)外顯子，翻譯后的蛋白含有506個(gè)氨基酸（圖2-A）。通過MaizeGDB（www.maizegdb.org）中的玉米基因表達(dá)數(shù)據(jù)[22-23]，可以查詢到這兩個(gè)基因在玉米不同的組織中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)較高，推測(cè)二者可以影響種子中的2-AP含量。由于ZmBADH2-1和 ZmBADH2-2蛋白序列與 OsBADH2高度同源，且 2個(gè)基因的表達(dá)部位重合，因此，推測(cè)這兩個(gè)基因可能都具有類似 OsBADH2的生物學(xué)功能，存在功能冗余。

2.2 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

基于水稻中的研究得知，香味是隱性性狀。玉米2個(gè) BADH2同源基因可能存在功能冗余，因此，需要將ZmBADH2-1和ZmBADH2-22個(gè)基因同時(shí)敲除，才可能夠獲得香型玉米突變體。根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)的原理，結(jié)合京724中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一條20 bp特異性較好的sgRNA靶點(diǎn)序列 Target1。Target1同時(shí)位于ZmBADH2-1和ZmBADH2-2的第 4個(gè)外顯子上（圖 2-A），含有該sgRNA的 CRISPR/Cas9載體可以同時(shí)在這兩個(gè)基因中引入缺失/插入突變。已有研究表明水稻OsBADH2在第7個(gè)外顯子產(chǎn)生了8 bp的缺失，導(dǎo)致蛋白序列提前終止，基因功能喪失，產(chǎn)生香米[1]。因此，推斷京724中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同時(shí)在第4個(gè)外顯子上產(chǎn)生突變，導(dǎo)致 ZmBADH2s蛋白提前終止或氨基酸缺失，更有可能使得基因功能喪失，進(jìn)而產(chǎn)生香味性狀。

2.3 T0陽性植株目標(biāo)基因靶點(diǎn)序列突變類型分析

將含有目標(biāo) CRISPR/Cas9載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化京 724的愈傷組織，獲得 28株 T0陽性植株。對(duì)ZmBADH2-1和ZmBADH2-2Target1靶點(diǎn)上下游區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果顯示，有10株T0陽性植株中ZmBADH2-1和ZmBADH2-2均發(fā)生突變。在這些突變體中，2個(gè)ZmBADH2s的靶點(diǎn)都發(fā)生了編輯。進(jìn)一步對(duì)測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)突變體的ZmBADH2-1和ZmBADH2-2靶點(diǎn)區(qū)域均產(chǎn)生了雙等位或多等位突變，突變類型包括堿基缺失、堿基插入及堿基替換（圖2-B）。所有這些突變導(dǎo)致ZmBADH-1和ZmBADH-2蛋白序列提前終止或氨基酸缺失等變化（電子附圖2）。

2.4 基因編輯株系香味物質(zhì)2-AP的含量測(cè)定

10個(gè)ZmBADH2-1/ZmBADH2-2共敲除突變體T1種子均表現(xiàn)出嗅覺可辨的明顯香味，暗示T0靶基因突變穩(wěn)定遺傳到T1種子中，且基因功能喪失。隨機(jī)選擇BH02、BH06、BH11和BH13 4個(gè)基因編輯株系的T1種子（電子附圖3），用于進(jìn)一步檢測(cè)種子中2-AP的含量。對(duì)這4個(gè)編輯株系T1植株的靶點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果顯示，T0產(chǎn)生的基因突變穩(wěn)定遺傳至T1代，因此，推測(cè)這些 T0自交獲得的 T1種子中，2個(gè)基因都產(chǎn)生了功能缺失或弱化，籽粒中 2-AP含量升高，產(chǎn)生香味。

為了明確玉米突變體株系 T1種子中是否存在香稻中同樣成分的2-AP，選擇香稻品種稻花香種子作為對(duì)照。由圖3-A可見，稻花香種子中的2-AP可以獲得有效分離，保留時(shí)間約為8.3 min。2-AP質(zhì)譜圖顯示，其分子離子峰m/z111，特征碎片峰m/z68和83等與已有研究結(jié)果一致[24]（圖3-B）。在BH02株系中，同一時(shí)間內(nèi)獲取的質(zhì)譜結(jié)果與稻花香中 2-AP質(zhì)譜圖一致（圖 3-B和圖 3-C），說明玉米ZmBADH2雙基因敲除突變體籽粒中存在與香稻同樣成分的2-AP。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，京724對(duì)照中未檢測(cè)到2-AP，4個(gè)基因編輯株系的2-AP含量均高于京724野生型對(duì)照品種（P＜0.01，圖4）。其中，BH06中的2-AP含量最高，為438.29 μg·kg-1；BH02和BH11次之，分別為404.63和348.65 μg·kg-1（圖4-B）。因此，利用基因編輯技術(shù)使玉米2個(gè)BADH2同源基因發(fā)生突變，可獲得香味性狀改良的玉米種質(zhì)材料。

3 討論

香味是提升作物品質(zhì)的一個(gè)重要性狀，是品質(zhì)改良的重要內(nèi)容之一，具有香味的作物品種深受消費(fèi)者青睞。例如香米的種植及選育，不但歷史悠久，而且成果頗豐，各國(guó)均有香稻種植。著名的香米品種在國(guó)內(nèi)有東北的稻花香，國(guó)外有印度的Basmati、泰國(guó)的茉莉香型香米等[25]。這些香稻品種都具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。香稻的種質(zhì)資源極其豐富，極大地方便了香稻選育。玉米是世界上最重要的食糧之一，現(xiàn)今全世界約有三分之一人口以玉米作為主要食糧。隨著玉米育種及配套加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，玉米的食用品質(zhì)不斷改善，鮮食玉米和新的玉米食品如玉米片、玉米面、玉米渣、速食玉米等產(chǎn)品，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上很受歡迎。如果能在現(xiàn)有玉米品種中加入香味性狀，在滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)玉米相關(guān)產(chǎn)品需求的基礎(chǔ)上，更可以產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)附加值。然而在玉米中卻一直沒有發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特香味的玉米種質(zhì)，也沒有香型玉米品種育成的報(bào)道。基因編輯技術(shù)在水稻、小麥、玉米和大豆等作物中的應(yīng)用[12-13,26-30]，顯示出該技術(shù)在性狀定向遺傳改良方面更加高效。本研究通過基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制出了新的玉米香型材料。與編輯前的材料相比，香型玉米材料種子中2-AP含量明顯提高（圖 4），同時(shí)具有明顯的香味。此突變體材料為香型玉米育種提供了重要的種質(zhì)基礎(chǔ)。

水稻、黃瓜和高粱等物種的BADH2突變，都可以產(chǎn)生相應(yīng)的香型種質(zhì)。通過敲除玉米BADH同源基因可提高香味物質(zhì) 2-AP含量（圖 4），說明玉米中BADH2也是控制香味性狀的關(guān)鍵基因?；谶@些研究結(jié)果，進(jìn)一步推測(cè)該基因影響 2-AP合成的機(jī)制可能在很多單、雙子葉作物中都是類似的。因此，通過基因編輯技術(shù)敲除BADH2同源基因創(chuàng)制香型種質(zhì)的策略可能是通用的，即其他作物，例如小麥中，也同樣有可能創(chuàng)制、培育出新的香型種質(zhì)或品種，進(jìn)而加速香型品種的培育速度。

在水稻等物種中，一個(gè)BADH2突變即可產(chǎn)生香味突變體。而玉米中的情況則有所不同。前期工作中，在玉米自交系B104中獲得ZmBADH2-2的單基因敲除突變體。由于第一外顯子上發(fā)生堿基的插入和缺失，ZmBADH2-2編碼區(qū)序列產(chǎn)生了移碼（電子附圖4-B）。但BH-2-3和BH-2-4這兩個(gè)ZmBADH2-2單基因編輯株系的 T2籽粒，并沒有表現(xiàn)出明顯的嗅覺可辨的香味，也沒有檢測(cè)到2-AP的存在（電子附圖4-C），單獨(dú)敲除ZmBADH2-2未能創(chuàng)制出香味玉米新種質(zhì)。本研究中發(fā)現(xiàn)，在玉米中存在2個(gè)玉米BADH2同源基因（圖 1）。考慮到2個(gè)ZmBADH2s間蛋白同源性非常高（97%），因此推斷ZmBADH2-1單獨(dú)敲除后，能夠產(chǎn)生香味的可能性非常低。但ZmBADH2-1單獨(dú)敲除，究竟是與ZmBADH2-2單獨(dú)敲除一樣無香味產(chǎn)生，還是有香味產(chǎn)生，亦或是ZmBADH2-1發(fā)揮主要作用，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。由于BADH2控制的香味性狀為隱性，如果獲得香型玉米材料，必須2個(gè)玉米BADH2同時(shí)發(fā)生功能缺失突變，且同時(shí)純合，這將大大增加通過常規(guī)手段獲得香型玉米種質(zhì)的難度，這可能也是到目前為止尚未有香味玉米種質(zhì)材料報(bào)道的原因?；诖耍ㄟ^基因編輯技術(shù)對(duì)2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變是獲得香型玉米種質(zhì)的一種高效途徑。

基因突變對(duì)農(nóng)藝性狀的影響對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐來說至關(guān)重要。本研究中，從 T1種子來看，目前并未觀察到ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同時(shí)突變對(duì)玉米種子性狀有不利的影響（電子附圖 3）。為了對(duì)玉米這兩個(gè)基因同時(shí)突變是否影響玉米其他的農(nóng)藝性狀進(jìn)行更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)，后續(xù)需要進(jìn)行1—2代的繁種，并開展較大規(guī)模的田間試驗(yàn)。

CRISPR/Cas9引發(fā)的突變具有一定的隨機(jī)性，對(duì)于一個(gè)特定靶點(diǎn)的編輯會(huì)產(chǎn)生一系列不同的等位突變。同一基因相同靶點(diǎn)的不同突變形式，在性狀表現(xiàn)上可能會(huì)出現(xiàn)一定的差異。SHAN等[15]在香米突變體創(chuàng)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一靶點(diǎn)的3種等位突變間，2-AP含量變化幅度可達(dá)20%—50%。本研究中，2個(gè)ZmBADH2同源基因在 10個(gè)編輯株系中分別獲得了多種不同的突變類型，其中ZmBADH2-1包含有 21種，ZmBADH2-2有18種（圖2），而這些株系間，種子中2-AP的含量也存在顯著差異。BH13的2-AP含量（161.82 μg·kg-1）最低，可能是由于 BH785的ZmBADH2-2中存在一個(gè)缺失3 bp的非移碼突變，部分T1種子ZmBADH2s蛋白功能缺失不完全，或者僅僅是蛋白功能弱化所引起的。后續(xù)的育種過程中，可以進(jìn)一步篩選不同的突變形式，以獲得不同香味梯度、滿足不同需求的基因型組合。此外，未來還可以將香味性狀與甜、糯等性狀進(jìn)行組合，培育出食用品質(zhì)更佳的新型玉米品種。

4 結(jié)論

利用 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可對(duì)玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-22個(gè)香味同源基因進(jìn)行同時(shí)定點(diǎn)突變，雙突變體籽粒中香味物質(zhì) 2-AP含量顯著高于對(duì)照京 724。基因編輯可創(chuàng)制全新的香型玉米種質(zhì)，快速實(shí)現(xiàn)玉米香味性狀的定向改良。